文摘

探讨磺酰脲类之间的不同的影响(SU)和glinide药物胰岛素分泌,胰腺肽与苏(glimepiride)或反复刺激glinide (mitiglinide)。全内反射荧光显微镜(TIRF)显示,二级glimepiride刺激,但不是葡萄糖和mitiglinide,未能唤起融合与葡萄糖刺激胰岛素的颗粒虽然主要,glimepiride, mitiglinide诱导同等数量的exocytotic反应。Glimepiride,但不是葡萄糖和mitiglinide,诱导异常持续海拔高度和减少停靠胰岛素颗粒在质膜上。我们的数据表明,glinide对胰岛素分泌的影响机制是类似于葡萄糖。

1。介绍

磺酰脲类(SU)和glinide药物通常用于治疗2型糖尿病患者从胰腺刺激胰岛素释放肽。insulinotropic试剂都有不同的结构,但绑定到同一个目标,苏尔,亚基ATP-sensitive K⁺通道,导致通道关闭,导致去极化和随后的Ca²⁺通过电压门控钙流入²⁺渠道,其次是Ca²⁺端依赖胞外分泌的胰岛素颗粒(1]。

尽管他们insulinotropic效果类似,我们发现恢复之间的显著差别细胞功能在糖尿病GK大鼠(2]。GK大鼠显示胰岛形态学异常,glucose-induced exocytotic响应和停靠胰岛素颗粒在等离子体膜的数量在胰脏受损肽从GK大鼠的培养。我们发现与nateglinide长期治疗,glinide药物,导致这些障碍在GK大鼠部分复苏;的glucose-induced exocytotic反应肽培养从GK大鼠nateglinide治疗,疗程6周部分恢复。此外,glinide-treatment几乎恢复胰岛形态和数量的停靠胰岛素颗粒在质膜上。另一方面,长期服用格列苯脲,苏药,没有恢复在GK大鼠的细胞功能。

其中的一种解释是不同的对复苏的影响细胞功能将苏和glinides的不同效力。虽然SUs苏尔紧密结合具有延迟性和长时间的降糖效果,glinides拥有快速发病和短的表演对胰岛素分泌的影响(3]。因为一些报告显示,慢性诱导治疗没有反应肽苏药物在体内和体外4,5苏,有人建议,刺激可能导致insulin-secretory机制的障碍肽。

检查这些药物对exocytotic响应的影响肽,我们研究了生成反应的可逆性重复葡萄糖,苏,或者glinide刺激主要培养小鼠胰腺肽。

2。材料和方法

2.1。全内反射荧光TIRF显微镜分析

胰腺肽是培养从C57BL / 6小鼠,感染重组腺病毒表达GFP-tagged胰岛素和奥林巴斯TIRF显微镜下观察high-aperture物镜如前所述[2]。培养肽是孵化15分钟在Krebs-Ringer缓冲区(KRB)包含(毫米):110氯化钠,氯化钾,KH的4.4升至1.45₂阿宝₄1.2 MgSO₄4.8,2.3葡萄糖酸钙,NaHCO₃4葡萄糖,10玫瑰,pH值7.4,0.3%牛血清白蛋白(BSA)。细胞被perifused与KRB 4毫米葡萄糖0.5毫升/分钟的流量和刺激KRB含有葡萄糖16.7毫米,5.5毫米0.5葡萄糖补充M mitiglinide或者glimepiride 12.5分钟。第一次刺激后,KRB缓冲区包含4毫米葡萄糖perifused 15分钟,其次是第二个刺激葡萄糖与16.7毫米,5.5毫米0.5葡萄糖补充M mitiglinide或者glimepiride 12.5分钟。融合事件的数量在第一次和第二次刺激和停靠胰岛素颗粒的数量就在第一次和第二次刺激是手动计算。

2.2。测量(Ca^{2 +}]_我

Fura-2 acetoxymethyl酯(Fura-2点;英杰公司)加载到讲究的肽和阿尔戈斯/ HiSCA系统(滨松光子学)是用于测量(如前所述)(2]。细胞被反复刺激如上所述。

2.3。统计分析

数据分析单向方差分析Turky-Kramer紧随其后的测试使用Statview软件(SAS研究所、卡里、数控、美国)。

3所示。结果

首先,我们进行重复使用生理刺激,刺激高葡萄糖。主要培养小鼠胰腺肽表达GFP-tagged胰岛素刺激两倍与16.7毫米perifusion葡萄糖,和第一和第二exocytotic反应刺激TIRF显微镜下观察。图1(一)显示从pre-docked exocytotic事件的数量和新人颗粒在第一和第二高葡萄糖刺激。exocytotic事件的模式在第一次和第二次刺激相似,表明葡萄糖16.7毫米可以反复唤起定性类似exocytotic反应。

接下来,我们检查是否重复exocytotic响应可以通过常用insulinotropic诱导试剂,苏,glinide药物。Glimepiride mitiglinide被用作代表苏和glinide药物,分别。如图1 (b),第一次和第二次mitiglinide刺激迅速引起exocytotic反应后刺激,虽然总融合事件的数量第二mitiglinide刺激诱发的轻微减少。另一方面,glimepiride,令人惊讶的是,未能唤起exocytotic响应在第二轮刺激(图1 (c))。总融合事件的数量由第一glimepiride刺激相当于诱导的第一个16.7毫米葡萄糖或mitiglinide刺激(图1 (d),83.07.9,77.76.4和91.313.3/200米²16.7毫米的葡萄糖,mitiglinide glimepiride, resp)表明第一glimepiride刺激影响的能力应对随后glimepiride刺激甚至15分钟后恢复时期,而16.7毫米葡萄糖和mitiglinide可以反复唤起胰岛素的胞外分泌颗粒。为了排除的可能性超过glimepiride exocytotic的失败引起的第二个刺激,我们对低浓度的影响在重复的刺激。主要刺激为0.1M glimepiride诱导一半融合事件的数量在12.5分钟(48.76.2/200米²为0.1),但二次刺激M glimepiride未能唤起一个重要exocytotic响应(14.92.3/200米²)。

阐明机制的第二个刺激的glimepiride-induced反应迟钝,我们检查了动力学在重复的刺激。如图2,增加第16.7毫米葡萄糖引起的回到了基准面在15分钟的时间间隔,和第二高葡萄糖刺激诱发的增加。Mitiglinide诱导快速反应比高葡萄糖。增加急剧下降到基础水平,第二个mitiglinide刺激迅速唤起增加。另一方面,升高第一glimepiride刺激引起的不返回到基础水平在15分钟的时间间隔,和第二个glimepiride刺激未能引起进一步增加。连续洗超过30分钟也没有减少唤起第一glimepiride刺激(数据未显示)。这些结果表明,第一个glimepiride刺激引起了高负责异常长时间甚至glimepiride撤军后,导致后续刺激胰岛素释放反应的失败。

第二glimepiride刺激的注意,尽管未能诱导exocytotic响应在第二次刺激相当于第一glimepiride刺激引起的。因此,我们假设异常持续高程引起glimepiride会影响exocytotic过程可能参与胰岛素颗粒运动性的规定,因为exocytotic反应诱发glimepiride在很大程度上由新人颗粒必须移动很长的距离等离子体的胞质膜。为此,我们调查的数量停靠胰岛素颗粒在等离子体膜经过15分钟的时间间隔后第一个刺激,因为胰岛素的活性颗粒的数量应该反映停靠胰岛素颗粒后刺激(6]。如图3,第一个高葡萄糖和mitiglinide刺激并不影响停靠胰岛素颗粒的数量在质膜上。另一方面,停靠胰岛素颗粒的数量下降到58.04.5%第一glimepiride刺激尽管15分钟的恢复期,表明glimepiride,但不是mitiglinide,会影响胰岛素的细胞内活性颗粒和他们招聘到质膜。这些结果表明,异常持续高程的主要glimepiride刺激受损的胰岛素颗粒活性,可能的原因没第二个glimepiride刺激。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们审查的影响SU和glinide药物体内反应的可逆性和显示主要刺激与苏受损exocytotic应对后续的刺激,而葡萄糖和glinide反复诱导胰岛素释放的能力。

以前的药理研究表明glimepiride的IC50值和mitiglinide体内表达Kir6.2 SUR1和3.0 nM,大约60 nM,分别为(7]。然而,在这项研究中,我们使用mitiglinide同时glimepiride浓度(0.5米),因为以下两个原因。首先,我们先前的研究显示,最大insulinotropic mitiglinide是观察到的效果0.50.5 M TIRF显微镜下,表明M mitiglinide诱导一个温和exocytotic反应主要讲究的肽(8]。第二,总数量的融合事件诱发第0.5M glimepiride刺激相媲美,诱发第0.5M mitiglinide刺激(图1 (d))表明最大分泌引起的反应不应该是0.5M glimepiride。因此,在我们的实验条件中,insulinotropic效能为0.5M mitiglinide和0.5M glimepiride是等价的。mitiglinide剂量的有效性和glimepiride用于这项研究也证明了融合的模式事件响应第一个刺激。第一个glimepiride刺激诱发融合事件的发病高峰在7 - 8分钟后刺激,而第一个mitiglinide刺激诱导更快速反应。这些结果与以前的研究一致表明glinide药物诱导比苏更快速反应(3]。此外,我们确认第一个刺激glimepiride较低浓度诱导大约一半的数量总融合事件,但分泌细胞受损的第二个刺激的。综上所述,不同的exocytotic反应诱发glimepiride和mitiglinide由于没有有效浓度的差异,但这些药物的特点。

是重要机制的阐明对后续刺激glimepiride-induced没有反应。我们和其他人表明glimepiride诱导海拔没有返回到基础水平即使在撤军glimepiride(图2 (c))表明,异常持续海拔可能对随后的刺激没有反应的原因。据报道,异常持续高程引起Ca^{2 +}离子载体变弱分泌颗粒的流动通过破坏细胞骨架在星形胶质细胞(9]。几项研究已经证明了海拔激活多个通路对细胞骨架的破坏,这可能会导致胰岛素颗粒流动的衰减。钙激活钙^{2 +}端依赖蛋白酶,calpain劈开microtubule-associated蛋白质(地图),导致不稳定的微管丝(10]。此外,增加刺激Ca^{2 +}端依赖磷酸酶,磷酸酶,其次是通过slingshot-mediated通路cofilin去磷酸化,从而导致微丝解聚作用[11]。因此,我们假设主要刺激glimepiride可能减弱胰岛素通过破坏细胞骨架颗粒流动。

在目前的研究中,分散的主要培养肽与16.7毫米被perifusion反复刺激葡萄糖。虽然从pre-docked颗粒融合事件的比例是轻度降低相比,我们的先前的研究6),这是由于不同的刺激协议与一个相对温和的刺激比在我们先前的研究2,6,8]。因为从pre-docked颗粒融合需要快速和显著升高Ca^{2 +} (12),与16.7毫米perifusion葡萄糖可能不会唤起的陡峭的高度Ca^{2 +} 需要从pre-docked颗粒融合。

几十年前,据报道,第一个脉冲的葡萄糖加强在第二个刺激胰岛素分泌。葡萄糖的启动效应被称为“时间增强作用(TDP)”,并观察胰腺(13,14和胰岛15,16]。在这项研究中,第一和第二16.7毫米葡萄糖诱导定性exocytotic模式相同,但融合的总数事件引起的第二个16.7毫米葡萄糖略下降,而不是强。这种差异可能是由于不同的胰岛素释放试验做准备,因为据我们所知,没有报告显示,在分散的计划书肽。在这项研究中,我们使用分散的胰腺肽在体外培养2天。因此,信息互动或沟通在胰岛细胞可能对计划书的建立非常重要。符合这个猜测,一些报告显示的重要性因素来自非肽的形成“葡萄糖记忆”[16,17]。

总之,mitiglinide有益比苏不仅在改善胰岛素胞外分泌的精确管理分泌细胞,这将是重要的维护机制肽。

确认

作者感谢布伦特贝尔先生(呼吸疾病和传染病,东北大学医学研究生院)阅读手稿。这项工作是支持的重点领域的科学研究18050033和科研(C) 18050033 (M.O.-I)和科学研究(B) 20390260 (S.N.)从日本教育部,文化、体育科学和技术。