文摘

的哺乳动物直接同源Eny2 Sus1酵母和果蝇E (y) 2、核转录因子,参与基因转录和mRNA出口的几个步骤。我们曾发现Eny2表达变化在小鼠胰岛细胞代谢适应怀孕。因此我们假设的蛋白质有助于胰岛内分泌细胞功能的调节和测试这一假说在老鼠INS-1E胰岛瘤细胞。过度的Eny2没有影响但siRNA-mediated击倒Eny2导致显著增加葡萄糖和exendin-4-induced胰岛素分泌从否则差glucose-responsive INS-1E细胞。胰岛素含量、细胞生存能力和表达水平的几个关键组件的葡萄糖感应保持不变;然而glucose-dependent Eny2击倒后细胞代谢较高。抑制Eny2增强细胞内肠促胰岛素信号下游的阵营。使用特定阵营类似物和通路抑制剂主要涉及PKA和一定程度上的EPAC通路。总之,我们发现了一个潜在的核蛋白质Eny2和胰岛素分泌之间的联系。抑制Eny2导致增加葡萄糖和incretin-induced胰岛素释放差glucose-responsive INS-1E副线。 Whether these findings extend to other experimental conditions or to in vivo physiology needs to be determined in further studies.

1。介绍

糖尿病2型(T2D)通常是由外周胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足引起的胰腺β细胞(1]。后者代表了主要的组合,可能由基因决定的,未能适应增加胰岛素需求和二级β细胞缺陷造成的,例如,glucotoxicity和淀粉样口供2,3]。胰岛素分泌功能受损在糖尿病表现和发展上起着重要的作用[4]。两组抗糖尿病的药物,直接目标β细胞功能目前在临床使用。磺酰脲类药物法案通过glucose-independent关闭K_{三磷酸腺苷}渠道,glucagon-like肽1 (GLP-1)类似物和增强剂增加胰岛素分泌通过GLP-1受体和营地。因为β细胞功能的重要性T2D的发病机理和治疗的分子通路调节胰岛素分泌高利息。

Eny2是个小(12 kD),高度保守的核蛋白质可能是无所不在地表达。其直接同源在酵母和果蝇称为Sus1和E (y) 2,分别。Eny2是一个组件的传奇/ TFTC组蛋白乙酰转移酶作用的复杂的转录激活(5]。也是TREX-2 /美国运通复杂的一部分,介导mRNA出口离原子核(6]。额外的功能包括参与mRNP形成(7和基因组绝缘体的障碍活动8]。Eny2因此被认为是一个耦合因素集mRNA转录、加工、核出口(9]。

我们确定了Eny2的差异表达基因芯片表达谱从怀孕和控制小鼠胰岛细胞(A.L.;未发表)。怀孕与根本性的变化相关联的孕产妇啮齿动物胰腺中的β细胞质量和功能。因此,我们假设Eny2监管角色的胰岛内分泌细胞。在目前的研究中我们测试这个假说在老鼠INS-1E胰岛瘤细胞。

2。材料和方法

2.1。胰岛细胞分离

确认Eny2-expression胰岛,从C57Bl / 6小鼠胰岛(查尔斯河实验室)被胶原酶消化分离胰腺和选择手工采摘下立体镜如前所述[10),其次是RNA提取和rtPCR。

2.2。细胞培养、过度和Eny2击倒

INS-1E细胞(段落,78 - 92年)(11]是一个慷慨的礼物从Maechler Wollheim(日内瓦)和培养在37°C和5%的公司₂在湿润的气氛中RPMI 1640媒体(含11日1更易与l葡萄糖(PAA))补充heat-inactivated 5%胎牛血清(PAA), 100国际单位/毫升青霉素(PAA), 100年μg / mL链霉素(PAA),消息灵通的10毫米,1毫米丙酮酸钠(PAA),和50μ米β巯基乙醇(Sigma-Aldrich)。细胞被胰蛋白酶化通道每5 - 7天。

瞬态超表达的鼠标Eny2是pcDNA3表达载体,包含鼠标Eny2-ORF CMV-promotor的控制。烤肉效应+转染试剂(罗斯)使用后,制造商的协议。总之,INS-1细胞被播种在24-well文化板块的密度1.5×10⁵细胞/好,转染后1小时内播种,不需抗生素的培养基和转染试剂和补充控制向量(pcDNA3)或pcDNA3-Eny2 / pcDNA3-Eny2-HA。转染媒体取代正常培养基后24小时。

击倒内生Eny2蛋白质,瞬时转染Eny2-specific核(消声器选择;Ambion)进行使用Lipofectamin RNAi马克斯(表达载体)制造商的反向转染后协议。INS-1E细胞被播种在24-well文化板块的密度1.5×10⁵cell /。井中完全培养基没有抗生素与控制或预拌Eny2-specific siRNA / Lipofectamin复合物(100 nM siRNA 1 5μL Lipofectamin)。细胞被培养,无需更换任何进一步的媒体直到化验。72 - 96小时有效的信使rna抑制rtPCR证实了。核序列如下:GCGAUUAACCAAAAGUUAA (Eny2-siRNA1) AAAGGACUAGAACACGUUA (Eny2-siRNA3) AAUUGUUCGACUUUCUUGG(控制)。

2.3。RNA隔离和半定量rtPCR

总RNA被孤立RNeasy迷你工具结合DNA从试剂盒获得删除列。互补脱氧核糖核酸是synthsized从总RNA益生元(dT)引物和ImProm-II逆转录系统(Promega)。与标记PCR半定量rtPCR完成核心装备(试剂盒)和GAPDH,还有,正常化和β肌动蛋白。负控制(rt)是对所有反应和PCR产物测序证实他们正确的身份。必要的最小周期数确定为每个扩增子来实现一个可靠的半定量的放大。引物序列CTGTTGATGACTTGGTGGC和TTCAGCCACCAAGTCATCAA-3′为Eny2(鼠标),CTTAGGTGCCCGAGCTACTG和TTGCTAACCACCATCACCGC Eny2(老鼠),AACTTTGGCATTGTGGAAGG和ACACATTGGGGGTAGGAACA GAPDH(鼠标),GGCATTGCTCTCAATGACA和TGTGAGGGAGATGCTCAGT GAPDH(老鼠),CACCTTTGTGGTCCTCACC和CCAGTTGGTAGAGGGAGCA胰岛素1(老鼠),AATTTCATCATCGCCCTCTG和GTCTCTGATGACCCCAGGAA Glut2(老鼠),TCAGGACTTGCACTTTCACG和ACTCTCCTGGGGTCTGGTCT葡糖激酶(老鼠),CCTGGAGGCCATTGTAGAAA和GGACATTGTTGCTGATGGTG phosphofructokinas(老鼠),还有GTGTGTGGTCTTTGGGAAGG和TACAGGGTATTGCGAGCAGA(老鼠),AGCCATGTACGTAGCCATCC, GCTGTGGTGGTGAAGCTGTAβ肌动蛋白(老鼠)。

2.4。测量的胰岛素分泌和胰岛素含量

转染后时期(72 h超表达实验;72 - 96 h siRNA-mediated击倒)INS-1E细胞被洗两次Krebs-Ringer-Bicarbonate-Hepes缓冲区(KRBH;135毫米氯化钠,氯化钾3.6毫米,1.5毫米CaCl₂0.5毫米,不₂阿宝₄,0.5毫米MgCl₂,5毫米NaHCO₃10毫米玫瑰)缓冲区包含0.1% BSA和preincubated在37°C与同一个缓冲区30分钟。随后,细胞培养另一个30分钟0 5毫升KRBH缓冲补充0.1% BSA,不同葡萄糖浓度,和其他促分泌素,表明图传说(甲苯磺丁脲(σ);Byetta exendin-4(莉莉);Forskolin(σ),8 - (4-chlorophenylthio) 2′-O-methyladenosine-3′, 5′环一磷酸和N6-benzyladenosine-3′, 5′环一磷酸(Biolog生命科学),h - 89 (Calbiochem))。上层清液的测量收集分泌胰岛素。连接细胞提取溶解缓冲区(Triton x - 100年50 mM消息灵通的,0.1%,1毫米德勤,1 x蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏))来确定蛋白和胰岛素含量。胰岛素是由ELISA化验(微孔;Linco)后,制造商的协议。

2.5。Glucose-Dependent MTT-Assay

葡萄糖代谢评估了MTT (C, N-diphenyl-N′4, 5-dimethyl thiazol 2 yl型溴化四唑)分析,衡量cytoplasmatic减少等价物产生的糖酵解和线粒体氧化12]。

INS-1E细胞reverse-transfected炒或针对核和播种在24-well文化板块。72 - 96 h转染后细胞被洗和preincubated glucose-free KRBH缓冲区在37°C为30分钟。随后,细胞被洗又为另一个30分钟内孵化37°C与0,5毫升KRBH缓冲补充不同葡萄糖浓度和MTT试剂(0.5毫克/毫升)。产生的增溶甲瓒晶体,KRBH缓冲取代1毫升10%异丙醇/ dmso的解决方案。甲瓒的吸光度,然后用光度计测量在550 nm(埃普多夫)。

2.6。评估细胞增殖/可行性

小干扰rna转染后孵化时间为72 h, INS-1E细胞,播种24-well文化板块与MTT-reagent孵化(0、5毫克/毫升)没有任何进一步的媒体替代。后的潜伏期1 5 h肝癌和媒体解决方案取代异丙醇/ 10% DMSO和5分钟后产生甲瓒的吸光度测量在550海里。

2.7。营分析

测量的阵营的形成,INS-1E细胞处理核,播种在24-well盘子和培养72 - 96 h。细胞被洗两次KRBH缓冲区,preincubated相同的缓冲区在37°C为30分钟,清洗之后再次孵化为0.5毫升KRBH缓冲区包含16.7毫米有或没有不同浓度的葡萄糖exendin-4和100年μM IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine(σ))。营提取5 - 15分钟后通过添加0.1 mol / l盐酸/ 0.5% Triton x - 100细胞。在600 g离心步骤后10分钟,营地的水平测量上层清液通过竞争阵营ELISA(热科学)。

2.8。统计分析

所有结果都表示为平均值±标准偏差。未配对的以及用于比较2的实验条件。3个以上条件的单向方差分析之后,后续测试使用选定的比较(Bonferroni方法)。

3所示。结果

3.1。Eny2 mRNA表达小鼠胰岛细胞和大鼠胰岛瘤细胞:抑制核

我们的实验开始从微阵列表达分析实验相比C57BL / 6小岛从12.5天怀孕和控制女性(A.L.;未发表)。ENY2显著调节12.5天当β细胞增殖是最高水平的适应产妇怀孕胰腺。

我们下一个证实Eny2 mRNA的表达在C57Bl / 6小鼠胰岛用rtPCR和老鼠INS-1E胰岛瘤细胞(11)(图1(一))。INS-1E细胞功能研究中使用。我们首先测试了几个Eny2-specific siRNAs高效基因可拆卸的细胞系。因为没有抗体对哺乳动物Eny2是可用的,我们检查了Eny2表情mRNA水平。siRNAs 1和3抑制Eny2 mRNA(图72 - 96小时后1 (b)),用于进一步的实验。

3.2。Eny2击倒导致分子增加胰岛素分泌(GSIS)否则INS-1E无功能细胞

测试如果Eny2影响胰岛素生产细胞的功能我们为鼠标Eny2首先构造一个表达载体。(老鼠和老鼠Eny2的蛋白质序列是相同的)。没有改变葡萄糖和exendin-4-induced观察胰岛素分泌瞬态超表达后鼠标Eny2(图2(一个))。不过,这些实验过程中我们发现INS-1E细胞相比,我们的实验室已经开发了一种低的血糖反应原INS-1E线1.7 -与4.3倍(11,图]。不过我们也表现的Eny2击倒这些细胞gene-specific siRNAs使用两个测试和有效。我们比较分子击倒的胰岛素分泌细胞的细胞处理紧急控制核。胰岛素分泌是增强与Eny2-specific siRNAs glucose-dependent方式(图2 (b))。刺激胰岛素分泌葡萄糖从2.8毫米到16.7毫米是核1(从1.9倍pg /μg蛋白* 30分钟pg /μg蛋白* 30分钟;)和核3(从2.7倍pg /μg蛋白* 30分钟pg /μg蛋白* 30分钟;)。

3.3。胰岛素含量、细胞增殖和关键部件的葡萄糖传感Eny2抑制后不变

检查的机制增加GSIS Eny2击倒后,我们首先测量细胞胰岛素含量,不变(图3(一个))。细胞增殖也不会受Eny2抑制的影响。72小时后播种相同数量的每好INS-1E细胞和转染Eny2-specific siRNA或控制,细胞生存能力相当(图3 (b))。细胞蛋白质含量也同样不变(数据没有显示)。我们接下来研究了胰岛素的表达水平,转录因子pdx1,几个关键组件的葡萄糖传感(使用半定量rtPCR Glut2,葡糖激酶、磷酸果糖激酶)。GAPDH,还有和beta-actin被用作控制。没有任何的基因的表达水平的变化是观察(图3 (c))。

3.4。Eny2击倒导致更高的Glucose-Dependent代谢活动

GSIS从胰腺β细胞葡萄糖代谢(耦合13]。因此我们想测试Eny2击倒是否影响细胞的代谢活动。糖酵解产生丙酮酸生产,进入线粒体,并进一步代谢三羧酸(TCA)循环。这导致的生产减少等价物NADH和FADH₂(13]。我们使用了一个MTT试验来测量glucose-dependent生产减少等价物,从而间接地量化细胞葡萄糖代谢(12,14]。我们发现肝癌和降低血糖浓度的增加而增加(2 8到16 7更易/ l)的控制和Eny2-knockdown细胞,但这增加的程度明显高于Eny2抑制(图3 (d))。7更易增加exendin-4 16日/ l葡萄糖减少肝癌和两组没有显著改变。我们还测试了对磺酰脲类促分泌素甲苯磺丁脲。对甲苯磺丁脲的反应是最小的控制细胞但显然存在于细胞Eny2抑制(图3 (e))。自tolbutamide-induced胰岛素分泌不直接依赖葡萄糖代谢,这一发现表明额外的变化Eny2击倒细胞有助于调节胰岛素分泌的增加。

3.5。Eny2抑制增强Incretin-Mediated胰岛素分泌的下游阵营

肠促胰岛素信号通过glucagon-like肽1 (GLP-1)和胃insulinotropic肽(GIP)是体内胰岛素分泌的核心生理调节剂(15]。因此,我们测试了抑制Eny2也会影响这个途径。Eny2核和控制转染细胞被刺激与50 nmol / l exendin-4除了16日7更易与葡萄糖/ l。在这个实验中抑制Eny2增加了exendin-4诱导胰岛素分泌增加,无论是在绝对(图4(一))和相对而言(图4 (b))。类似的效果与腺苷酸环化酶激活forskolin(图实现4 (c))。进一步评估机制Eny2影响肠促胰岛素信号与exendin-4我们测量细胞刺激后营水平。剂量反应曲线5分钟后刺激和营地的时间课程没有受到Eny2击倒(数据积累4 (d)- - - - - -4 (f))。这表明Eny2抑制作用的下游阵营。

3.6。Eny2击倒施加其影响肠促胰岛素信号主要是通过调制的PKA EPAC信号和一定程度上的

营地在β细胞信号主要是通过两条途径传播,蛋白激酶A (PKA)和EPAC通路16]。专门调查是否Eny2抑制影响这两个途径之一exendin-4刺激后我们首先比较胰岛素分泌和没有PKA抑制剂h - 89。h - 89年减少的影响exendin-4刺激Eny2击倒细胞约80%(图5(一个))。我们还测试了特定催化剂EPAC PKA, 8-CPT-Me-cAMP, N6-Bnz-cAMP forskolin(数据进行对比5 (b)和5 (c))。在这个实验中,EPAC激活诱导的胰岛素释放少量增加Eny2击倒但不是在控制细胞。这种效应并不显著的胰岛素的绝对价值。然而,当相对增加了16、7毫米葡萄糖仅进行了分析,EPAC活化剂的作用明显大于细胞后Eny2抑制比在控制细胞(图5 (c))。激活胰岛素分泌的PKA活化剂N6-Bnz-cAMP显著增强在Eny2击倒控制细胞相比,无论是在绝对胰岛素值和相对于仅16.7毫米的葡萄糖(数字5 (b)和5 (c))。

4所示。讨论

在这项研究中,我们表明,蛋白质的击倒Eny2结果在葡萄糖和incretin-stimulated胰岛素分泌增加基线差响应INS-1E胰岛瘤细胞。Eny2是一个多功能的核转录因子,参与基因转录的起始,离原子核mRNP形成,信使rna出口(9]。它参与不同的核内蛋白复合物5- - - - - -8),被描述为一个耦合的因素,帮助连接基因转录和mRNA运输(9]。似乎逻辑,抑制蛋白质破坏细胞功能;然而,至少在小干扰rna转染瞬态超过72 - 96小时,没有完全抑制Eny2信使rna,这不是在我们的研究中。我们的结果有两个Eny2-specific siRNAs确认活动和炒siRNA控制是用于实验。因此,我们相信脱靶效应可以被排除在外。最好的结果的siRNA只有部分抑制活动。这表明一个理想水平的Eny2存在有效调节胰岛素分泌和功能INS-1E不良细胞可能积累过量的蛋白质。

我们表明,Eny2抑制导致更高的细胞减少glucose-dependent生产等价物。这可以部分解释观察到的增加GSIS [13]。然而我们的结果与glucose-independent促分泌素甲糖宁建议额外的细胞机制。对我们的数据表明,肠促胰岛素信号Eny2抑制下游的阵营,主要通过PKA通过EPAC途径和在一个较小的程度上。然而,我们还没有确定的确切分子机制。

INS-1E细胞在我们的实验室是葡萄糖响应性明显低于父母INS-1E线(11]。的细微差别文化条件或葡萄糖响应性差的优先增长INS-1E积累可能是负责任的。我们的结果是否可以被复制在功能齐全的INS-1E细胞需要的额外研究决定。

在几个方面我们的研究结果与以前的研究结果相比,积累Ins-1细胞葡萄糖反应的不同(17]。丙酮酸循环通路被发现与GSIS不同克隆(18]。这些代谢途径导致cytoplasmatic NADPH的积累,这是在良好的协议与我们的测量减少等价物MTT试验(12,14]。在另一份报告杨等人发现增强PKA信号与葡萄糖和forskolin-induced胰岛素分泌增加在同一Ins-1不同等级(19]。这也是在我们的INS-1E Eny2击倒后细胞。

我们的研究有三个主要的局限性:首先,我们使用了一个体外系统和克隆细胞株,因此只能猜测我们的发现体内的相关性。第二,没有抗体哺乳动物Eny2目前可用。因此,我们不得不依靠mRNA测量量化Eny2表达式。第三,建立之间的知识差距仍然Eny2核函数和镇压我们观察到的细胞表型。由于多个角色Eny2这种差距无法轻易关闭。转录组、蛋白质组学、功能筛选的siRNA图书馆将是合理的起点。

5。结论

我们确定了一个意想不到的联系核蛋白质Eny2和胰岛素分泌缺乏glucose-responsive INS-1E副线。抑制Eny2结果增加了这些细胞的葡萄糖和incretin-induced胰岛素释放。是否这些发现扩展到其它实验条件或体内生理需要在进一步的研究确定。

确认

本文作者感谢a . Tufman批判性审查。这项工作是支持由德意志Forschungsgemeinschaft (LE1302/4-1)和欧洲糖尿病研究基金会(EFSD) - a·莱希的基本研究项目。