文摘
我们表明,抑制中性肽链内切,一个蛋白酶降解vaso刺激神经组织的肽,改善血管和神经功能在糖尿病动物模型。在这项研究中,我们探索了棉结的作用在神经病变有关insulin-deficient糖尿病或食源性肥胖使用棉结不足(−−)老鼠。初步研究表明,链脲霉素,在缺乏后续的高血糖,并未引起神经传导减慢或爪热痛觉减退。葡萄糖处理受损C57Bl / 6和棉结−−老鼠喂食高脂肪的饮食。热痛觉减退和神经传导减慢在场streptozotocin-diabetic和高脂肪喂养C57Bl / 6小鼠而不是棉结−−/老鼠暴露在体外糖尿病或高脂肪的饮食。这些研究表明,链脲霉素诱导小鼠的神经毒性,棉结不扮演重要角色在调节神经功能insulin-deficient糖尿病和食源性肥胖。
1。介绍
周围神经病变影响糖尿病患者以及患者葡萄糖耐量和被认为是前驱糖尿病人(1- - - - - -5]。糖尿病周围神经病变是最常见的原因(5]。然而,大约三分之一的神经病患者没有可识别的病因虽然40%的病人有葡萄糖耐量(5]。糖尿病神经病变被认为是一种多因素疾病引起的异常代谢活动之间的相互作用和血管功能受损2,6,7]。周围神经病变的病因患者葡萄糖耐量尚不明朗。然而,它已经表明,改善代谢产生的积极治疗规范化葡萄糖,高血压,高脂血症病人减少神经性疼痛组(5]。
我们的研究主要集中在角色使用糖尿病周围神经病变的血管功能障碍动物模型以及肥胖动物模型(8- - - - - -10]。在1型和2型糖尿病大鼠我们已经表明,受损的血管反应性之前确定的神经功能障碍的发展减少了神经传导速度(8- - - - - -11]。最近我们发现,中性肽链内切酶的表达在坐骨神经神经外小动脉增加糖尿病和用AVE7688治疗糖尿病动物模型,vasopeptidase抑制剂,改善血管和神经功能12,13]。此外,它已经表明,vasopeptidase抑制剂神经保护和防止糖尿病肾病大鼠(14- - - - - -17]。Vasopeptidase抑制剂是一类新的药物,同时抑制中性肽链内切酶和血管紧张素转换酶活性(18]。中性肽链内切酶降解许多血管活性的多肽包括利钠肽,adrenomedullin,缓激肽,降钙素相关基因肽(19]。中性肽链内切酶存在于许多组织包括血管和肾组织及其活动增加了脂肪酸和葡萄糖在人类微血管细胞(20.- - - - - -24]。周围神经系统的中性肽链内切酶位于许旺细胞细胞膜周围的背根神经节细胞和神经纤维(25,26]。在中枢神经系统中性肽链内切酶与神经组织而不是星形胶质细胞(25]。高水平的酶存在于所有新生儿和早期产后雪旺细胞髓鞘形成收益逐渐压制在大多数细胞形成髓鞘,但保留在nonmyelin形成细胞在成年动物26]。Kioussi等人发现,轴突损伤后中性肽链内切酶是重新远端损伤(26]。这些作者表明,中性肽链内切酶可能在轴突再生方面发挥作用26]。进一步探索中性肽链内切酶的作用在糖尿病或肥胖引起的周围神经病变,我们使用中性肽链内切酶缺乏的老鼠进行研究。我们假设因为糖尿病/肥胖将无法增加中性肽链内切酶在这些小鼠神经功能保护糖尿病或高脂肪喂养中性肽链内切酶缺陷的老鼠。坐骨神经传导速度减慢和长时间的爪子被用作热响应延迟的大型和小型纤维功能障碍指数,分别在streptozotocin-treated和高脂肪喂养小鼠模型的周围神经病变后证明这些疾病并不直接体外实验的结果神经毒性。
2。材料和方法
除非另有说明在这些研究中使用的所有化学品得到从西格玛化工有限公司(圣路易斯,密苏里州)。
2.1。动物
C57Bl / 6野生型老鼠从杰克逊实验室和购买瑞士韦伯斯特老鼠从哈伦购买实验室。育种对中性肽链内切酶缺陷(棉结/陆等人提供的)老鼠和背景在C57Bl / 627]。这些老鼠繁殖和殖民地退伍军人事务医学中心创建,爱荷华州的城市,爱荷华州。C57Bl / 6和棉结/小鼠年龄匹配的研究。中性肽链内切酶活动的缺乏是老鼠用于证实这些研究通过测量中性肽链内切酶的具体活动在肾脏匀浆使用Ayoub和Melzig[描述的方法28与修改)。中性肽链内切酶的活性在肾脏C57Bl / 6和棉结/老鼠是2.32±0.11,0.18±0.06 M 7-amido-3-methylcoumarin (AMC) /分钟/分别为g蛋白(由未配对与C57Bl / 6以及)。
老鼠被安置在一个认证动物保健设施和食品(哈伦Teklad, # 7001,麦迪逊,WI)和水随意提供。采取了足够的措施来减少疼痛或不适,所有的实验动物福利和符合国际标准是符合所有机构和国家研究委员会的动物使用指南(ACURF协议0802033)。
初步研究了解决链脲霉素引起直接的神经毒性,是否独立缺乏诱导胰岛素和高血糖。这项研究是由两个不同的实验室(Yorek和Calcutt)使用两种不同菌株的老鼠。小鼠C57Bl / 6和瑞士韦伯斯特在12周的年龄被分为三组。第一组是治疗作为对照组。第二组是治疗链脲霉素在盐水(150毫克/公斤ip单剂量的C57 Bl / 6小鼠连续两天或90毫克/公斤ip瑞士韦伯斯特老鼠)诱导糖尿病。第三组是治疗3-O-methylglucose(5.5更易与身体wt /公斤,i.p)。大约一分钟之前每个链脲霉素注射预防胰腺上的链脲霉素的影响细胞(29日,30.]。糖尿病被评估验证96小时后血糖水平使用葡萄糖脱氢酶试剂条(Accu-Chek,罗氏诊断,印第安纳波利斯)。神经功能评估后8(瑞士韦伯斯特)或12 (C57Bl / 6)周的糖尿病。
的研究缺失的影响NEP基因C57Bl / 6和棉结/老鼠在12周的年龄被分为三组。美联储一组标准的食物的饮食。第二组是美联储的饮食含有60%千卡,脂肪(D12492,研究饮食,新布伦瑞克,新泽西州)。第三组是治疗链脲霉素在盐水(150毫克/公斤ip)诱导糖尿病。小鼠血糖水平的300 mg / dL(16.7毫米)或更高版本被认为是糖尿病。实验时间持续12周。
2.2。葡萄糖耐量
前行为和神经传导研究控制和高脂肪喂养小鼠禁食过夜葡萄糖利用率的研究。老鼠注射生理盐水含2 g / kg葡萄糖,i.p。立即葡萄糖注射液和前120分钟之后血液样本被送往测量循环葡萄糖水平。
2.3。热疼痛的反应
前一天的终端研究热疼痛的反应hindpaw测量使用哈格里夫斯IITC生命科学所提供的方法和仪器;林地,CA(型号390 g)或UARD(圣地亚哥)。执行的测试是在可能的情况下盲目的方式。热疼痛的反应被把鼠标放在观察测量室的热试验装置和让它适应温暖的玻璃表面(),环境一段15分钟。移动热源的治愈下是机动,hindpaw然后激活,这一过程激活一个计时器和当地温暖的玻璃表面,当鼠标撤回了爪子,计时器,热源处于关机状态(31日]。最初的记录后,丢弃,四为每个hindpaw测量了,每组之间休息一段5分钟的测量。测量的均值,报告在几秒钟内,被用作衡量热疼痛的反应延迟。
2.4。运动和感觉神经传导速度
与戊巴比妥钠小鼠麻醉(75毫克/公斤,i.p。,一个bbott Laboratories, North Chicago, IL) or isoflurane (4% in oxygen) and nonfasting blood glucose levels determined with the use of glucose oxidase reagent strips (Lifescan Inc., Milpitas, CA). Afterwards, motor and sensory nerve conduction velocities were determined as previously described [12,13,32]。运动神经传导速度测定的无创sciatic-posterior胫骨进行系统[12,13]。感觉神经传导速度(感)确定使用描述的数字神经第二脚趾Obrosova et al。32]。MNCV和感是米每秒。
2.5。数据分析
结果提出了均值±SE。对比组的体重、血糖、MNCV、感、热痛觉延迟进行了使用一个单向方差分析和Bonferroni测试多个比较(棱镜软件;圣地亚哥GraphPad CA)。一个价值的更少。05年被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。链脲霉素神经毒性
已经有相当多的讨论可能的神经毒性效应链脲霉素和体外糖尿病作为一个可接受的模型是否适合糖尿病神经病变尤其是老鼠当使用高剂量链脲霉素诱导糖尿病。为了解决这个问题我们使用过程之前用于大鼠保护胰腺链脲霉素的细胞毒性(29日,30.]。C57Bl / 6和瑞士韦伯斯特小鼠接受3-O-methylglucose之前注射链脲霉素normoglycemic和胰岛素水平是类似于控制老鼠(表1)。相比之下,小鼠治疗链脲霉素单独开发高血糖和循环胰岛素水平显著下降。此外,糖尿病小鼠神经病变发展,由神经传导速度的放缓和反应延迟增加一个热的挑战。神经传导速度和热痛觉过敏在3-O-methylglucose /链脲霉素对小鼠正常。这些研究表明,链脲霉素不是直接在两个品系小鼠神经毒性和神经功能赤字很可能与糖尿病相关的条件,糖尿病引起的体外实验胰腺癌的后续发展细胞损伤。
3.2。棉结在糖尿病神经病变
数据表2提供背景信息的变化体重和nonfasting血糖水平C57Bl / 6和棉结/老鼠在这项研究中使用。实验周期开始时,老鼠12周的年龄和持续12周。在12周的年龄C57Bl / 6小鼠体重大约27 g和获得/ 4 g在接下来的12周。C57Bl / 6小鼠糖尿病在12周的年龄体重没有在实验期间,体重显著减少,然后有一个更大的血糖水平控制小鼠在24周的年龄。C57Bl / 6小鼠喂食高脂肪食物的12周重更多然后控制小鼠在24周的年龄。中性肽链内切酶缺乏的老鼠在12周的年龄对C57Bl / 6小鼠一样重。像C57Bl / 6小鼠的控制,中性肽链内切酶缺乏的老鼠从12到24周的上涨约4 g时代。中性肽链内切酶缺陷与链脲霉素诱导糖尿病小鼠C57Bl / 6小鼠可比。糖尿病中性肽链内切酶缺乏的老鼠没有增加体重和血糖水平明显高于控制中性肽链内切酶缺陷的老鼠。中性肽链内切酶缺乏的老鼠喂食高脂肪食物的重量远远超过12周控制中性肽链内切酶缺陷小鼠在24周的年龄和他们的体重增加是类似于C57Bl / 6小鼠。 Nonfasting blood glucose level was not increased in C57Bl/6 or neutral endopeptidase deficient mice fed a high fat diet.
数据在图1证明C57Bl / 6和中性肽链内切酶缺陷小鼠喂食高脂肪食物的空腹血糖水平明显高于各自的正常饮食的老鼠。葡萄糖清除率明显受损C57Bl / 6和中性肽链内切酶缺陷老鼠喂食高脂肪的饮食。
(一)
(b)
经过12周的治疗糖尿病或高脂肪的饮食运动和感觉神经传导速度确定C57Bl / 6和中性肽链内切酶缺陷小鼠和各自的控制。数据在图2证明运动和感觉神经传导速度明显降低糖尿病C57Bl / 6小鼠。相比之下,经过12周的糖尿病运动和感觉神经传导速度在中性肽链内切酶缺乏的老鼠不是明显不同于控制老鼠和糖尿病C57Bl / 6小鼠相比。喂养C57Bl / 6小鼠但不是中性肽链内切酶缺陷小鼠高脂饮食引起的12周在感觉神经传导速度明显降低。喂食高脂肪的饮食对C57Bl / 6和中性肽链内切酶缺陷小鼠并没有改变运动神经传导速度。
(一)
(b)
数据在图3证明反应的热刺激hindpaw受损C57Bl / 6糖尿病和高脂肪喂养小鼠C57Bl / 6小鼠相比,控制。因此,经过12周的糖尿病或高脂肪饮食C57Bl / 6小鼠热hypoalgesic。相比之下,热响应性糖尿病或高脂肪喂养中性肽链内切酶缺乏的老鼠不受损控制中性肽链内切酶缺乏的老鼠相比,更多的反应相比,糖尿病或高脂肪喂养C57Bl / 6小鼠,分别。此外,控制中性肽链内切酶缺陷小鼠对疼痛刺激更敏感比控制C57Bl / 6小鼠。
4所示。讨论
糖尿病周围神经损伤的最常见原因呈现弥漫性损伤称为多神经病和局部损伤或单神经病(33,34]。现在知道,痛苦的感觉神经病变也与葡萄糖耐量或代谢综合征(35- - - - - -38]。动物糖尿病多神经病的病理生理学的研究为我们提供了一长串的机制和可能的治疗,但这些治疗方法在临床试验中通常都以失败告终34]。因此,这个时候没有有效治疗糖尿病多神经病。如Zochodne所述34),可能有许多原因这些临床试验的令人失望的结果,包括代理的选择,试验设计和端点。由于糖尿病的病因多神经病似乎是多因子的,似乎不太可能一个干预将是有益的和更多目标的方法是必要的。
我的实验室都集中在微血管功能障碍的作用在周围神经疾病的发展和恶化。我们的研究在1型和2型糖尿病大鼠和老鼠代谢综合症的模型表明,受损的血管反应性之前确定的神经功能障碍的发展减少了神经传导速度(6,8- - - - - -11]。最近我们一直在调查中性肽链内切酶的作用,vasopeptidase抑制糖尿病的影响,obesity-induced血管和神经功能障碍。中性肽链内切酶存在于许多组织包括血管、肾、神经组织和它的活动增加了脂肪酸和葡萄糖在人类微血管细胞(20.- - - - - -26]。有趣的是,中性肽链内切酶活性已被证明是激活蛋白激酶C,由糖尿病增加了血管组织(39,40]。中性肽链内切酶降解血管活性的多肽包括利钠肽、adrenomedullin,缓激肽,降钙素相关基因肽(19]。因此,vasopeptidase抑制剂的使用,一种新的药物,同时抑制中性肽链内切酶和血管紧张素转换酶活性,可能会促进血管活性的肽的表达通过阻断退化,因此,改善血管功能。在这方面,糖尿病大鼠股动脉血管电导的体外实验改进了vasopeptidase抑制剂(41]。此外,它已经表明,vasopeptidase抑制剂神经保护和防止Zucker糖尿病肾病肥老鼠(14- - - - - -17]。Vasopeptidase抑制剂也有报告称,降低基质金属蛋白酶和年龄积累/形成在2型糖尿病和改善伤口愈合42- - - - - -44]。在我们先前的研究已经表明,治疗糖尿病大鼠体外实验和Zucker糖尿病脂肪老鼠,类型1和2糖尿病动物模型,分别与AVE7688 vasopeptidase抑制剂、改进的运动和感觉神经传导速度放缓和血管损伤(12,13]。我们在以前的研究也表明,治疗糖尿病大鼠体外实验或用卡托普利Zucker糖尿病老鼠脂肪,血管紧张素转换酶抑制剂,改善神经和血管功能障碍(45,46]。然而,我们得出的结论是,AVE7688治疗糖尿病神经和血管并发症比卡托普利(更有效7]。
为了进一步研究中性肽链内切酶的作用在周围神经功能障碍,我们研究了体外糖尿病和食源性肥胖的影响神经传导速度和热响应延迟的hindpaw C57Bl / 6小鼠和小鼠缺乏中性肽链内切酶。这些研究的两个主要的发现是,链脲霉素本身不是神经毒素,中性肽链内切酶缺乏的老鼠不受神经传导速度的放缓和热痛觉减退,发生在糖尿病或食源性obesity-C57Bl / 6小鼠体外实验。
Pabbidi et al。47)报道,链脲霉素对神经元有直接行动和调节TRPV1的表达和功能,一个负责炎性疼痛的离子通道热疼痛。使用背根神经节神经元执行研究中他们发现,过氧化氢模仿链脲霉素的影响关于增加TRPV1的表达。在动物实验中他们发现,一些老鼠注射链脲霉素(50 - 200毫克/公斤)并没有成为高血糖的但表现出使用热板的瞬态热痛觉过敏测试,在数周内恢复正常。这与高血糖的老鼠进行痛觉过敏和痛觉减退。在我们目前的研究中,老鼠显示痛觉减退4 - 12周后注射链脲霉素和随后的诱导糖尿病。我们没有检查我们的糖尿病小鼠早于4周,虽然我们之前报道的热痛觉减退早在2周后出现体外糖尿病(48]。老鼠接受3-O-methylglucose之前注射链脲霉素没有演示神经病变的迹象,表明通过神经传导速度的放缓或改变热响应延迟。我们从我们的研究得出链脲霉素单独不负责热痛觉减退或小鼠的神经传导减慢。
我们的研究结果表明,中性肽链内切酶活动导致周围神经病变观察1型糖尿病和食源性肥胖。运动和感觉神经传导速度放缓是一个常见的特性在体外糖尿病的动物模型49,50]。同样,它已经证明了C57Bl / 6小鼠喂食高脂肪食物的16周的运动和感觉神经传导赤字和热痛觉减退[51]。
原因神经传导速度正常的糖尿病和肥胖的中性肽链内切酶缺陷小鼠可以保护血管功能。在糖尿病和肥胖的老鼠,我们已经表明,治疗vasopeptidase抑制剂防止血管功能障碍(12,13]。这可能是由于保护血管活性的肽从中性肽链内切酶降解12,13,52,53]。保护降钙素相关基因肽和物质在糖尿病大鼠背根神经节的神经生长因子也已被证明能够防止/改善糖尿病感觉神经病变(54]。因为中性肽链内切酶降解降钙素相关基因肽和物质可以预见,老鼠缺乏中性肽链内切酶将保持较高水平的这两个刺激神经组织的肽,或许是受神经病变。
我们观察到糖尿病——或者obesity-induced hindpaw的热痛觉减退在中性肽链内切酶缺陷预防老鼠。在我们研究小鼠糖尿病或含喂食高脂肪的饮食前12周实验。Beiswenger et al。48只有2周后)报道,热痛觉减退发达的糖尿病。有趣的是,他们发现,在免疫反应性的表皮神经纤维密度明显减少直到4周后不能被发现的糖尿病导致他们表明,表皮伤害感受器功能受损导致早期diabetes-induced热痛觉减退之前损失的外围终端。我们建议增加中性肽链内切酶的表达表皮神经纤维可能导致表皮伤害感受器功能障碍增加退化降钙素相关基因肽和物质刺激神经组织的肽参与疼痛知觉。中性肽链内切酶表达在正常皮肤和增加在伤口55]。通过免疫组织化学方法在正常皮肤中性肽链内切酶是本地化的角化细胞表皮基底层,毛囊,外分泌腺的皮脂腺,内皮血管和大神经的53]。此外,中性肽链内切酶活动增加糖尿病患者的皮肤溃疡(56]。人们认为这可能导致缺乏神经炎症信号和可能影响伤口愈合56]。我们已经表明,中性肽链内切酶的表达增加在糖尿病大鼠坐骨神经的神经外小动脉(12,13]。它还有待确定表达式/中性肽链内切酶活性增加表皮的拦路贼的糖尿病或肥胖小鼠和如何与表皮神经纤维密度的变化。
正常中性肽链内切酶缺陷小鼠C57Bl / 6小鼠相比,热痛觉过敏的撤军的决定延迟hindpaw的阈值。增加对疼痛刺激的敏感性曾被证明在中性肽链内切酶缺陷小鼠或中性肽链内切酶的抑制活性(56- - - - - -58]。它已经表明,中性肽链内切酶基因敲除小鼠诱发痛觉过敏引起的血管舒缓激肽在内脏痛模型57]。缓激肽也是一个肽降解中性肽链内切酶。在研究人类皮肤抑制中性肽链内切酶促进神经源性炎症和中性肽链内切酶,但不是血管紧张素转换酶降解降钙素相关基因肽(最重要的是58]。使用中性肽链内切酶基因敲除小鼠同一组发现增加疼痛行为和软组织创伤后神经源性炎症的迹象,没有神经损伤(59]。可能是糖尿病或肥胖中性肽链内切酶缺乏的老鼠在我们的研究中并没有成为热hypoalgesic因为这些老鼠对疼痛刺激更敏感比野生型小鼠和敏感性蒙面hindpaw热响应性的任何更改。
5。结论
使用C57Bl / 6和瑞士韦伯斯特小鼠我们发现链脲霉素本身并不是神经毒性或负责与体外实验糖尿病相关的神经功能障碍。这些研究也提供了额外的证据表明,中性肽链内切酶的表达在周围神经病变过程中发挥作用伴随糖尿病和/或食源性肥胖。继续调查治疗手段操纵中性肽链内切酶的活性和其他metalloendopeptidases可能导致一个有效治疗周边多神经病。
确认
这种材料是基于工作支持的研究从青少年糖尿病研究基金会的资助,退伍军人事务部,退伍军人健康管理局,办公室研发、生物医学实验室的研究和开发,与NIH奖DK073990(我),DK92889 (NAC)和DK057629 (NAC)。本文的内容是完全的责任作者,并不一定代表授予机构的官方观点。