文摘
线粒体功能障碍被认为是一个关键组成部分,胰岛素抵抗和代谢疾病有关。Psammomys obesus营养糖尿病的相关模型,因为这些成年动物表现出胰岛素抵抗状态,当美联储一个标准实验室chow hypercaloric相比他们的天然食品。在这种情况下,改变生物能学进行了研究。使用从这些这样的饮食喂养的大鼠肝线粒体分离18周,耗氧率、呼吸活动复合物,在细胞色素和内容审查。水平的丙二醛(MDA)和gluthatione(谷胱甘肽)以组织匀浆。糖尿病Psammomys显示肝脏严重恶化(肝质量吸积,脂质积累),伴随着一个增强氧化应激(MDA增加,谷胱甘肽耗竭)。另一方面,ADP-dependent和非耦合的呼吸大大降低控制以下值,和细胞色素的呼吸通量oxydase轻度降低。此外,一个抑制复合物和三世一起激活复杂的二世被发现。与氧化应激的出现,可能与氧化磷酸化的缺陷,一些分子调整可能有助于缓解,至少在某种程度上,胰岛素抵抗的有害的结果在这沙鼠物种。
1。介绍
2型糖尿病(T2DM)病人体内的病理生理学是多样且非常复杂但2型糖尿病与肥胖和缺乏运动协会表明潜在的致病性燃料内稳态之间的联系,出现胰岛素抵抗,和疾病进展。鉴于能源生产的核心作用线粒体,线粒体功能特异表达在细胞层次会影响全身的新陈代谢。三个主要的球员被认为是参与这样一个无序上下文:肝细胞,组织胰岛素依赖型(骨骼肌、脂肪),和β肽。证据指向缺陷线粒体氧化能力这些细胞类型表明,它们有助于葡萄糖不平衡(1]。然而,性质、来源和程度的功能障碍依然存在争议。减少氧化磷酸化基因的表达在人类肌肉和脂肪组织与2型糖尿病(2),而其他研究报告增加肝脏线粒体的呼吸强度Goto-Kakizaki(门将)大鼠糖尿病啮齿动物模型(3),或糖尿病患者4]。在任何情况下,重要的是要认识到线粒体异常可能加剧高血糖一旦到位,导致胰岛素抵抗糖尿病状态的恶化。
由于其战略地位,肠道床和体循环,肝脏被视为缓冲器官的代谢通量的规定(5,6]。葡萄糖和脂肪酸的新陈代谢在很大程度上依赖于细胞内线粒体生成能量,任何在营养物质氧化损伤,连同线粒体含量减少,从而可以建立一个恶性循环的代谢改变参与二型糖尿病的发病机制,导致增加自由基的生成。氧化应激被公认为许多病理过程,和一些作品指向高血糖症的作用在促进生产过剩的mitochondria-derived活性氧(ROS) (7]。另一方面,氧化应激可能还由于血浆中抗氧化能力的降低和糖尿病的细胞内科目。事实上,尽管更不确定的数据,各种报告表明,肝脏谷胱甘肽(GSH)的浓度减少减少糖尿病的不同的啮齿动物模型(8,9]。
几个啮齿动物模型被用来研究代谢综合征的发病机制,但他们并没有充分反映出人类疾病。Psammomys obesus沙漠沙鼠物种,能够依靠嗜盐的plants-based hypocaloric饮食。然而,在一个相对较高的能源方案,如标准实验室饮食,这沙鼠发展2型糖尿病10,11]。事实上,从这个外源性葡萄糖的潜在毒性来源(高但正常如果Wistar鼠相比)将大幅放大,导致疾病的快速发展。有趣的是,预防高血糖的状态与肝胰岛素敏感性的增强在diabetes-prone被发现Psammomys obesus运动训练后(12]。通过这个特殊的行为,这种啮齿动物代表一个适当的生物工具发现糖尿病的营养特性。此外,前一个实验的perifused肝细胞Psammomys报道耗氧率小于测量从Wistar鼠。,ATP和ADP水平明显低于这些沙鼠13]。
鉴于以上考虑,目前的工作的目的是监测并行diabetes-prone线粒体功能和氧化损伤Psammomys obesus,通过测量呼吸强度与电子传递链复合物活动以及一些治疗18周后氧化压力参数。
2。材料和方法
2.1。动物和饮食
阿尔及利亚沙鼠Psammomys obesus用于此调查被安置在控制的温度和光线条件下合适的笼子里。成年动物的两性(80 - 100 g)分为两组:对照组消耗他们的植物(Salsola-foetida -)基于天然食品,低能量饮食(20千卡/天),但丰富的水和矿物质和美联储组高热值的标准实验室饮食(32.5千卡/天)。食物和水是在18周提供。每只动物的体重和血糖监测来选择Psammomys有一个glycaemia优于100 mg / dL。所有实验程序是动物保健委员会授权的机构。
2.2。生物化学分析
禁食Psammomys老鼠被颈椎脱位的治疗,没有麻醉,以避免任何进一步的压力,并在EDTA管收集血液样本。血浆葡萄糖和脂肪(甘油三酯、总胆固醇、脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白),肝和肾功能标记(丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、肌酐、尿素)分光光度法测定的改编在Cobas米拉自动分析仪。血浆胰岛素是由放射免疫检定法。提取肝总脂质早些时候使用过程描述(14),他们重量分析地测量。
2.3。氧化应激评估
血浆总抗氧化状态(助教)在血液样本分析,使用商业套装(草毒死实验室有限公司、英国)。这个试验的原理是基于过氧化物酶的反应和H2O2与衬底azinodiethyl-benzothiazoline磺酸(abt)产生稳定的自由基阳离子蓝颜色检测到600海里。抗氧化能力成反比这颜色强度表示为更易/ L。
从肝匀浆脂质过氧化作用估计通过测量水平的丙二醛(MDA)通过硫代巴比土酸活性物质的方法15]。
肝脏谷胱甘肽含量化验使用商用设备(开曼化学公司),基于thiol-specific试剂的反应dithionitrobenzoic酸(DTNB)。在这个过程中,谷胱甘肽的巯基与DTNB反应生成的产品减少谷胱甘肽还原酶回收谷胱甘肽和生产更多thionitro-benzoic酸(TNB)。TNB产量的直接正比于谷胱甘肽水平,表示为μ摩尔/毫克的蛋白质。
肝样品的蛋白质含量是决定根据洛瑞法(16),使用牛血清白蛋白(BSA)解决方案作为一个标准。
2.4。线粒体隔离
肝脏线粒体两Psammomys根据标准的差速离心组准备过程中,与所有步骤在4°C。杀死动物后,肝脏被迅速切除,洗净,切碎成绝缘介质(250毫米蔗糖20毫米Tris-HCl 1毫米EGTA, pH值7.4)。匀浆是离心机在800克10分钟去除细胞核和细胞碎片。线粒体得到的上层清液通过旋转两次10分钟,8000克和0.5毫升的颗粒是resuspended隔离缓冲区,然后保存在冰。测量蛋白质浓度如上所述,决赛后线粒体悬浮液立即用于呼吸或储存在-80°C到酶分析。
2.5。氧化磷酸化的测量
线粒体呼吸polarographically记录,使用密封oxygraphy室配备了克拉克氧电极和磁力搅拌。耗氧率(JO2在37°C)测定呼吸缓冲区(125毫米氯化钾、20毫米Tris-HCl EGTA 1毫米,5毫米π)与FFA-BSA避免非耦合线粒体的存在。non-phosphorylating状态2是由谷氨酸5毫米/ 2.5毫米的苹果酸(G / M)苹果酸或琥珀酸5毫米/ 0.5毫米(S / M)在1.25μ米鱼藤酮。磷酸化状态3后获得的1毫米ADP虽然状态4测量为1.25μg / mL寡霉素,特定的ATP合酶抑制剂。非耦合呼吸,75μ米二硝基酚(DNP)补充说,细胞色素c氧化酶活性间接评估1毫米TMPD抗坏血酸盐/ 5毫米。氧化磷酸化效率评估状态3-to-state 4比,也称为呼吸控制指数(RCR)。
2.6。电子传递链活性和细胞色素含量
呼吸活动复合物通过轻微的化验的变化描述的协议Malgat et al .,使用肝线粒体粒子从冻融循环产生的17]。复杂我化验NADH氧化的速率在340 nm 50 mM KPi缓冲含3.75毫克/毫升BSA, 100μdecylubiquinone, 100μM NADH。鱼藤酮(10μ米)是专门用来抑制这种复杂的推导了实际活动从区别NADH氧化和鱼藤酮。复杂的二世是测量的速度2,6-dichloro-indophenol (DCIP)减少在50 mM 600海里KPi缓冲补充2.5毫克/毫升BSA, 9.3μM抗霉素A, 5μ鱼藤酮,100μM DCIP,琥珀酸30毫米。酶活性计算之间的差异之前和之后的50μM decylubiquinone。复杂三世被测量细胞色素c的减少化验在550海里,有或没有9.1μM抗霉素a孤立线粒体在100毫米KPi孵化中1毫克/毫升BSA 50μ100年M EDTA, 1毫米KCNμM氧化细胞色素c,反应是由105.6μM decylubiquinol。
同时,电子传递链的内容在不同的细胞色素被双波长分光光度法测量,比较完全氧化和完全的光谱减少细胞色素(18]。
2.7。统计分析
所有数据被报道为±SEM。两种大鼠组之间的区别取决于学生的t测试,P值< 0.05,< 0.01或< 0.001视为具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。长期代谢影响的高热量饮食和对肝脏氧化还原状态的影响
Psammomys老鼠喂食高热量食物18周了代谢综合征,与他们的体重显著变化(P< 0.05),血糖(P< 0.01),胰岛素血症(P< 0.001)与对照组相比(表1)。血浆脂质水平,特别是triglyceridemia胆醇血症,也改变了。此外,糖尿病Psammomys表现出严重的肝脏恶化,转氨酶活性的大幅增加(即可见一斑P< 0.05),肝质量吸积一起组织triglyce-rides积累。肾损伤,表现为尿毒症和creatininemia,除了显示。另一方面,这种有害的条件明显降低血浆抗氧化能力(图1),而脂质过氧化指标同时增加(图1)。此外,肝脏谷胱甘肽的耗竭被发现(图1),肝脏中产生的氧化应激状态,如谷胱甘肽(GSSG比率,在很大程度上减少hypercaloric饮食(1.07±0.82和4.29±0.69为控制动物,P< 0.01)。
(一)
(b)
(c)
3.2。耗氧量
与线粒体与糖尿病Psammomys肝脏,我们注意到一个净减少呼吸链的活动(图2)。的确,基底状态2和ADP-stimulated状态3 G / M上的显著降低在线粒体呼吸(24和−−31%,职责。)但几乎减少了S / M +鱼藤酮(8和−−7.5%,职责。)。oligomycin-induced状态4的评估显示无论基质进行任何修改。这些值导致减少RCR(状态3-to-state 4比)对线粒体只有精力充沛和G / M(表2)。抑制DNP-uncoupled或TMPD / ascorbate-activated呼吸(−25,resp−19%。)还观察到在这种特殊的条件下,表明一些呼吸通量的变化可以改变氧化磷酸化机械。
(一)
(b)
3.3。线粒体复合物活动
评估上述呼吸数据是否直接联系一些缺陷在电子传递链,酶活性的复合物I, II, III,结合水平在不同的细胞色素,以破碎的肝脏线粒体。复合物我和III是大幅下降(−32,resp−40%。)在糖尿病动物的细胞器与对照组相比,然而复杂II出人意料地增长了42.4%(图3)。有趣的是,一个更小的细胞色素aa3被发现在糖尿病中的内容Psammomys肝脏线粒体(表3),结果相当一致的细胞色素氧化酶活性降低,我们通过TMPD-dependent呼吸上面见过。
4所示。讨论
在这项工作中,我们已经确认Psammomys obesus是一个可靠的生物研究支持胰岛素抵抗和2型糖尿病等代谢紊乱,其病因是类似于人类的表现。我们的结果符合研究使用以色列Psammomys(19]或尼罗河鼠(20.),尽管后者显示那么明显的代谢障碍Psammomys obesus那些高热量的饮食喂养后18周。可能强调肝质量体的增加重量呈正相关,高胰岛素血和组织脂质积累,意义深远的肝损伤类似报道由其他人(21]。一个高比例的可溶性转氨酶也见过。肝细胞损害发生时知道这些酶被释放(22),另一方面,一个不完整的氧化由于慢性燃料过剩可以与线粒体的不能维持足够的ATP水平(23,24],似乎这些有害的代谢缺陷始终伴随着剧烈的内生氧化应激和随后的线粒体功能障碍,主要在内膜活动水平。
当前工作研究使用肝线粒体氧化磷酸化产能隔绝Psammomys obesus。因为存在没有或很少有相关数据生物能学在这些老鼠,它变得很困难来比较我们的研究结果与最近的文学。因此,我们试图讨论他们在最好的情况下对其他实验模型涉及线粒体功能障碍。从diabetes-prone线粒体Psammomys obesus显示较低的呼吸速率比对照组:减少在这两个国家3 (ADP)和非耦合状态表明氧化能力的丧失。类似的结果从Wistar鼠喂高脂肪的食物25,26),而没有修改或更高的呼吸强度与Zucker老鼠被发现27]或GK大鼠6个月的年龄(3]。细胞色素氧化酶,呼吸链的最后一个组件,是公认的控制步骤nonphosphorylating耗氧量(28]。其活动,当间接确定TMPD /抗坏血酸盐的存在,是降低糖尿病Psammomys obesus与对照组相比,这个反应是此外伴随着重大损失在细胞色素aa3。这样的观察可以反映出一个更小的线粒体效率减少RCR虽然证明了这个事实而言尤其是NAD-driven呼吸(谷氨酸/苹果酸)。这些研究结果将由食源性也部分地解释了膜脂质成分的变化,但需要进一步探讨这种现象的优点。
高葡萄糖和游离脂肪酸或损害的代谢通量的灵活性,这可能提高线粒体基质生产供应和活性氧(7]。当ROS的有害影响组织广泛赞赏,糖尿病状态的严重程度Psammomys obesus有可能加剧了氧化应激相关。增加lipoperoxidation与助教的下降被报道。符合这些改变,减少谷胱甘肽(GSSG比率显然是表明一个受损的肝脏抗氧化系统。我们的数据与一些研究使用streptozotocin-treated老鼠[协议29日,30.),高果糖饮食喂养的大鼠(31日),或糖尿病小鼠32,33]。针对氧化应激增加也符合氧化磷酸化的减速,我们的生物能学结果显示存在多个损坏站点的电子传递链。事实上,从糖尿病线粒体Psammomys显示一个抑制复杂我和复杂的三世,过量引起的线粒体ROS作为早期建议(34]。这项工作的另一个重要的发现是,Psammomys吃那些高热量的饮食表现出复杂的净激活II尽管几乎减少JO2琥珀酸的存在(FAD-linked基质),但与糖尿病之间的可比性RCR和控制老鼠。支持我们的数据,坎宁安等人观察减少呼吸道复合物,除了复杂的二世,利用脂肪变性患者的肝脏活组织检查(35]。否则,复合体II和IV活动是增强在GK大鼠或糖尿病大鼠体外实验36]。
大量研究调用ROS的参与在线粒体DNA-related障碍的发病机制37,38)和脂质过氧化反应产品会损害线粒体基因组(39]。可能推断出一个增加氧化应激与糖尿病状态导致线粒体DNA损害,应该改变的功能配合物我和III。考虑到复杂II由核基因编码的蛋白质可能幸免,任何改善的活动可以减轻其他呼吸参数的异常或损失,并确定整个氧化能力。有趣的是,另一种适应反应线粒体代谢葡萄糖高环境揭示了糖尿病患者的胰岛细胞Psammomys obesus(40]。在这方面,沙漠沙鼠模型建立代谢和/或分子调整胰岛素抵抗的规避一些有害的结果。
得出这个饮食导致肝代谢问题的水平Psammomys obesus老鼠18-week治疗后,这些变化可能与大量线粒体功能障碍有关。目前的工作是在协议与氧化磷酸化的基因表达的改变,可能导致严重氧化应激,这证明性能的进一步研究,以确定一些线粒体损伤的分子过程负责,对肝脏和量化它们的相对影响。
利益冲突
作者没有利益冲突。
确认
本文由阿尔及利亚支持健康的研发机构(安德烈斯;批准号03/03/03/10/008)大学间的合作项目(PCI;批准号/ 026422/09)以及由国家研究项目(内线没有。208 /安德烈斯/ 2011和内线。41 /安德烈斯/ 2011)阿尔及利亚国家政府的高等教育和科学研究(DG-RSDT)。本文作者想奉献给我们的朋友和同事教授项目El-Mir,最近死去的,他们所有的爱和感激之情。