文摘

本研究旨在建立一个长期的兔子模型糖尿病医学研究长达一年或更长时间,评估慢性高血糖的影响主要器官的损害。一剂四氧嘧啶一水(100毫克/公斤)是静脉注射到20新西兰白兔的年轻人。另一个12的同龄正常兔子被用作控制。用四氧嘧啶高血糖发达后48小时内治疗。糖尿病后的胰岛素被日常开发。所有的动物都获得了一些体重,但增幅远低于同龄非糖尿病的兔子。高血脂、高血尿素氮和肌酐是糖尿病动物中发现的。组织学检查胰腺显示标记β细胞损伤。肾脏显示显著增厚传入肾小球小动脉腔缩小与肾小球萎缩。脂质堆积在细胞质中肝细胞出现空泡。 Full-thickness skin wound healing was delayed. In summary, with careful management, alloxan-induced diabetic rabbits can be maintained for one year or longer in reasonably good health for diabetic studies.

1。介绍

糖尿病是死亡的主要原因之一,疾病,和美国的经济损失1]。毫不奇怪,一个广泛的研究是正在进行的针对原因,这种严重的疾病的诊断和治疗(2]。动物实验已经有很长的历史在糖尿病领域的研究。诱导糖尿病动物的有毒化学物质,如链脲霉素(3和四氧嘧啶4)普遍使用。转基因动物模型中糖尿病的流行。使用啮齿动物的主要批评是,由于其寿命短,他们可能不会发展临床并发症出现在人类糖尿病已经有许多年了。猫、狗、猪,和非人灵长类动物偶尔会使用5]。兔子是一种潜在的忽视,可控的物种为慢性糖尿病实验。他们被认为是在系统发育规模低于猫,狗,猪,和非人灵长类动物,他们的平均寿命明显长于啮齿动物的5 - 8年。

研究已经证明,兔子拥有理想的实验动物模型中的特征包括方便的大小、长寿命,应变具体,有良好的性格,很容易处理和相对便宜的6]。我们搜索PubMed和在过去的十年里已经有超过1000个研究进行了使用兔子作为糖尿病模型(7]。然而,大多数的这些实验用兔糖尿病仅几周2个月(8]。这些时间有严格限制的研究糖尿病研究能力许多糖尿病并发症需要年开发(5]。在这项研究中,我们创建了一个长期的1型糖尿病兔模型合理健康实验使用一年或更长时间。本文报告我们的管理策略和物理、生化、组织学发现这些兔子。

2。方法

依法进行的这项研究是美国国立卫生研究院的动物保健和使用指南研究机构批准的协议是动物保健和使用委员会路易斯维尔大学的一个AAALAC认证程序。总共32年轻(8 - 10周,公斤),雄性新西兰白兔,Oryctolagus cuniculus(桃金娘的养兔场,汤普森站、TN)被分成两组。第一组包括20个动物化学诱导1型糖尿病;第二组由12个年龄控制(orthoglycemic)动物。动物被单独安置在不锈钢罩盖缝层(40×60×80厘米)温度(16 - 22°C)和湿度(30 - 70%)控制的房间在12:12小时光:暗周期。笼锅每周清洗三次,笼架每周清洗一次。实验室兔子饮食高频5326 (LabDiet PMI营养国际)补充认证盖干草立方体(Bio-Serv Frenchtown,新泽西)和过滤自来水随意提供了通过一个自动浇水系统从在研究结束的到来。环境浓缩由各种各样的新鲜蔬菜每周至少一次,哑铃和不锈钢摇铃(Bio-Serv Frenchtown,新泽西)。供应商微生物监测健康报告表明,兔子血清学阴性以下病原体:汽车杆菌Encephalitozoon cuniculi,巴斯德菌multocida,梅毒cuniculi,口腔乳头状瘤病毒。兔子也不利于博代氏杆菌属bronchiseptica、沙门氏菌、克雷伯氏菌、柠檬酸杆菌属,piliformis梭状芽胞杆菌。动物是自由的内部和外部的寄生虫。 Before any experimental manipulations were initiated the rabbits were allowed to acclimate for at least 7 days.

2.1。归纳和管理糖尿病

兔子重每周在整个学习和权重都被记录下来。注射四氧嘧啶,兔子轻轻麻醉30毫克/公斤盐酸氯胺酮和甲苯噻嗪3毫克/公斤(IM)。人工泪液软膏(巴特勒动物卫生供应、都柏林、哦)应用于双眼的表面,防止干燥。体温保持了温水循环毯子(Gaymar T泵,Gaymar Industries Inc .,果园公园,纽约)。心率、呼吸频率、体温和热点₂监控,而动物麻醉和复苏。四氧嘧啶一水(西格玛奥德里奇化工、圣路易斯,密苏里州,美国)是溶解在无菌生理盐水浓度达到5% (W / V)和100毫克/公斤立即通过边际耳静脉注射静脉注射在一段2分钟25计蝴蝶导管。兔子被允许从麻醉中恢复过来。为了避免死亡率在血糖过低的阶段,四氧嘧啶管理nonfasted动物,食物和水是提供给动物麻醉后立即恢复。4、8和12小时后注射四氧嘧啶,10毫升的葡萄糖5% (W / V)皮下注射,和口服溶液提供了20%的葡萄糖在自来水通过水瓶随意确认后1 - 2天的低血糖(低于70 mg / dl),防止低血糖休克。在此期间访问自动浇水系统仅限于鼓励摄入口服葡萄糖溶液。兔子的血糖水平保持< 300 mg / dl超过一个星期后,初始注射四氧嘧啶收到第二个剂量的四氧嘧啶(100毫克/公斤(四)保持血糖水平> 300 mg / dl的持续时间的研究。血糖浓度测量每天1 - 2次使用血糖仪(寿命,Inc .苗必达CA)前4周,一旦每周早上之后。如果早上血糖水平(BGL)高于350 mg / dl,常规胰岛素(Novolin-R、诺和诺德制药公司普林斯顿,纽约)皮下注射(SC)每天一次30针规。胰岛素剂量调整根据血糖水平对个人兔子基于以下几点:(1)BGL < 400 mg / dl收到1 U /公斤,(2)BGL = 400 - 500 mg / dl收到2 U /公斤,(3)BGL = 500 - 600 mg / dl收到3 U /公斤,和(4)BGL > 600 mg / dl收到4 U /公斤)。 In animals with BG levels > 500 mg/dl, a second insulin injection (half of the morning dose) was administered in the late afternoon. Blood and urine samples were collected for biochemical analysis weekly for two months then monthly until the end of experiment. Blood was collected from the central auricular artery with a 25 gauge needle. For urine collection, clean cage pans were placed under the cages without liners, and urine was collected for 24 hours.

2.2。测定胰岛素剂量

由于个体差异和对胰岛素的敏感性,胰岛素剂量为每只兔子决定后不久诱导糖尿病。血糖曲线是由管理试验剂量的胰岛素(基于上述剂量率)后测量血糖浓度。血糖浓度是衡量每小时10小时的时候很明显,血糖水平持续上升曲线获得葡萄糖。如果血糖最低的是小于50 mg / dl或高于200毫克/分升,一个新的葡萄糖曲线得到第二天通过减少或增加胰岛素用量,直到最佳剂量。最后决心当一个葡萄糖胰岛素剂量曲线得到的峰值BGL > 350 mg / dl,槽BGL≥50 mg / dl。如果兔子出现症状的疾病(如食欲不振、流涎,或严重的减肥)在实验中,一个新的BG曲线得到实施和一个新的胰岛素剂量。

2.3。耳廓伤口愈合模型

评估长期糖尿病伤口愈合的影响,我们创建了全厚皮肤伤口的腹侧表面耳廓在糖尿病和非糖尿病患者年龄兔组在2周,一年使用微创手术技术(9,10]。简单地说,手术前一小时,兔子是皮下注射丁丙诺啡(0.03毫克/公斤),麻醉和监控如上所述。在无菌条件下,四个圆形全层伤口的每只耳朵上创建了一个6毫米不锈钢穿孔。之前恢复25μg / hr芬太尼透皮贴片(Duragesic, Ortho-McNeil,美国力登,新泽西),应用于皮肤在镇痛的肩膀。无菌生理盐水用于所有包扎了伤口。伤口被覆盖着Tegaderm(美国3 m、圣保罗、锰)。伤口敷料改变每天和数字照片,直到伤口被关闭。伤口被认为完全关闭时reepithelialized [9,10),进一步证实了组织学和形态学分析(11,12)使用Eclipse Ti尼康显微镜,尼康元素的软件。

2.4。生物化学分析

等离子体是通过离心20分钟的血液样本2500 g在4°C,并储存在−20°C到分析。等离子体的活性乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、血清总蛋白、胆固醇、甘油三酯(TG)、血尿素氮(BUN)测定,肌酐是化验使用罗氏Cobas米拉+化学分析仪(罗氏诊断系统公司、Branchburg NJ)。Beta-hydroxybutyrate (BHBA)也分析了一些样品。分析中使用的所有评议买来CATACHEM(美国布里奇波特,CT)。

24小时尿液样本收集如前所述。尿液收集记录的体积,其蛋白质含量进行了分析与罗氏Cobas米拉+化学分析仪。酮分析IDEXX VetLab (IDEXX开车,韦斯特布鲁克,我,美国)。

2.5。组织样本的准备

年底的12个月里,兔子使安乐死100毫克/公斤戊巴比妥(IV),组织样本来自胰腺,肝、肾、主动脉和组织学研究耳廓。样品固定在4%缓冲甲醛和嵌入石蜡。六个μm片是由石蜡块的苏木精和伊红染色组织学变化和评估。

2.6。统计分析

结果报告为平均值和标准偏差(SD)。学生的t以及被用来比较两组和方差分析被用于重复纵向测量与商用统计软件(GraphPad软件公司圣地亚哥,CA)。一个P<的价值。05年被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。动物

的20个alloxan-treated兔子,两个死于6和9个月二次肾功能衰竭。四个动物被用于伤口愈合速度的研究中,2和6的动物被用于一年的伤口愈合的研究。剩下的8只兔子还活着后12个月。

3.2。四氧嘧啶剂量和高血糖

基线nonfasting所有动物(血糖水平是正常的mg / dl)。后四氧嘧啶有管理的特征反应血糖水平(4]。在第一个2小时,血糖上升。第二阶段,观察到大约6小时后注射四氧嘧啶,是持续24 - 48小时的血糖过低的阶段。到那个时候动物们警惕,活跃,无助的吃和喝葡萄糖水。确定24小时连续观察是没有必要的。在我们的研究中,一些兔子的血糖下降到危及生命的水平(小于50 mg / dl)。然而,没有动物死于本研究的血糖过低的阶段。第三阶段是持续的高血糖。的20个alloxan-treated兔子,血糖水平通常在48小时内增加了300 mg / dl接收四氧嘧啶。两周后,糖尿病动物被分成三个组根据他们早上血糖水平:300 - 400 mg / dl (),轻度糖尿病组;401 - 500 mg / dl (),中度严重糖尿病组;大于501 mg / dl ()、严重糖尿病组。我们发现,轻度组动物表现出体重增加很快但是他们的血糖水平下降低于300 mg / dl 3 - 8周后第一次注射四氧嘧啶,和第二次注射四氧嘧啶是必需的。十二种动物需要第二次注射四氧嘧啶保持持续的高血糖(> 300 mg / dl)。一个有趣的发现是,第二次注射四氧嘧啶并没有引起低血糖症的特点后,观察四氧嘧啶的初始剂量。因此动物收到第二个剂量的四氧嘧啶不需要葡萄糖补充。收到第二个剂量的四氧嘧啶幸存下来的所有动物,直到实验结束。

3.3。胰岛素剂量和葡萄糖浓度

在大多数的兔子,血糖浓度是相对可预测的模式。胰岛素注射后,血糖达到槽(70 - 150 mg / dl)注射后2小时。四个小时后胰岛素BG水平开始上升,在6小时内> 300 mg / dl,第二天早上在接下来的胰岛素注射前达到顶峰。兔子的同时保持高血糖的状态是16个小时。同时,兔子是normoglycemic每天8小时。

3.4。体重

基线是兔子的体重公斤。食物摄入量没有测量在这项研究中,然而粪便输出被饲养人员每日评估,任何减少从正常生产带来了导演的注意研究和临床兽医。尽管血糖水平非常高,有一个倾向体重增加在所有的糖尿病的兔子。之间似乎有负相关关系的最高血糖水平观察和身体体重增加。年底的12个月里,他们的身体重量范围从3.12到4.18公斤,而与非糖尿病的兔子的身体重量范围从4.86 - -5.96公斤。糖尿病兔的体重增加显著低于同龄非糖尿病的兔子()。

3.5。多尿症和蛋白尿

多尿症和蛋白尿是糖尿病的特点。糖尿病诱导兔子后,尿量有显著增加(,图1(一))和尿蛋白(,图1 (b)与基线相比)。

3.6。肾脏功能障碍

等离子体水平的血尿素氮(BUN)和肌酐增加糖尿病感应(数据1 (c)和1 (d))。糖尿病之间有显著差异,与非糖尿病的兔子在9个月(面包和肌酐)和12个月(面包和肌酐)。

3.7。高脂血症

血浆胆固醇和甘油三酯水平增加在所有糖尿病兔子。糖尿病之间有显著差异,与非糖尿病的兔子在9个月(对胆固醇和甘油三酸酯)和12个月(对胆固醇和甘油三酸酯,数据2(一个)和2 (b))。

3.8。血浆酶水平

大多数的等离子体的ALT水平,AST, CK, LDH和在正常范围;然而有时水平升高在单独的兔子。此外,血浆总蛋白在正常范围虽然蛋白尿是观察(表1)。

3.9。酮症酸中毒和尿酮症

糖尿病酮症酸中毒是通过增加血液beta-hydroxybutyrate (BHBA) [13]。当血糖峰值水平高于500 mg / dl,有时BHBA水平增加到超过10 mg / dl,甚至大于40 mg / dl(酮症酸中毒(图)3)。酮也出现在一些严重糖尿病患者的尿液兔子的血糖水平峰值大于500 mg / dl。

3.10。伤口愈合

在兔子受伤后两周诱导糖尿病伤口关闭时间往往是长(比与非糖尿病的兔子(天)天),但差异无统计学意义()。然而,在兔子,糖尿病已经一年,伤口关闭时间(天)显著长于与非糖尿病的兔子(天)(,图4)。

3.11。其他并发症

在研究一些动物表现出厌食,体重严重下降,流涎,虚弱和嗜睡。这些都是由过度过度或低血糖引起的,它们是通过调整胰岛素剂量治疗。四个兔子患有轻微的贫血,血红蛋白之间7 - 9 g / dl。动物没有治疗贫血,因为它并不严重。

3.12。病理变化

组织病理变化,有糖尿病的动物一年图所示5。显示胰腺β细胞损伤和动脉内膜增厚。肾脏显示透明小动脉硬化。非晶态,均匀嗜酸性物质在传入肾小球小动脉的血管壁增厚和内腔明显缩小(箭头所指)。肾小球萎缩也在场。在肝脏,肝细胞的脂质堆积在细胞质中出现在液泡(肝脂肪变性)。主动脉媒体证实轻度钙化在小地区。

4所示。讨论

据我们所知,这是迄今为止最大的糖尿病组兔子保持科学研究一年或更长时间。长期的糖尿病动物模型有很多潜在的好处。我们的经验表明,经过精心管理,alloxan-induced糖尿病可以保持一年或更长时间的兔子健康状况良好。生化和组织学的变化表示良好的糖尿病。

许多研究已经进行了糖尿病兔子在很短的时间在过去的几十年。然而,短期糖尿病兔子已经严重限制了糖尿病研究能力因为人类糖尿病持续几十年,许多糖尿病并发症需要数年时间来开发。PubMed搜索显示只有少数报道糖尿病兔子被保留为3 - 6个月药理学或生长因子的研究14- - - - - -18]。只有一条被发现3只兔子在保存12个月研究主动脉内膜中层alloxan-diabetic兔子的19]。由于许多并发症,长期糖尿病兔子的管理是劳动密集型的,昂贵的,有很高的技术,减少了动力去执行这些研究在很长一段时间。

toxin-induced糖尿病兔子第一管理四氧嘧啶邓恩和Mcletchie [20.)通过研究挤压症候群在兔子调查一系列的影响尿酸衍生品包括四氧嘧啶对肾脏损害。动物收到四氧嘧啶12小时后进入昏迷,并与高血尿素和低体温过低的血糖值。注射后不久有高血糖。组织学检查发现预期的肾脏损害的早期迹象。一个意想不到的发现是一个部分或全部胰岛细胞的坏死。其他组织没有损伤,并且逐渐采用四氧嘧啶糖尿病产生的动物。在我们的研究中,alloxan-induced糖尿病动物表现出人类糖尿病的典型症状,如高血糖、糖尿、烦渴、多尿症,体重损失尽管多食症,高血压、酮尿,酸中毒。

四氧嘧啶的管理有一个特征反应血糖水平(4]。在第一个2小时,血糖上升。这短暂的高血糖被认为是由于突然肝脏中糖原分解(21]。肝糖原的分解的原因在此阶段是未知的,但可能是肾上腺素释放的次生效应。第二阶段是血糖过低的阶段,可能严重到足以导致死亡如果不是预防或治疗补充葡萄糖(4,22]。低血糖症是由于突然流露出胰岛素β细胞死亡(21]。低血糖通常出现后6小时(23]。在禁食动物(低血糖更明显24]。

这两个有毒的易感性和四氧嘧啶致糖尿病的剂量不同不仅在不同的物种,而且在同一动物种群的(25,26]。安全的四氧嘧啶致糖尿病的剂量的范围在一个特定的动物很狭窄,甚至光用药可能有毒,导致死亡。这些损失可能是因为肾脏肾小管细胞坏死的毒性,尤其是当进行高剂量的四氧嘧啶(27]。四氧嘧啶的剂量(100毫克/公斤)用于本研究致糖尿病的和更少的有毒。然而,这种剂量并不一定产生稳定的糖尿病兔(28]。百分之六十的兔子在这项研究中需要一个剂量的四氧嘧啶保持持续的高血糖,和所有这些动物幸存下来,直到实验结束。康复糖尿病被提议的结果一个乘法的β细胞生存的初始注射四氧嘧啶或形成新的导管上皮细胞的胰腺的外分泌部分(29日,30.]。另一个可能的解释是,有精神压力引起的初始注射四氧嘧啶高血糖时由处理的动物。已经表明,高血糖可以防止alloxan-induced损伤(31日]。兔子还表明男性比女性更可能经历压力诱导高血糖兔子(32),这可能导致了很高比例的兔子需要第二剂量四氧嘧啶。在未来的研究中,我们计划立即测量血糖水平的兔子政府之前四氧嘧啶能够更好地预测那些动物,可能需要一个剂量的四氧嘧啶以及增加处理,他们收到的数量在适应期间为了减少的百分比需要第二个剂量的兔子。由于未经治疗的糖尿病患者并发症发生率高于监管的糖尿病患者,我们选择用胰岛素治疗兔子在这项研究增加兔子的生存时间,但我们没有完全规范糖尿病。正常血糖水平维持平均每天8小时,和高血糖的状态保持的意思是每天16个小时。因此这个模型可能更紧密地代表一个监管不力的糖尿病,因为血糖波动模型已被证明导致组织损伤比稳定高血糖(33]。

基于高血糖症的严重程度,我们将兔子分成三组,那些有轻微、中度严重,和严重的糖尿病。每组表现出某些特征在整个研究过程中生理变化。轻微的糖尿病组,身体重量增加很快,生化值通常是在正常范围内,动物BG回到水平< 300 mg / dl,他们需要第二次注射四氧嘧啶。严重的糖尿病组,身体重量增加非常缓慢和生化值大多是异常包括高发髻,贫血由于肾脏功能障碍(34),血脂异常(35有时,酮症酸中毒(36]。中度严重糖尿病组,观察到的变化是一个结合上述两组和他们的血糖水平更易于管理。

除了长期高血糖糖尿病兔子,我们观察到糖尿病的其他特征。尽管所有的兔子在这项研究中获得了体重,获得的糖尿病兔子还不到年龄的获得观察动物。四氧嘧啶政府之前,身体重量范围从2.0到2.5公斤。一年以后,他们只增加到3.5 - -4.0公斤,体重与正常4-5-month老兔子。然而,与非糖尿病患者的体重兔子在这项研究中增加到超过5.0公斤一年后即符合正常的增长速度由供应商提供。体重的增加在这项研究中,虽然小,但似乎不同于以往的研究,许多糖尿病兔子减肥。大量的先前的研究利用兔子,3 - 4个月大的时候,被认为是年轻人。我们发现体重增加类似报道Goseki et al。16利用年轻兔子,10周的年龄类似用于我们的学习。因为体重变化是全身的反射功能,维持适当的体重可能是兔子长期生存的一个重要因素在糖尿病状态。血浆胆固醇和甘油三酯水平增加糖尿病兔子在这个研究。这些发现与以前公布的研究结果相一致35]。我们还发现一些糖尿病动物患有贫血。这些兔子都有肾功能不佳,这类似于人类临床病人由于红细胞生成素减少产量受损的肾脏(37]。

组织学变化观察到动物一年是典型的糖尿病损伤。除了胰岛损伤,微观横截面上的胰腺动脉显示血管壁增厚这表明这个器官的动脉粥样硬化。主动脉的主动脉,微观部分媒体证实轻度钙化在小范围也表明动脉粥样硬化。类似的变化也在肾脏,传入的肾小球小动脉壁显著增厚,管腔变窄。在肾脏肾小球萎缩也存在。在肝脏,肝细胞的脂质堆积在细胞质液泡。所有这些组织学变化符合那些在长期糖尿病患者可能不会出现在动物糖尿病短时间的。

人类糖尿病最常见的并发症之一是溃疡的四肢,一直受到众多的实验研究。然而,这些研究都存在着一些局限性,很难推断动物结果临床设置。一个是动物糖尿病,这段时间,另一个是糖尿病溃疡的病因。众所周知,人类糖尿病溃疡的几年,甚至几十年的糖尿病。神经病变,血管病变、免疫功能紊乱和生化异常都会导致糖尿病患者(慢性伤口的发展38,39]。到目前为止,没有一个动物模型用于糖尿病伤口研究人类糖尿病伤口都有相同的特征除了高血糖。的时间长度,兔子一直保持高血糖的状态在大多数兔子伤口愈合的研究非常有限,最短几天,最长的是两个月。这些短时间内持续高血糖不能繁殖的变化观察到在人类糖尿病。为了测试的时间是否高血糖对伤口愈合有任何影响,我们在糖尿病伤口愈合次兔子和与非糖尿病患者相比动物两周,一年。到目前为止对伤口愈合的区别在短期高血糖和长期糖尿病8]。在目前的研究中,短期高血糖(2周)出现延迟愈合过程在某种程度上比非糖尿病的兔子,但这种差异没有统计学意义。糖尿病兔子,然而,在为期一年的伤口的关闭时间明显长于与非糖尿病患者的伤口。我们的研究结果似乎表明,伤口愈合时间是糖尿病的长度乘以比例。一种系统性的高血糖状态,如糖尿病,在众多方面可能会影响伤口关闭。等文献中描述过一些假设的形成糖化终端产品(40],hyperosmolarity [41),和改变胰岛素信号以不同的方式(42]。然而,高血糖独自发挥有限的作用在许多慢性伤口无法愈合的状态,而其他病理生理变化需要更长的时间来培养。如果一只兔子的寿命是5 - 8年,一年可能相当于15 - 20年的人类生活,尽管这样的一个近似,则是将事情过于简单化了。生化和组织学的变化中发现本研究提供一些证据来模仿人类糖尿病的变化;糖尿病的动物模型比这更长一段时间它是更常见的出版提供了更多的功能更接近人类糖尿病的变化。

总之,小心谨慎的管理包括适应性和重复注射四氧嘧啶,精确调整胰岛素剂量,监测体重和生化值,执行血糖曲线,并调整胰岛素剂量动物出现异常症状,一旦alloxan-induced糖尿病可以保持一年或更长时间的兔子健康状况良好。这样一个模型在科学研究糖尿病可能是有用的。

确认

这项研究部分由国家卫生研究院的基金支持DK74566 AR52984。作者要感谢提供出色的支持和兽医护理的动物在我们的兽医技术人员研究资源研究设施。