文摘

肝脏和肾脏通常受到糖尿病慢性病例,但发病的机制并不完全了解在疾病的早期阶段。本研究的目的是调查caspase-3的免疫组织化学表现,环氧合酶(COX) 1和2,钙敏感受体(CSR)和缺氧诱导因子- 1α(HIF-1α)在胰腺、肝脏和肾脏在链脲霉素(STZ)诱导糖尿病。研究小组(n= 6)收到链脲霉素(50毫克/公斤)和对照组(n= 6)生理盐水。测量血糖和酮尿,尸体剖检进行在第三,第四,第五天。免疫组织化学显示显著增加caspase-3反应胰腺、肝脏和肾脏的研究小组比对照组。COX-1略微增加相比,研究小组在这些器官控制。免疫组织化学cox - 2在肝脏和肾脏明显的反应是积极的,但在胰腺略有增加。最增加反应在CRS,所有器官都明显积极的。HIF-1α表达也增加但胰腺的反应是更严重的肝脏和肾脏。本研究表明,退化器官在疾病的早期阶段开始,最有效的路线变性相关增加的钙流入,对DM细胞缺氧。

1。介绍

糖尿病是一种代谢紊乱,减少胰岛素的结果可用于许多体内细胞的正常功能。在某些情况下,增加浓度胰高血糖素促进发展的持续的高血糖。除了慢性高血糖,糖尿病的特点是干扰的碳水化合物,脂肪,和胰岛素分泌缺陷产生的蛋白质代谢,胰岛素的行动,或两者兼而有之。疾病也可以被识别的阶段,大多数通常通过葡萄糖耐受不良的存在。DM的影响包括长期损害,障碍,和失败的各种器官,特别是眼睛、肾脏、肝脏、心脏和血管(1]。

在糖尿病的发病机制,有几个因素导致了胰岛素的可用性下降。高血糖,随之而来的影响细胞构成的致病性病变DM (2]。可以证明了大量标记细胞损害免疫组织化学。例如,还存在一个家庭的半胱氨酸蛋白酶主要参与凋亡通路(3]。Caspase-3之一的效应还涉及作为一个关键蛋白酶裂开多个细胞基质,包括DNA修复相关组件和监管,让细胞死亡(4,5]。环氧酶酶中也扮演着重要的角色在细胞的损害。三个不同的考克斯酶存在,现在被称为COX-1, COX - 2, COX-3,他们负责形成重要的生物介质叫做前列腺素类,包括前列腺素、内皮、凝血恶烷。药物抑制COX可以减轻炎症和疼痛的症状(6]。在糖尿病、细胞质Ca的直接证据2 +触发胞外分泌的胰岛素颗粒从实验中得到使用β细胞的质膜在这些细胞permeabilized,膜电位消失,小分子的胞质浓度可以控制(7]。钙敏感受体是一个G protein-coupled受体(GPCR)和细胞外和细胞内钙稳态的监管与企业社会责任相关。它也被发现在各种各样的器官没有参与系统性钙稳态,它扮演着重要的角色在细胞损害8- - - - - -10]。低氧诱导因子- 1α在变性和转录激活因子,促进血管生成(11,12]。HIF-1α表达时也常氧条件下诱导细胞与生长因子刺激,炎性细胞因子,乳酸或前列腺素(13- - - - - -15]。

糖尿病是一种复杂的疾病,导致大量细胞在不同的器官损害。许多致病的进步已经在过去的十年,但许多机制需要澄清。发病的机制在DM可能互动和联系。因此,细胞损伤机制并不完全理解。这初步研究旨在探索细胞分布和缺氧的底层机制和钙涌入实验性糖尿病。

2。材料和方法

十二个女Sprague-Dawley老鼠,体重125 - 150 g和2个月岁时维护实验动物房单位Akdeniz大学的。他们被随机分配到两组,如下所示:STZ处理和对照组的研究小组。两组都由6大鼠和被允许免费的水和食物。老鼠注射STZ前禁食。单个STZ腹腔内注射50毫克/公斤(西格玛化工有限公司、圣路易斯、钼)立即解散前政府在刚做好的50更易与柠檬酸/ L缓冲区(pH值4.0)是在0天。控制动物收到同等体积的生理盐水。收集尿液样本在三,四,五天。在第三天,两只老鼠形式,研究小组和两个对照组的老鼠与乙醚麻醉前血液和组织样本。血液中的血糖浓度测量从早上颈静脉从2在每组老鼠安乐死,然后进行尸体剖检后第三天。察觉不到的血液计数设备用于血液分析血液的EDTA管。 Glucose levels were analyzed in serum samples using IDEXX VetTest equipment and reagents. Pancreas, liver, and kidney tissue samples were collected and fixed in 10% buffered formalin. After routine procedure, tissues were blocked in paraffin and cut to 5 μ米厚度。组织部分是沾hematoxylin-eosin(他)和显微镜下检查。后来,胰腺、肝脏和肾脏样本应用caspase-3(兔多克隆,猫。不。美国250573年Abbiotec-San迭戈)、COX-1(特定兔抗体抗原决定基,猫。不。rr - 10687 p0,热科学、弗里蒙特,美国),cox - 2(猫。没有:rm - 9121 s0,热科学、弗里蒙特,美国),CSR (CSR Rb帕布,ab62653 - 100, Abcam很多:433372年,剑桥,英国),和HIF-1α(H1α67年,sc - 53546,美国圣克鲁斯生物技术有限公司CA)根据制造商的指示。在这项研究中,avidin-biotin复杂的过氧化物酶(ABC-P)方法用于免疫组织化学。石蜡块切割5点μm为免疫组织化学检查,部分涂上poly-L-lysine连着玻璃幻灯片。幻灯片在37°C优化干一夜之间附着力。部分通过二甲苯deparaffinized,顺序和组织患者在酒精毕业。幻灯片是孵化在过氧化氢甲醇10分钟减少非特异性背景染色由于内源性过氧化物酶。部分洗两次,在磷酸缓冲溶液(PBS)。然后,组织在1:煮十分钟就100柠檬酸缓冲溶液和冷却20分钟。冷却组织在PBS洗四次申请阻止血清前5分钟。然后,主要抗体应用;在室温下组织孵化了30分钟。他们在PBS清洗4次,给出一个应用生物素化的anti-polyvalent抗体和孵化在室温下10分钟。 After being washed three times in PBS, streptavidin peroxidase was applied and the samples were incubated for 10 min at room temperature, and then rinsed 4 times in PBS. Tissues were further incubated for 20 min at room temperature in a solution of DAB (3, 30 diaminobenzidine) chromogen. After being washed in PBS, tissues were counter stained with Mayer’s haematoxylin, washed in water, and coverslips were applied with mounting media. For negative control, primary antibody was not added to the sections.

为了评估immunopositive细胞的比例,不同的微观高性能的10个领域里的100个细胞计算每个幻灯片的40 x的目标三目的显微镜下检查(尼康E600)和缩微摄影装置。阳性细胞数的一个大功率领域每一个标记指出,与对照组相比。

在统计评估,学生t测试使用。计算结果都是采用SPSS 13.0程序包。 被接受为显著。

3所示。结果

高血糖和酮尿最初观察到大鼠研究小组3天后管理。没有糖尿和对照组酮尿。的血液和尿液生化结果见表1。没有观察到宏观变化在两组的器官。胰腺组织病理学检查的变性和坏死在朗格汉斯胰岛β细胞被认为在研究小组。在镜检轻微的退化性变化观察到肝脏和肾脏的肾小管上皮细胞。免疫组织化学观察caspase-3 COX-1, cox - 2, CSR, HIF-1α应用部分显示在这些器官严重损害DM的早期阶段。免疫组织化学观察统计结果图形所示。Caspase-3 immunopositive在胰腺胰岛细胞数量明显增加了学习小组。除了胰腺,caspase-3 immunopositive肝脏肝细胞研究小组的反应是高于控制和强烈的免疫反应被观察到在肾小管上皮细胞(数字1(一),1 (b),1 (c),1 (d),1 (e),1 (f))。轻微增加COX-1反应观察胰腺、肝脏和肾脏研究小组的老鼠。在肾脏,免疫组织化学检查发现COX-1本地化收集管的表达。cox - 2免疫反应性的细胞相比,研究大鼠明显增加与控制在各检查器官。在对照组中,cox - 2阳性免疫染色观察在单独的肾小管上皮细胞。标志immunopositivity证明在致密斑和nonmacula densa的肾小管研究小组(数字2(一个),2 (b),2 (c),2 (d),2 (e),2 (f))。在两组中,CSR immunopositive免疫反应被发现在细胞器官的细胞质。但在研究小组反应是杰出的。Immunopositive反应也观察到一些朗格汉斯细胞的细胞核胰腺的胰岛。类似CSR的反应是注意到在肝细胞和肾的近端和远端小管上皮细胞(数字3(一个),3 (b),3 (c),3 (d),3 (e),3 (f))。HIF-1α免疫反应显著增加的研究小组同时控制都是负面的。朗格汉斯胰脏胰岛明显HIF-1展出αimmunopositive反应。轻微的免疫反应检测肝脏的肝细胞。强HIF-1α反应是观察到的近端和远端肾小管上皮细胞的研究小组(数字4(一),4 (b),4 (c),4 (d),4 (e),4 (f))。阳性免疫反应性表示了强烈的棕色(DAB)。所有的标记都是逐渐增加与天感应DM的研究数据5(一个),5 (b),5 (c),5 (d),5 (e))。

表1
大鼠的血液和尿液值组。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图1
Caspase-3反应。(一)Immunopositive反应在朗格汉斯胰岛细胞(箭头)的研究小组,酒吧= 50μm;(b)在对照组没有免疫反应,酒吧= 50μm;(c)标记反应在肝细胞研究小组(箭头),酒吧= 100μm。(d)轻微的免疫反应在某些肝细胞(箭头)对照组,酒吧= 50μm;在管状细胞(e)强烈反应肾(箭头),酒吧= 100μm。(f)几个immunopositive肾细胞对照组,酒吧= 100μm。ABC-P方法Hematoxyline对比染色是用于所有组织。右列属于学习小组和左列属于对照组。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图2
cox - 2的反应。(一)严重的内分泌胰腺的胰岛阳性免疫反应研究小组(箭头),酒吧= 50μm。(b)没有免疫反应在对照组朗格汉斯胰腺的胰岛,酒吧= 100μm。(c)温和的免疫反应在肝细胞研究小组(箭头),酒吧= 100μm。(d)几个免疫反应在对照组肝脏(箭头),酒吧= 50μm。(e)强劲immunopositive反应nonmacula densa地区肾(箭头)的研究小组,酒吧= 100μm。(f)的一些免疫反应肾震后细胞致密斑(箭头)对照组,酒吧= 100μm。ABC-P方法与苏木精复染色是用于所有组织。右列属于学习小组和左列是属于对照组。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图3
CSR的反应。(a)严重的表达式在细胞核和细胞质融合的内分泌胰腺的胰岛研究小组(箭头),酒吧= 50μm。(b)没有免疫反应在对照组朗格汉斯胰腺的胰岛,酒吧= 100μm。(c)严重immunopositive反应在肝细胞研究小组(箭头),酒吧= 100μm。(d)几个免疫反应在对照组肝脏(箭头),酒吧= 100μm。(e)强劲immunopositive反应在肾小管上皮细胞(箭头)的研究小组,酒吧= 200μm。(f)非常轻微的免疫反应在对照组肾,酒吧= 200μm。ABC-P方法Hematoxyline对比染色是用于所有组织。右列属于学习小组和左列属于对照组。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图4
低氧诱导因子的反应。(一)严重的内分泌胰腺的胰岛表达研究小组(箭头),酒吧= 100μm。(b)轻微的免疫反应在对照组朗格汉斯胰腺的胰岛,酒吧= 100μm。(c)严重immunopositive反应在肝细胞研究小组(箭头),酒吧= 50μm。(d)几个免疫反应在对照组肝脏,酒吧= 50μm。(e)强劲immunopositive反应在肾小管上皮细胞(箭头)的研究小组,酒吧= 50μm。(f)非常轻微的免疫反应在对照组肾,酒吧= 100μm。ABC-P方法Hematoxyline对比染色是用于所有组织。右列属于学习小组和左列属于对照组。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
图5
Caspase-3统计分析的结果(a)、(b) COX-1, (c) cox - 2, (d) CSR, HIF-1 (e)αimmunopositive细胞数量。

4所示。讨论

STZ政府成熟大鼠诱发严重和永久的糖尿病,胰岛素水平下降,产生细胞毒性模型糖尿病I型糖尿病非常相似。链脲菌素损失β在胰腺胰岛细胞16]。体外实验糖尿病的老鼠被广泛使用的免疫发病机理研究DM (17]。尽管一些研究调查了潜在的免疫细胞和分子的变化在疾病在这个模型中,调查的早期阶段在不同器官和细胞损伤是有限的。细胞损伤的主要原因是坏死和众多代理可能会导致这一过程。细胞损伤的主要原因是缺氧和常见。钙是细胞损伤的主要球员和激活质膜和线粒体损伤细胞损伤的途径。考克斯酶细胞损伤过程中发挥重要作用。细胞死亡是最后阶段的细胞损伤,可能发生细胞凋亡或坏死。Caspase-3是细胞凋亡的主要标志18]。本研究计划检查钙的作用,缺氧,细胞凋亡的早期阶段通过使用HIF-1 DM在不同的细胞αCOX-1和2,CSR和Caspase-3免疫组织化学方法。

DM结果渐进破坏的朗格汉斯胰岛β细胞(19]。多个β细胞的破坏机制已经被提议作为效应器(20.,21]。尽管糖尿病是一种慢性进行性疾病,初始损伤早期阶段中可以看到。以前的研究报道,初始损伤发生后3天的DM诱导大鼠(22,23]。类似的发现在这项研究中,观察到,三天后发现糖尿链脲霉素治疗。组织部分胰腺、肝脏和肾脏组织病理学和免疫组织化学检查3日,第4和第5天。这项研究表明caspase-3表达的增加,COX-1和2,CSR, HIF-1α在胰岛朗格汉斯、肝脏和肾脏在链脲霉素诱导糖尿病大鼠。这些结果支持细胞损害由于DM可以发生在疾病的早期阶段。我们的研究结果表明,不同的机制可能参与糖尿病像缺氧,细胞凋亡,细胞钙流入退行性变化。

还存在cysteine-aspartyl特定蛋白酶在细胞凋亡中发挥关键作用[24]。Caspase-3是凋亡通路的下游效应还存在。基因打靶策略提供了宝贵的工具,研究还存在个体体内的生理功能和显示他们的角色不仅在细胞凋亡以及其它基本的细胞过程4]。几个体外研究表明,半胱天冬酶依赖性凋亡途径至关重要β细胞凋亡(25]。管状的底层机制变化在糖尿病肾脏,然而,目前还不清楚。一个有吸引力的机制是细胞凋亡,这已经证明调解细胞死亡在各种肾脏疾病,包括糖尿病肾病(26]。的确,肾近端小管细胞凋亡检测不同种类包括实验动物和糖尿病患者,表明肾小管细胞凋亡可能会先于管萎缩在糖尿病27,28]。在这项研究中,在胰岛细胞凋亡活动研究中也观察到的老鼠和与先前的研究是一个协议。同时,我们也观察到肝细胞和肾小管细胞凋亡增加活动。这项研究显示,可能的机制在糖尿病发生肝脏和肾脏问题可能与凋亡的增加活动。

许多研究使用1型糖尿病大鼠体外实验表明cox - 2生产增加肾脏(23]。因此,在目前的研究中,研究和控制老鼠的肾脏组织学和免疫组织化学研究和肾功能的变化表达cox - 2在DM感应标记的研究小组与对照组相比。显著增加观察cox - 2的表达在肾近端小管和致密斑在研究组与对照组相比。只略有增加观察COX-1表达的学习小组。这些结果与以前的观测23]。cox - 2蛋白表达增加的可能原因的研究小组老鼠可能与肾脏组织的变化也有糖尿病病理生理调节肾血流动力学的影响。

钙是一个重要的细胞内信使。Ca2 +在许多细胞过程中扮演着重要角色,如维持膜电位和控制荷尔蒙的分泌和细胞增殖和分化8]。管理细胞外钙的内稳态机制维持其附近的恒常性,确保持续可用性钙离子的多个内部和细胞外的功能。企业社会责任表现在许多生理情况下有一个重要的角色。它参与钙代谢调节许多细胞,如甲状旁腺[29日),骨(30.),肾细胞(31日),成纤维细胞(32[],窦的胃泌激素细胞33),上皮细胞(34),少突胶质细胞(30.),肾细胞、视网膜、破骨细胞和成骨细胞,血管平滑肌细胞,在一些大脑细胞(8]。在这项研究中CSR表达胰腺所演示的,在diabetes-induced大鼠肝脏和肾脏。CSR的表达更加突出在研究组比对照组。显著增加观察细胞核和细胞质中朗格汉斯细胞的胰腺胰岛的学习小组。小表情对照组和细胞质。强烈immunopositive反应在集体的肾小管与控制。在两组肝细胞也表达了CSR,反应是更加突出的学习小组。

缺氧是HIF-1的主要监管机构α表达和功能在某些情况下,比如糖尿病发病机理(35,36]。HIF-1α是bHLH-PAS家族的重要成员之一(37)和功能作为一个专二聚体与其他家庭成员,包括芳基碳氢化合物受体(AhR)核转运蛋白(ARNT) [38]。HIF-1α退化发生低氧诱导因子prolyl羟化酶。HIF-1α降解可以被认为是细胞氧气传感器,因为他们的活动范围的不同生理/病理氧气紧张(39]。是非常重要的组织部分的检测低氧诱导因子激活免疫组织化学方法检测核HIF-1α(40]。HIF活性可以调节许多因素如过氧化氢和过氧化物(41]。糖尿病可以导致增加活性氧的生产(42]。肾髓质,NAD (P) H氧化酶活动会导致增加超氧化物的厚提升四肢亨利循环(43]。超氧化物可能加剧肾髓缺氧和减少缺氧适应在糖尿病44]。在这项研究中,尽管HIF-1α负对照组的胰腺,增加反应的研究小组的肝脏和肾脏。HIF-1反应最明显α在朗格汉斯胰腺的胰岛。

5。结论

结果,这项研究表明,免疫反应在胰腺中可以看出,肝脏和肾脏与caspase-3 COX-1, cox - 2, CSR, HIF-1α在diabetes-induced老鼠。这些反应成为天后诱导显著相关。增加的可能原因可能与细胞损伤由不同的路线。增加相关的免疫反应的严重程度天也支持这个想法。最明显的反应是在朗格汉斯的胰腺胰岛的所有标记在这个研究。但肝脏,肾脏可以影响在疾病的早期阶段。这些结果表明,细胞损伤在DM显示缺氧和钙离子流入细胞。细胞凋亡可引起显著的病变器官。这项研究表明,虽然糖尿病是一种慢性疾病,其影响可以看到在早期阶段的细胞。