文摘

评估性能的干血滴(dbs)和随后的分析谷氨酸脱羧酶(先后)和胰岛antigen-2 RSR-ELISAs (IA-2A),我们选择了80名新诊断为1型糖尿病的儿童和120名健康女性。星展银行从病人和控制用于RSR-ELISAs而患者样本分析也内部ria。RSR-ELISA-GADA表现良好的特异性为100%,尽管敏感性(46%)较低而在RIA (56%; )。没有前区稀释后观察效果有差异的样本。RSR-ELISA-IA-2A实现特异性为69%,敏感性较低(59%)与RIA (66%; )。消极的或低积极病人和控制样品稀释后的RSR-ELISA-IA-2A增加。洗出液从星展银行随时可以用于分析与RSR-ELISA先后,即使没有检测到低水平的自身抗体。一些因素可能会扰乱RSR-ELISA-IA-2A分析。

1。介绍

抽样的血作为临床使用的干血滴(dbs)是目前用于先天性代谢紊乱等多种疾病,糖尿病和艾滋病毒感染(1- - - - - -4]。有很多好处在使用DBS-technique随后洗脱有关易于收集,运输/储存、小血液量,最小的侵袭性与血清样本。DBS-technique便利抽样程序自可以使用毛细管采样。毛细血管的血液抽样需要较少的技能和减少供应,它甚至可以用于糖尿病患者在家里如果他们是用来测量自己的血糖水平。星展银行可以很容易地寄样品由于没有泄漏的风险。运输和短时间内存储可以在室温下(5,6]。在许多国家,所有新生儿筛查苯丙酮尿症,半乳糖血症,先天性甲状腺功能减退,使用干血滴和其他代谢紊乱,表明该技术适用于大规模分析(7- - - - - -9]。DBS-samples可以用于遗传因素(基因)10)和蛋白质(酶和抗体)5,11]。

五个描述1型糖尿病胰岛自身抗体是已知的,即胰岛细胞抗体(ICA),胰岛素自身抗体(IAA)、谷氨酸脱羧酶抗体(先后),胰岛antigen-2抗体(IA-2A)和β细胞特定的抗体zink-transporter (ZnT8A) [12]。第一个四个特点和几个车间已开展标准化的测量血清中自身抗体(13- - - - - -15]。内部ria和RSR-ELISA包都建立了分析的先后以及IA-2A。RSR-ELISA包显示高性能先后和IA-2A在血清样本15), 治疗也可以使用等离子体(16,17]。2005年DASP RSR-ELISA-GADA包和RSR-ELISA-IA-2A工具包实现高灵敏度和特异性(15]。对于RSR-ELISA-GADA包 灵敏度变化从84%到94%,特异性血清样本从97%降至99%。RSR-IA-2A-ELISA工具包,灵敏度范围从64%到68%,特异性血清样本从98%降至100%。2005年DASP,我们内部RIA-GADA化验了敏感性为76%,特异性为91%血清样本,以及我们内部RIA-IA-2A化验了敏感性为72%,特异性为100%。先后创作和分析了IA-2A全血洗出液与高绩效(RIA化验18,19]。

在这项研究中,我们想要测试如果先后和IA-2A可以分析从全血与RSR-ELISAs洗出液。如果这些化验显示高演出,先后和IA-2A使用ELISA的测量有可能应用于大规模筛查项目识别个体患1型糖尿病的风险。

2。材料和方法

2.1。主题

干血滴(DBS)得到EDTA-blood发现到过滤形式(Parajett, Parajett AB, Landskrona,瑞典,过滤器从Schleicher和Schuell Dassel,德国)和脱水前运输到实验室。至少60 L血液需要填补过滤器上的标记圆圈。

一个随机选择的研究人群包括用新诊断为1型糖尿病的儿童 ;平均年龄10岁;距离最近;M / F = 1.29)和健康控制女性获得五本地区产科诊所描述(20.] ;平均年龄32岁;范围19-44)。病人的(dbs)被存储在室温下的平均56天(范围8 - 150)和(dbs)控制存储了18天的中值(范围5-57)前冲和后续进行洗脱。

所有样品在知情同意下,隆德大学伦理委员会批准,隆德。

2.2。样品制备

盘直径6毫米被打了一个特殊的冲压设备(Wallac Delfia干血滴穿孔机刺激。1296 - 071年,芬兰图尔库Wallac)。四盘穿孔从每个样本到单独的井。总共有80 TBST-buffer L(150更易与L氯化钠,更易与L三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.4,Tween20 0.15%, 0.1% BSA)被添加到每个。样本留在plateshaker (Delfia plateshaker 1296 - 003, Wallac,图尔库,芬兰)在500 rpm, 过夜。第二天早上,全血洗出液旋转下来(1分钟,1500年 400 g, Labofuge,贺利氏,Langerbold,德国)。全血是洗出液汇集成一个Eppendorf-micro管和旋转10000 g 10分钟去除细胞碎片。

2.3。化验
2.3.1。RSR-ELISA化验

先后RSR-ELISA工具包(GDE / 96)和IA-2A /管理学院(96)(RSR有限公司Pentwyn、卡迪夫、英国)被用于分析的先后和IA-2A。分析是根据制造商的指示执行,除了全血洗出液等量的推荐用于血清。光密度是读一个ELISA platereader (E-max, Multical platereader,分子设备公司,门洛帕克,CA,美国)在450海里,与软件Multicalc(美国优秀,沃尔瑟姆,MA)。

对世卫组织参考标准校准NIBSC ( )先后试验(21]。高值( 250单位/毫升)取代250年统计和临床评价。截止级别设置为5人先后创作单位/毫升,这是最低的标准浓度也由制造商推荐的截止血清样本。

还为IA-2A标准校准与NIBSC ( )。高值( 400单位/毫升)取代400年统计和临床评价。截止级别被设置为15为IA-2A单位/毫升,这是最低的标准浓度也由制造商推荐的截止血清样本。重复抽样包括整个preanalytic过程进行了十个学科先后和IA-2A。变异系数(CV)计算标准差和均值的比值为重复。这些观测值的中位数为6.3%(0.76 -13)先后在5.0 - -46.4范围的单位/毫升。Interassay变异为同一样品在两个重复平均7.7%(范围1.8% - -40%)。IA-2A平均5.0%的简历(范围0.77 - -15)在15 - 25单位/毫升。Interassay变化在两个重复平均46%(范围25% - -88%)。

样品与高水平的抗体(先后或IA-2A)内部RIA,但低稀释的ELISA透露如果可以验证这一发现或者是由于前带的效果。前区效应是著名的为ICA干扰浓度(22,23]。

2.3.2。内部RIA先后和IA-2A

整除的30 L(全血洗出液得到使用中描述的过程样品制备和被添加进井30 L (35S-radiolabelled抗原(GAD65或IA-2)和孵化隔夜plateshaker (500 rpm) 。第二天早上,盘子旋转1分钟1500 g。重复50 L antibody-antigen-complex-solution被添加到50 L 20% rProtein琼脂糖快流(Amersham生物科学,乌普萨拉,瑞典)和孵化为90分钟 在plateshaker (500 rpm)。抗原过剩是被反复洗盘子(8次冷TBST-buffer)使用一种特殊的清洗设备(多屏幕真空垫圈,微孔,贝德福德,妈,美国)。盘子被风干了30分钟,前50 L闪烁液(Optiphase Supermix闪烁液,PerkinElmer生命科学、波士顿,MA,美国)之间。在β放射性测量计数器(Microbeta计数器,PerkinElmer生命科学,波士顿,MA,美国)。

Logaritmic标准曲线用于先后试验和IA-2A化验。我们实验室使用世卫组织推荐的当地标准。高于50 WHO-Units /毫升样品被视为积极的在先后试验样品10 WHO-Units /毫升以上IA-2A化验。这些截止限制使用先前定义的健康个体的结果。先后创作水平的500单位/毫升和250单位/毫升IA-2A水平被认为是作为样品分析的端点与RIA和没有进一步稀释。

重复的简历中位数为3.5%(0-15范围; 先后和interassay变异为10.1% ( 35岁)的样本单位/毫升。另一个样本的96单位/毫升,简历中值为3.1%(范围划分的; )和interassay变异为8.7% ( )。

重复的简历中位数为3.7%(范围清廉: IA-2A和interassay变异为7.8% ( )24人的样本单位/毫升。另一个样本的155单位/毫升的简历中值为2.7%(范围划分: )和interassay变异为9.7%。

2.3.3。统计分析

结果报告为中位数、四分位范围和最小和最大因为并不是正态分布。如果P值是 一个显著差异是接受。Wilcoxons签署等级测试用来测试在多屏画面等等变量重复测量的差异。

mcnemar检验法测试用于测试的不同二项式成对观测(积极的和消极的结果)。

3所示。结果

3.1。RSR-ELISA-GADA分析特征测量从全血洗出液

5.0 WHO-Units /毫升的阈值与特异性为100%,敏感性为46% ( ;表1)。总共8样本显示250单位/毫升的浓度或更高,这些样本稀释,最终222 - 2460 WHO-Units /毫升的浓度。

表1
估计的先后和IA-2A积极性。积极的和消极的患者(80新诊断为1型糖尿病的儿童;平均年龄10;范围最近年)和控制(120名健康女性;平均32;从瑞典范围19-44岁)。
3.2。比较RSR-ELISA-GADA和内部RIA使用病人的样本

RSR-ELISA-GADA实现低灵敏度46% ( 与内部RIA 56%(相比) ; ;图1)。所有样品( )积极RSR-ELISA-GADA也积极的内部RIA。不和谐的样本都是低水平阳性样品内部RIA ( ;53 - 125范围WHO-Units /毫升;阈值50 WHO-Units /毫升)。12个样本高分析时内部RIA(范围198 - WHO-Units /毫升)但RSR-ELISA相对较低(范围7.3 -46 WHO-Units /毫升)。这些样品被稀释,但检查前区效应水平类似稀释后(10-52范围; )。先后创作水平有一个相关病人的样本中发现积极的在化验( ; ; ;图2)。此外,先后创作水平分析double-positive样本内部的RIA ( ;中位数 单位/毫升;四分位范围235 - 与ELISA)相比,先后创作水平分析( ;平均32个单位/毫升;四分位范围11 - 189; )。


图1
先后创作水平检测ELISA和RIA化验。切断水平虚线所示。

图2
先后创作水平相关病人的样本积极RSR-ELISA和内部RIA ( ; ; )。
3.3。RSR-ELISA-IA-2A分析特征测量从全血洗出液

使用截止15 WHO-Units /毫升的特异性为69% ( )和灵敏度为59% ( ;表1)。总共16个样本400单位/毫升或更高,稀释后的最终浓度样本从365年到3430年WHO-Units /毫升。

3.4。比较RSR-ELISA-IA-2A和内部RIA使用病人的样本

RSR-ELISA-IA-2A实现低灵敏度59% ( 与内部RIA 66%(相比) ; ;图3)。五低水平正样本RSR-ELISA-IA-2A(17-35单位/毫升)-在内部RIA。11个样本积极只在内部RIA(范围17 - ),这些样本的6 214单位/毫升或更高。我们重新分析两个高水平的不和谐的样品积极在RIA但消极ELISA(左)样品材料和另外四个样品高IA-2A RIA ( ;范围193 - WHO-Units /毫升)但RSR-ELISA低( ;范围11-36 WHO-Units /毫升)。在所有样品(稀释IA-2A水平提高后 ;射程113 - 516 WHO-Units /毫升; RSR-ELISA-IA-2A)分析。四个病人的样本都是消极的内部RIA,其中三个是低水平积极RSR-ELISA,另一个是消极的( ;范围11-35 WHO-Units /毫升)被稀释,重新分析RSR-ELISA也在这种情况下,水平增加( ;范围82 - 888 WHO-Units /毫升)。此外,10个控制样本发现明显负面RSR-ELISA ( ;范围8日至13日WHO-Units /毫升)也被稀释和重新分析也在这种情况下,高水平当稀释(范围29 - 127 WHO-Units /毫升; )。共有42个样本化验是积极的。之间存在弱相关IA-2A双阳性样品分析与ELISA和RIA ( ; ; ;图4)。然而,对于IA-2A双阳性样本,水平类似的内部RIA ( ;中位数 单位/毫升;四分位范围 - - - - - - )与ELISA(中位数162单位/毫升;四分位范围44 - ; )。


图3
IA-2A水平检测ELISA和RIA化验。切断水平虚线所示。

图4
微弱的相关性被发现在IA-2A水平正样本RSR-ELISA和内部RIA ( ; ; )。
3.5。结合灵敏度先后和IA-2A内部RIA和RSR-ELISAAs

先后和IA-2A测量结果结合内部ria检测1型糖尿病的敏感性增加79% ( ; )。同样,先后和IA-2A测量结果结合RSR-ELISAs敏感性增加到71% ( ; )和预期特异性下降到69% ( )。

4所示。讨论

在这项研究中,我们比较内部ria与商业elisa分析先后和IA-2A从全血洗出液定性和定量。我们发现特异性RSR-ELISA-GADA非常好(100%),而灵敏度较低(46%)与内部RIA (56%)。不和谐的样本中消极的内部RIA RSR-ELISA-GADA低水平是积极的。此外,先后创作水平低在RSR-ELISA化验样本发现是积极的。样品发现有内部RIA先后创作水平高,但低RSR-ELISA重新进行稀释,但水平没有提高。这些发现表明,样品中积极RSR-ELISA-GADA整合内部RIA的测量。然而,先后RSR-ELISA未能检测到低水平。较低的频率和低层次的先后积极的样品可以是由于干扰全血血红蛋白或其他因素。测量的可能性非常高的自身抗体水平几乎没有在常规临床实验室的重要性,但可以干预的兴趣研究旨在减少自身抗体水平(24]。

RSR-ELISA-IA-2A特异性很低(69%),同时RSR-ELISA-IA-2A的敏感度较低(59%)与内部RIA (66%)。不和谐的患者样本中,大多数是高度积极的内部RIA。当两个不和谐的样品和其他四个病人的样本发现低水平的积极或消极RSR-ELISA-IA-2A RSR-ELISA被重新进行稀释,水平显著增加。当十控制样本重新进行稀释,IA-2A水平增加。我们相信全血血红蛋白或其他因素干扰的测量抗体,通过直接绑定到抗原或抗体或通过色差光学密度的影响,尽管我们还没有完全检查血红蛋白在这项研究的影响。必须牢记,这些商业套件是推荐分析血清自身抗体。我们的研究的一个限制是,我们还没有分析配对血清和DBS样本病人和控制。然而,一组类似的病人血清样本显示RSR-ELISA-GADA性能优良,IA-2A在我们的手17]。我们内部ria先后和IA-2A实现高敏感性(76%和72%),优秀的2005年DASP特异性(15]。RSR-ELISAs先后和IA-2A最近建立的临床化学,乌玛,马尔默和没有受到国际标准化。我们研究的另一个可能的限制是我们参考的人口只包括女性。尽管如此,先后已被证明是更频繁地发现在1型糖尿病的女性比男性和女性的水平也比较高(25,26]。分娩前的样品被吸引在这些女性作为控制人口。怀孕可以减少免疫反应,但先后发现了妊娠糖尿病妇女在更高的频率比一般人群(27]。因此,我们假设我们没有有限的能力检测先后积极的主题在本参考人口使用截止限制制造商推荐的。

我们还没有完成一个特定的研究再现性随着时间的推移,由于有限的标本。然而,先后和IA-2A自身抗体的免疫球蛋白类型(28)和hiv抗体(29日]。hiv抗体显示良好的再现性长达六个星期的时间在不同的存储条件(室温, ,− ,− ,37 - )[6]。总IgE也证明是稳定重复冻结/解冻周期(5]。糖化血红蛋白,另一个蛋白质与DBS-technique经常用于分析,表明低(少于2%)在不精确静脉和毛细血管抽样(1]。此外,我们的研究结果表明,强劲的溶血可能干扰分析使用RSR-ELISA IA-2A。血红蛋白可能导致低敏感性RSR-ELISA-GADA但特异性是优秀的在这种情况下。

总之,先后创作的RSR-ELISA可以用于测量全血洗出液以可靠的方式即使敏感性较低而内部RIA。一些因素可能会扰乱RSR-ELISA-IA-2A分析。

确认

克努特和爱丽丝•瓦伦堡基金会是承认的研究资助这项研究做出贡献。作者要感谢专家技术援助从Ulrika Gustavsson Nils-Goran佩尔森。教授Ake Lernmark感谢批判性阅读手稿和评论。