文摘

的目标是。探索高MMP9的表达的影响成纤维细胞的生物学行为。方法。高葡萄糖和hyperhomocysteine被用来诱导MMP9表达在皮肤成纤维细胞。细胞增殖检测由CCK-8流式细胞术和细胞生存能力。ELISA试验用于检测胶原蛋白(羟脯氨酸)的分泌。划痕试验来评估水平迁移的细胞和transwell方法评价垂直迁移的细胞。结果。信使rna和蛋白质MMP9的表达和细胞内蛋白酶活性显著高于处理高葡萄糖和hyperhomocysteine比对照组。同时,s阶段细胞比率,增殖指数,细胞生存能力,胶原蛋白(羟脯氨酸)分泌水平迁移率和垂直迁移细胞的数量减少high-glucose和hyperhomocysteine-treated组。的金属蛋白酶组织抑制剂1 (TIMP1)抑制MMP9的活动,恢复上述生物行为。结论。高MMP9的表达在皮肤成纤维细胞可以诱导文化在高葡萄糖和hyperhomocysteine中,从而抑制细胞生物学行为。由TIMP1禁忌可以逆转。研究结果表明,MMP9阻止糖尿病足溃疡的愈合通过抑制成纤维细胞的生物学行为。

1。介绍

众所周知,糖尿病足溃疡的耐火材料,可能会导致相当大的发病率和死亡率1]。近年来,国内外研究发现,增加基质金属蛋白酶(MMPs)表达式将有助于糖尿病的脆弱性皮肤和糖尿病足溃疡的耐火性,尤其是MMP9 [2,3]。基质金属蛋白酶是参与细胞外基质大分子降解蛋白酶。MMP9是这种日益增长的家庭之一。一个重要机制调节基质金属蛋白酶的活性是通过绑定到家族成员蛋白称为的金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)。我们之前的研究表明,局部皮肤异常MMP9的表达与皮肤损伤。与非糖尿病的老鼠相比,皮肤伤口愈合的过程在糖尿病大鼠慢了下来,与此同时,MMP9水平显著增加,而TIMP1 MMP9的组织抑制剂,减少糖尿病组(4- - - - - -6]。

人们普遍认识到,高水平的MMP9减缓糖尿病足溃疡的治疗过度降解细胞外基质,生长因子,生长因子受体、蛋白及其受体,以及增加伤口的局部炎症反应(7- - - - - -9]。它仍然是未知MMP9能否影响皮肤成纤维细胞的生物学行为,影响伤口愈合。皮肤成纤维细胞在创伤修复发挥了重要的作用。任何能够影响其生物学性质最终会影响伤口愈合。调查MMP9在糖尿病足伤口愈合的机制,大鼠皮肤成纤维细胞培养在高葡萄糖和hyperhomocysteine中10- - - - - -12]。皮肤成纤维细胞的生物学行为的变化观察使用外源性TIMP1之前和之后。

2。方法

2.1。细胞培养和分组

成纤维细胞(美国写明ATCC crl - 1213)在DMEM培养(美国Gibco)含10%胎牛血清(美国Hyclone的边后卫)有限公司₂孵化器(37°C, 5%的公司₂)。24小时后血清剥夺的边后卫(0.5%),成纤维细胞在DMEM培养含有10%的边后卫在三个不同的条件(根据分组)有限公司6小时₂孵化器(37°C, 5%的公司₂)。

分组:(1)正常对照组在DMEM培养含有葡萄糖(5.5更易/ L)。(2)模型组在DMEM培养含有葡萄糖(22.0更易/ L)和同型半胱氨酸(100μmol / L) [10- - - - - -12]。(3)TIMP1集团在DMEM培养含有葡萄糖(22.0更易/ L),同型半胱氨酸(100μmol / L),和TIMP1 (100μg / L, R和D系统,明尼阿波利斯,美国)。

2.2。MMP9水平测定

MMP9 mRNA表达由实时聚合酶链反应(real-time-PCR) [13]。总RNA提取试剂盒(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)细胞。量化MMP9 mRNA水平real-time-PCR, GAPDH是用作内部控制。引物设计的表达载体公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)根据鼠MMP9的序列和GAPDH资源库。老鼠MMP9引物是意义上,5′-TCCAGTAGACAATCCTTGCAATGTG-3′;反义5′-CTCCGTGATTCGAGAACTTCCAATA-3′。老鼠GAPDH引物是意义上,5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′;反义5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。根据指令的执行放大SYBR PrimeScript PCR试剂盒(豆类,京都,日本)。简而言之,SYBR预混料TaqTM交货(2×)10μL, PCR引物(10μ0.4米)μL,反向PCR引物(10μ0.4米)μ0.4 L,火箭参考染料(50×)μ2.0 L, cDNA模板μL被添加到microfuge管连同蒸馏水总量为20.0μl . PCR反应进行480年LightCycler real-time-PCR系统(罗氏、巴塞尔、瑞士),在95°C与变性为30秒,然后40 95°C的周期为5秒之后,伸长60°C,持续20秒。为了确保平等的样本大小,real-time-PCR GADPH是同时执行的。融化曲线进行了分析,以确保扩增的特异性,是量化的产品2^−ΔΔCT方法,MMP9的Ct值之间的差异和相应的价值GADPH在每个样本作为相对MMP9 Ct值。

MMP9蛋白质被ELISA试验测量。年底的细胞培养,收集上清液。Double-antibody三明治ABC-ELISA被用来检测蛋白质MMP9的表达。操作被执行的指令老鼠MMP9酶联免疫试剂盒(Uscn生命科学公司,武汉,中国)。

MMP9蛋白酶活性在细胞培养上清液是由明胶zymography评估(14]。相同整除的从一个相同数量的细胞条件培养基分离使用预制包含明胶酶谱凝胶,根据制造商的协议(广东Chemicalreagent Inc .)、广州、中国)。经过电泳,凝胶在复性缓冲孵化(50更易与L Tris-HCl (pH值7.4),2%(卷/期)特里同x - 100)在室温下30分钟,然后孵化发展中缓冲区(50更易与L Tris-HCl (pH值8.0),2.5 L CaCl更易₂,0.02% (wt /卷)Brij-35) 72 h在37°C。裂解乐队对应MMP9的潜在形式(92 kDa)总活动和可视化分析染色与0.5% (wt /卷)考马斯亮蓝的解决方案。凝胶拍摄,其次是分析使用图像定量5.2软件。

2.3。细胞的增殖

增殖的细胞进行流式细胞术(15]。细胞被收集到专用管流式细胞术和离心机6分钟(2500 r / min),和上层的丢弃。细胞被resuspended 1毫升PBS。300μL细胞悬液的添加到700年μL冰冷的乙醇一滴一滴地,在黑暗中固定在4°C。第二天,悬浮离心10分钟(2500 r / min)和上层的被丢弃。细胞被resuspended再次与500年μL PBS含有核糖核酸酶(100 U /毫升),孵化为30分钟37°C。溴化乙锭(2毫克/毫升)被添加到最后一个50浓度μg / mL和孵化在黑暗中30分钟。细胞周期检测标准程序的流式细胞术,和s阶段细胞率和增殖指数计算在同一时间。S / S阶段细胞比率(G0 / G1 + S + G2 / M);增殖指数(S + G2 / M) / (G0 / G1 + S + G2 / M)。

2.4。细胞的生存能力

细胞的生存能力是评估CCK-8 (Dojindo实验室、熊本、日本)(16]。细胞接种到96孔板的密度2.0 - -3.0×10³细胞为每个。预拌CCK-8和介质(10μL: 100μL)被添加到96孔板,和细胞培养0.5 - 1 h在37°C。A450的值是与3550年获得自动探测器从贝克曼(CA)拉布。

2.5。胶原蛋白(羟脯氨酸)的分泌

胶原蛋白(羟脯氨酸)分泌被ELISA检测。根据指令羟脯氨酸测定鼠羟脯氨酸酶联免疫试剂盒(Xinqidi生物科技有限公司、武汉、中国)。根据A450羟脯氨酸的浓度计算值与3550年获得自动探测器从贝克曼(CA)拉布。

2.6。水平移动的细胞

水平移动被划痕试验评估(17]。细胞培养在6-well板块沿着统治者挠了一个小提示。洗刮伤面积与PBS重复,直到细胞在这一领域被彻底删除。添加目的介质和培养6 h,我们选择五个不同的视野在倒置显微镜下测量细胞之间的距离在0 h和6 h抓挠后,平均水平迁移率。横向迁移率(宽度0 h−宽度6 h) /宽度在0 h×100%。

2.7。垂直迁移的细胞

Transwell被用来评估细胞的垂直迁移(18]。细胞对数生长期目的中含有0.5%的边后卫停牌后常规消化。100年μL细胞悬浮液(/毫升)被添加到参议院,和500年μL目的介质(根据分组)含有10%的边后卫被添加到众议院。16 h的文化之后,参议院被移除,30分钟4%多聚甲醛固定,并与结晶紫染色15分钟。我们选择四个异象随机计数细胞的数量搬到较低的膜在倒置显微镜下,以平均垂直迁移细胞的数量。

2.8。统计分析

数据意味着±SEM。比较是由单向方差分析后跟Student-Newman-Keuls事后分析。数据分析与Microsoft Excel 2003(美国微软公司、西雅图、WA)和SPSS 12.0对Windows(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。统计分析使用三个相同的条件下重复实验的平均结果。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。如果认为重要差异。

3所示。结果

3.1。成纤维细胞细胞模型的建立高MMP9的表达

高葡萄糖和高同型半胱氨酸诱导MMP9表达明显。信使rna和蛋白质表达和蛋白酶活性MMP9在模型组分别为6.05,4.12,和1.62倍,分别高于对照组()。这表明成纤维细胞细胞模型已经成功地创建了高MMP9的表达。当细胞接受TIMP1 (100μg / L), MMP9蛋白酶活动显著下降了70.7% (),而MMP9 mRNA和蛋白表达与模型组相比无统计学差异()(数据1和2)。

3.2。抑制成纤维细胞增殖、生存能力和胶原蛋白分泌高MMP9的表达

成纤维细胞增殖,与对照组相比,生存能力,在模型组和胶原蛋白分泌抑制细胞比例,有29.8%的s阶段扩散指数的18.1%,23.3%的细胞生存能力,68.7%的胶原蛋白分泌(、职责)。和TIMP1治疗后,与模型组相比,抑制减少()(表1)。

3.3。抑制成纤维细胞水平移动的高MMP9的表达

成纤维细胞的水平迁移率模型组()%低于对照组(与抑制率45.0% ()%)。和TIMP1治疗后,水平迁移率()%的价格相比增加了模型组,但未能恢复到对照组水平(职责。)(图3)。

3.4。抑制成纤维细胞垂直迁移的高MMP9的表达

与对照组相比),垂直迁移的细胞在模型组下降了21.4% ()()。和TIMP1治疗后,垂直迁移的细胞()的价格相比增加了模型组,但未能恢复到对照组水平()(图4)。

4所示。讨论

成纤维细胞是主要的皮肤,修复细胞占细胞总数的40%至60%。成纤维细胞的生物效应在伤口愈合(扮演重要角色19]。学者们发现,皮肤成纤维细胞的DNA合成显著减少,而细胞凋亡增加,糖尿病患者,这表明成纤维细胞的增殖抑制糖尿病的病理声明(20.]。对老鼠的研究表明与人类相似的结果(21]。然而,成纤维细胞生物学行为的改变是否与糖尿病的高MMP9的表达仍然是未知的。

为了避免体内复杂的因素,高浓度的葡萄糖和同型半胱氨酸是用来模拟糖尿病皮肤的当地环境(12]。本研究的结果表明,MMP9表达成纤维细胞增加在高葡萄糖和高同型半胱氨酸培养介质。MMP9的表达信使rna、蛋白质含量和蛋白酶活动high-glucose high-homocysteine-treated组是6.05,4.12,和1.62倍,分别高于对照组,表明高MMP9的表达诱导。

同时,s阶段细胞比率,增殖指数和细胞生存能力在high-glucose和high-homocysteine-treated组与对照组相比显著降低。TIMP1治疗后,MMP9 mRNA和蛋白水平的表达没有统计变化,但MMP9的活性蛋白显著抑制,连同s阶段细胞比率的增加,扩散指数和细胞生存能力。这些结果表明,抑制成纤维细胞增殖和生存能力很可能与MMP9的高活动有关。

伤口愈合取决于成纤维细胞增殖,迁移,肉芽组织形成,胶原蛋白分泌,collagen-based疤痕形成,需要许多不同的细胞的参与22]。成纤维细胞是最重要的细胞的胶原蛋白合成(23),扩散和活力的障碍不可避免的负面影响新的胶原蛋白合成和伤口愈合。目前的研究发现,与对照组相比,模型组中羟脯氨酸的含量下降了68.7%。TIMP1治疗后的羟脯氨酸合成增加。结果表明,在糖尿病状态,不仅高蛋白酶活性MMP9增加细胞外基质的降解(24]而且减少了胶原蛋白的合成,因为减少成纤维细胞的数量和活动。因此胶原代谢一直在负平衡和最终会延缓糖尿病伤口的愈合。

成纤维细胞的迁移是另一个生物属性(25]。人们普遍认为之间有正相关MMP9的表达和细胞的迁移行为26,27]。在我们的研究中,它是非常有趣的,水平和垂直迁移能力的成纤维细胞在模型组显著下降。这种现象可能的可能机制如下。首先,高MMP9的表达可能导致过度的基质蛋白降解,这是为了支持成纤维细胞的迁移。我们之前的数据显示,皮肤MMP9的表达水平显著增强糖尿病大鼠伤口愈合期间(4- - - - - -6]。Reiss et al。28]进一步表明,外生MMP9在小鼠模型直接延迟伤口愈合。其次,增加MMP9的活动能够裂开nonmatrix蛋白质(29日),这是至关重要的细胞的迁移30.]。Kyriakides et al。31日)发现,基于抗体的封锁MMP9函数或缺MMP9弱智迁移,和MMP9 reepithelialization率明显推迟基因敲除小鼠与广式相比老鼠。在这项研究中,成纤维细胞的迁移能力模型组降低,这将防止成纤维细胞爬行网站的伤口,发挥他们的作用。因为抑制成纤维细胞增殖、生存能力和胶原蛋白合成,即使他们迁移到伤口的地方,他们仍然不能函数通常它们不能有效增殖构成足够的细胞和他们不能产生足够的细胞外基质和细胞因子,使伤口愈合的正常循环被破坏,这将导致伤口愈合的障碍。

5。结论

在我们之前的研究中,成纤维细胞表现出的upregulation MMP9的高葡萄糖和高同型半胱氨酸孵化(10,11]。本研究进一步证明大鼠真皮成纤维细胞的生物学行为可以通过高水平的抑制MMP9,可以减少和抑制效果TIMP1,从而抑制MMP9的活动。所以我们相信抑制MMP9的活动可能是一个可行的方法加速糖尿病皮肤溃疡的愈合。然而,延迟伤口愈合是一个复杂的过程,和其他的潜在参与MMP与TIMP家庭成员及相关细胞因子仍然需要进一步调查。

不足:目前的研究是进行体外,这项研究的结果仍有待在未来的动物实验进一步证实了。

利益冲突

作者报告没有利益冲突。

作者的贡献

S.-N。雪,c·杨,l . j . Lei燕和协调设计实验和准备。S.-N。雪和D.-Z。林进行研究/学习。j . Lei管理文献搜索并进行统计分析。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金的资助(81070660)和广东省科技项目基金会(2008 a030201012和2009 b091300128)。作者感谢萍朱博士和晓英谢博士他们的贡献研究的一部分。他们感谢陈李红博士和孟任博士论文的评论。