文摘

人体最大的器官,皮肤起着重要的作用在生物转化/解毒,消除外源性物质和内源性有毒物质,但其在氧化应激和胰岛素抵抗中所扮演的角色还不清楚。我们调查了皮肤解毒和氧化应激之间的关系/胰岛素抵抗通过检查burn-induced烟碱降解的变化。老鼠被分为四组:sham-operated sham-nicotinamide,燃烧,burn-nicotinamide。老鼠收到一封腹腔内葡萄糖注射液(2 g / kg)有(sham-nicotinamide和burn-nicotinamide组)或没有(sham-operated和燃烧组)共同的烟酰胺(100毫克/公斤)。结果表明,所有detoxification-related的信使rna酶检测中检测出sham-operated但不是在烧伤皮肤。烟酰胺的间隙N1-methylnicotinamide在燃烧的老鼠明显下降的价格相比sham-operated老鼠。葡萄糖负荷后,燃烧组显示明显高于血浆胰岛素水平比sham-operated肌肉糖原水平较低和sham-nicotinamide组,虽然在血糖水平没有明显差异群体之间。等离子体的更深刻的变革2O2burn-nicotinamide组和胰岛素水平观察。它可能会得出结论,减少皮肤解毒可能增加氧化应激和胰岛素抵抗的风险。

1。介绍

氧化应激是氧化/抗氧化失衡的状况的净额活性氧(ROS)超过身体的抗氧化能力(1,2]。越来越多的证据表明,氧化应激可能起到关键作用在胰岛素抵抗(IR)的特点是高胰岛素血(1- - - - - -3]。活性氧的主要来源之一是外源性物质,外源性化学物质如重金属、药物、杀虫剂、食品添加剂(3- - - - - -5]。ROS的另一个主要来源是内源性毒性和生物活性的化合物,如儿茶酚胺、儿茶酚-的主要应激激素灭活O甲基转移酶(COMT)和单胺氧化酶(MAO) (6]。因此,解毒的效率和消除外源性物质和内源性有毒化合物应该是一个关键因素在氧化应激和IR。

外源性物质的解毒异型生物质/摘要[7- - - - - -9]。因此,可想而知,任何组织/器官参与外源性物质解毒排泄和ROS清除可能发挥作用在氧化应激和IR。的皮肤是人体最大的器官,可以降低,灭活,消除许多外源性物质和内源性有毒化合物通过异型生物质/摘要[7- - - - - -9),ROS-scavenging系统[10),和汗腺11- - - - - -14]。人们已经发现,严重烧伤,引起永久性的结构组织损伤,与持久的红外光谱、内质网应激反应,代谢亢进,皮质醇和海拔,儿茶酚胺,细胞因子(即。,他们仍然坚持烧伤愈合后)[15- - - - - -17]。此外,受损皮肤的血管扩张和皮肤出汗在嫁接(18]。这些证据提出的可能性,减少皮肤功能可能发挥作用在氧化应激和红外光谱的发展。为了验证这个假设,本研究调查了皮肤解毒和ROS生成和红外光谱之间的关系通过检查burn-induced退化和间隙的变化烟酰胺的前体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和已知引起红外(19,20.]。

2。材料和方法

2.1。动物实验
2.1.1。葡萄糖和烟酰胺加载测试

动物实验是按照制度进行的指导方针。男性Sprague-Dawley老鼠(180 - 220 g)标准的老鼠喂食食物。全身40%面积全层损伤是造成大鼠背部皮肤上;sham-operated老鼠受到一个相同的程序,除了他们沉浸在25°C水,如前所述[20.]。老鼠被随机分为四组:sham-operated集团( ),sham-nicotinamide集团( ),燃烧组( ),burn-nicotinamide集团( )。在48小时后燃烧伤害或虚假的治疗和禁食12小时后,四组中的所有老鼠收到腹腔内注射葡萄糖(2克/公斤体重)有(sham-nicotinamide组和burn-nicotinamide组)或没有(sham-operated组和烧伤组)coinjection烟酰胺(σ,圣路易斯,密苏里州,美国;100毫克/公斤体重)。尾巴血糖水平监测和15岁之前,30和60分钟后使用一个葡萄糖注射液(OneTouch超,LifeScan、苗必达,CA,美国)。在同一时间点,尾巴血液样本(200μL)收集后测定血清胰岛素和过氧化氢的浓度(H2O2)。实验结束时(即。,1 h after glucose loading), blood sample was collected by eye bleed into EDTA tubes under urethane anesthesia (1.5 g/kg, ip); samples of liver, muscle (rectus femoris, biceps brachii, latissimus dorsi, and gastrocnemius), and back skin (in burned or sham-operated areas) were then harvested and stored in liquid nitrogen for later analysis. Plasma was separated by centrifugation (1500 g, 10 min) and stored at −80°C until assay.

2.1.2。逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)

大鼠背部皮肤和肌肉组织的总RNA(股直肌、肱二头肌和背阔肌)提取使用试剂盒(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的协议。信使rna的烟酰胺N甲基转移酶(NNMT)醛氧化酶(AOX1), COMT,毛(单胺氧化酶A),超氧化物歧化酶2、谷胱甘肽过氧化物酶,过氧化氢酶(CAT)、酶类1 (PRDX1)和中性粒细胞胞质因子1 (p47-phox)被rt - pcr检测。提取RNA reverse-transcripted在20μL反应与低聚糖(dT)和随机引物使用PrimeScript RT大师混合(豆类、志贺、日本)。PCR扩增以Techne tc - 512执行梯度热循环(Techne有限公司丙烯,剑桥,英国),使用特定引物列在表中1。PCR反应条件如下:10分钟95°C;40 95°C的周期30年代,60°C 30年代和72°C 45 s;紧随其后的是一个扩展反应10分钟的72°C。分析了反应产物琼脂糖凝胶电泳和可视化紫外线与溴化乙锭染色后。

表1
引物选择基因的寡核苷酸序列。
2.1.3。化验的胰岛素,H2O2,糖原

用ELISA测定血清胰岛素水平(大鼠胰岛素/鼠标设备;微孔,圣查尔斯,密苏里州,美国)。血清H2O2使用H浓度测定2O2分析工具包(Beyotime生物科技、江苏、中国)。肝和肌肉(腓肠肌)糖原含量测定与糖原测定试剂盒(南京建成生物工程研究所、南京、中国)。ELISA板被标读(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。

2.1.4。烟酰胺和测定 -Methylnicotinamide

高效液相色谱法(HPLC)被用来测量等离子体烟酰胺和 -methylnicotinamide,如前所述20.]。高效液相色谱系统由一个LC-9A泵(日本岛津公司,京都,日本),7725年Rheodyne我样品20 -喷射器μL样品环(Rheodyne LLC Rohnert公园、钙、美国),一个海波西尔ODS C18柱(美国热、Bellefonte PA)水域470荧光检测器(米尔福德,妈,美国)。所有的色谱法在室温下进行。

2.2。人类实验

所有患者参与研究签署知情同意书之前的肝脏和皮肤样品免疫组织化学分析。人类正常肝和皮肤样本捐赠的人接受了切除的肝癌和乳腺癌,分别。这项研究已经被大连理工大学的伦理委员会批准。

2.2.1。免疫组织化学

切除肝脏和皮肤的组织学检查确保健康组织的使用。样品的肝脏和皮肤直接陷入液态氮,随后储存在−80°C到化验。AOX1的位置在人类皮肤是由免疫组织化学染色。简而言之,four-micrometer部分通过分级deparaffinized二甲苯和水化乙醇。微波抗原检索后,免疫反应性检测到streptavidin-biotin-peroxidase复杂的方法(福州,福州Maixin,中国)颜色开发使用3、3′-diaminobenzidine。主要抗体是鼠标anti-AOX1 (1: 300;BD生物科学、钙、美国)。用磷酸盐(PBS)主要抗体是用作负控制。部分与迈耶的苏木精复染色30年代。正常肝组织的部分被用作一个积极的控制。

2.2.2。西方墨点法

免疫印迹分析NNMT和AOX1根据标准执行协议。简单地说,30μg人类肝脏或皮肤蛋白质分离12% (NNMT)和8% (AOX1) SDS聚丙烯酰胺凝胶,分别转移到聚乙烯二氟化物膜(微孔、马、美国)。包含0.1%的膜被封锁在TBS Tween-20和5%脱脂奶粉60分钟在室温和孵化与抗体NNMT (1: 1000;圣克鲁斯生物技术、钙、美国)和AOX1 (1: 600;BD生物科学、钙、美国)一夜之间在4°C。然后,膜被PBS-Tween接着洗1 h与辣根在室温下孵化peroxidase-conjugated二级抗体(1:5000;圣克鲁斯生物技术、钙、美国)和使用增强化学发光检测(美国新泽西州Amersham生命科学)。人类肝组织作为一个积极的控制这两个抗体。

2.3。统计分析

这些数据意味着±SEM。统计数据的差异被学生的评估 以及或单向方差分析和被认为是重要的 。

3所示。结果

3.1。Burn-Induced基因表达在大鼠皮肤的变化

我们首先比较了基因表达的异型生物质/摘要(包括NNMT、AOX1 COMT,毛),ROS-scavenging酶(包括SOD、GPX1猫和PRDX1),和p47-phox, NADPH氧化酶的组成复杂,sham-operated鼠和燃烧鼠皮肤之间。rt - pcr结果显示,所有的酶测试表达sham-operated鼠皮肤,但没有检测到表达的酶在皮肤烧伤(图1)。这些结果表明,全层燃烧可能导致损失的解毒和抗氧化功能的皮肤。


图1
rt - pcr分析mRNA的表达异型生物质/药物——和ROS-metabolizing酶在大鼠皮肤。S: sham-operated皮肤。B:烧伤皮肤。数据显示是代表三个独立的实验。
3.2。Burn-Induced烟酰胺的退化和间隙的变化

的观察大鼠皮肤nicotinamide-degrading酶表达表明,可能在烟酰胺间隙中发挥作用。因此,我们调查的影响水平的血浆烟酰胺和燃烧 -methylnicotinamide toxic-methylated代谢物,烟酰胺(20.]。Sham-nicotinamide组和burn-nicotinamide组显示明显高于血浆烟酰胺水平与其他两组相比,和等离子体水平烟酰胺burn-nicotinamide组显著高于Sham-nicotinamide组(图2(一个))。这些结果表明,烧毁了老鼠的宽容烟酰胺却降低了。尽管没有显著差异在等离子体烟酰胺sham-operated组和烧伤组(图之间的水平2(一个)),等离子体 -methylnicotinamide水平燃烧组远远高于sham-operated组(图2 (b))。Burn-nicotinamide组明显高于血浆水平 -methylnicotinamide比其他组(图2 (b))。这些结果表明,燃烧的间隙减少 -methylnicotinamide。

(一)
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(b)
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图2
烟酰胺和血浆浓度 在不同的鼠群-methylnicotinamide。骗局:sham-operated组;假+纳米:sham-nicotinamide组;燃烧:烧伤组;燃烧+纳米:burn-nicotinamide组。* 。条形图显示意味着±SEM。
3.3。燃烧提高H2O2模型和IR-Inducing烟酰胺的影响

烟酰胺诱导氧化应激,IR和葡萄糖耐受不良19- - - - - -21]。因此,我们研究了老鼠的反应不同的团体葡萄糖负荷。

结果表明,在基线血清浓度没有明显差异的H2O2(ROS)的主要组件之间的组织。

葡萄糖负荷诱导等离子体H的下降2O2水平sham-operated集团,而其他三组均呈增长趋势。增加的趋势是更深刻的burn-nicotinamide组比sham-nicotinamide组和燃烧组(图3(一个))。

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(c)
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图3
血清H2O2和胰岛素水平和血糖浓度在不同的鼠群。骗局:sham-operated组;假+纳米:sham-nicotinamide组;燃烧:烧伤组;燃烧+纳米:burn-nicotinamide组。 和 与sham-nicotinamide集团 与burn-nicotinamide集团和 与烧伤组在同一时间点。数据意味着±SEM。

所有组血浆胰岛素水平显示上升趋势与峰值葡萄糖负荷后15到30分钟。血浆胰岛素的变化更深刻的在burn-nicotinamide组和烧伤组(图3 (b)),而没有明显差异的变化趋势之间的血糖水平组(图3 (c))。这些结果表明,燃烧可以产生红外,烟酰胺,可以进一步增强负载。

肝糖原含量没有明显差异sham-operated组和sham-nicotinamide组之间或烧伤组和burn-nicotinamide组之间。然而,两个燃烧组显示显著降低肝糖原含量比虚假的两组(图4(一))。似乎肝糖原合成影响燃烧,但不是通过烟酰胺负载。相比之下,肌肉糖原含量影响燃烧和烟酰胺负载(图4 (b))。

(一)
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(b)
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图4
糖原含量在不同大鼠肝脏和骨骼肌组织。骗局:sham-operated组;假+纳米:sham-nicotinamide组;燃烧:烧伤组;燃烧+纳米:burn-nicotinamide组。* 。条形图显示意味着±SEM。

探讨这些不同的反应机制的肝脏和骨骼肌烟酰胺负载,我们发现NNMT的表达和AOX1鼠骨骼肌。rt - pcr结果显示,大鼠骨骼肌NNMT表示,但没有表达AOX1(图5)。这表明骨骼肌可以把烟酰胺 -methylnicotinamide,但不能解毒 -methylnicotinamide。


图5
rt - pcr分析mRNA的表达NNMT和AOX1 sham-operated老鼠的肌肉。数据显示是代表三个独立的实验。
3.4。表达NNMT AOX1人类皮肤

然后我们发现NNMT和AOX1的表达在人类皮肤。免疫印迹结果表明NNMT和AOX1都表达了在人类皮肤(图6(一))。免疫组织化学分析表明,AOX1位于汗腺(图6 (d))和皮脂腺(图6 (f))。这些结果表明,人体皮肤,像老鼠的皮肤,也可以参与过多的烟酰胺的降解。

(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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(e)
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(f)
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图6
表达AOX1 NNMT和位置的人类肝脏和皮肤。(一)免疫印迹结果。((b) - (f))免疫组织化学分析AOX1表达式。(b)积极控制AOX1表达式(人类肝脏)。((d)和(f)),显示的位置AOX1汗腺和皮脂腺,分别。((c)和(e) -控制(分别(d)和(f))(没有初级抗体)。AOX1染色使用与diaminobenzidine衬底streptavidin-biotin-peroxidase复杂的方法。核与苏木精复染色。放大倍数: 。

4所示。讨论

本研究的主要结果是:(1)异型生物质/摘要和ROS-scavenging酶的表达中没有检测到全层烧伤大鼠皮肤;(2)燃烧可以减少过多的烟酰胺对老鼠的间隙,这是伴随着增加H2O2生成和葡萄糖负荷异常反应,也就是说,升高胰岛素水平和骨骼肌糖原含量减少;(3)大鼠骨骼肌表达NNMT被发现,但不AOX1;(4)NNMT的表达和AOX1在人体皮肤检测。

过度的烟酰胺主要退化 -methylnicotinamide由AOX1 NNMT然后进一步氧化吡啶酮(20.]。因此,预计任何组织/器官表达NNMT和AOX1可能导致身体的总容量,降低过度的烟酰胺。皮肤NNMT表达,因此,burn-induced增加等离子体水平的烟酰胺,也许是因为改变skin-mediated烟碱降解。等离子体 -methylnicotinamide水平不仅取决于其代烟酰胺,也由它转化为羟基吡啶。NNMT广泛表达于人类和大鼠组织(22,23),特别是骨骼肌,AOX1不是骨骼肌中表达(图5)。骨骼肌是脊椎动物最大的组织。显然,骨骼肌的医疗 -methylnicotinamide降解增加皮肤贡献转换的重要性,可能占烟酰胺load-induced更深刻的等离子体的增加 -methylnicotinamide水平燃烧比sham-operated老鼠老鼠。

证据表明,红外可能是氧化应激的结果(1- - - - - -3]。实际上,我们之前的研究表明,共同服用葡萄糖和烟酰胺的能引起红外由于过度ROS生成烟酰胺降解造成的人类被试(21]。本研究的数据表明,减少skin-mediated烟碱降解可以增强活性氧生成和IR-inducing烟酰胺的影响。 -methylnicotinamide是一种有毒的烟酰胺代谢的中间。肝脏不仅降低烟酰胺 -methylnicotinamide,也进一步的解毒作用 -methylnicotinamide吡啶酮。不同于肝脏,骨骼肌只能把烟酰胺 -methylnicotinamide。因此,这可能导致的积累 -methylnicotinamide肌肉组织,从而导致当地的毒性作用,这或许可以解释为什么红外烟酰胺后负载只发生在骨骼肌,但不是在肝脏。仅发现燃烧减少肝糖原内容可能涉及其他机制超出了本研究的范围。

应该注意的是,除了nicotinamide-degrading酶,其他异型生物质/摘要,如细胞色素P450,黄素单氧酶,谷胱甘肽转移酶——毛年代转移酶,N-acetyltransferases sulfotransferases,皮肤也表达了(7- - - - - -9]。大量的外源性物质和内源性生物活性/有毒物质的基质皮肤异型生物质/摘要。皮肤也表达了SOD,猫,GPX1 PRDX1,可消除活性氧,从而帮助抵御氧化损伤10,24]。此外,人体外分泌腺的汗腺,总约一个肾,也就是说,100克,可以排泄大量外源性物质,如金属和药物(11,13],内源性生物活性物质,如神经递质、细胞因子、植物固醇(13,25,26]。因此,可想而知,减少皮肤功能(例如,由于烧伤和冷环境温度)的风险可能会增加体内有毒物质的积累和随后的氧化应激和IR。

是否发生氧化应激不仅取决于活性氧的生产,而且对身体的总抗氧化能力(1,2]。后者代表了各种器官的抗氧化能力。每个器官/组织作出了独特的贡献对身体总抗氧化系统。例如,肝脏是主要负责生物转化/外源性物质的解毒和内源性有毒物质,而肾主要负责消除有毒物质。因此,减少这些器官的功能预计将增加氧化应激和红外的风险。事实上,许多研究表明,严重的肝脏或肾脏疾病患者与氧化应激和红外(27,28]。皮肤、肝脏和肾脏等,是对身体的一个主要贡献者的总抗氧化防御。证据表明,(1)外源性物质和内源性有毒物质诱导氧化应激和红外3];(2)皮肤是最大的器官参与外源性物质的解毒和排泄和内源性有毒物质(29日];(3)桑拿,从而增加了消除有毒物质(30.),可以改善心血管疾病,自身免疫性,toxicant-induced和其他慢性健康问题25];(4)有持续损伤皮肤的血管舒张和移植皮肤出汗18];(5)有一个内生积累有毒物质(如皮质醇,儿茶酚胺,和细胞因子)的循环postburn患者(17];(6)有一个减少skin-mediated外源性物质的生物转化,由本研究如图所示;(7)烧伤后患者与持续的内质网应激和红外(15,17]。因此,烧伤后氧化应激和红外可能包括减少皮肤解毒和排泄。

还支持上述假说的观察nonburn创伤和手术。烧创伤和nonburn创伤(包括大手术),伴有交感神经活动增加和分配血液流动远离某些nonvital器官,如皮肤、胃肠道和肾脏31日),在急性期与红外相关联。但是,与烧创伤、IR nonburn引起的创伤和手术是瞬态和nonburn外伤或手术后消失32],显示以下关系:一个永久减少皮肤功能与持续的红外光谱,同时降低瞬态的功能完整的皮肤与瞬态红外相关联。此外,观察到有海拔IR-inducing物质(33)、血压(34和差IR-related疾病的症状35,36]在冬天可能还意味着皮肤功能和红外之间的密切联系,从接触低环境温度降低了血液流向皮肤和皮肤温度(37]。

总之,皮肤是身体的主要组件的抗氧化防御系统。因素,减少皮肤功能可能导致减少外源性物质的间隙和内源性活性氧生成有毒物质和随后的增加,这可能导致红外光谱的发展。该角色的皮肤在氧化应激和红外总结在图7。


图7
提出了皮肤氧化应激和红外的角色。身体的总抗氧化能力,包括生物转化系统、排泄系统、和活性氧清除系统,取决于身体的组织和器官的功能。减少皮肤的贡献,比如引起严重的烧伤和寒冷环境环境,增加身体的总抗氧化能力,从而减少氧化应激和随后的IR的风险。好:身体的总抗氧化能力> ROS生成;操作系统:氧化应激,ROS生成>身体的总抗氧化能力。

利益冲突

作者没有利益冲突声明。

作者的贡献

s。周负责这项研究的概念、设计方向和监督,起草了手稿,和获得资金;x x。刘和C.-B。太阳的贡献同样这项工作;x x。刘,C.-B。太阳,T.-T。杨,d . Li彭译葶。李和Y.-J。 Tian contributed to the data acquisition and analysis/discussion. Y. Cao participated in the design of the study and performed the statistical analysis. M. Guo participated in the HPLC experiments.

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(没有。31140036)和教育部重点实验室的基础辽宁省(没有。2009 s005)。