文摘
目的/假说。CD38 ADP-ribosyl-cyclase活动(ADPRCA)和其他主要生成环腺胞外酶5 'diphosphate - (ADP)核糖(cADPR)作为第二信使在各种哺乳动物细胞,包括胰腺β细胞和外周血单核细胞(PBMCs)。自从PBMCs导致糖尿病肾病的发病机制,ADPRCA PBMCs可以作为临床糖尿病肾病的预后指标。本研究旨在探讨ADPRCA PBMCs和糖尿病并发症之间的关系。方法。PBMCs从60岁糖尿病患者为50 1型和2型(10)和15非糖尿病患者控制fluorometrically ADPRCA基于转换测量烟酰胺腺嘌呤二核苷酸()循环GDP-ribose。结果。ADPRCA与糖化血红蛋白水平负相关(,),尽管ADPRCA与性别无显著相关性,年龄、体重指数、血压、空腹血糖和血脂水平,以及类型,时间,或药物治疗糖尿病。有趣的是,肾病患者,但没有其他并发症,显著降低ADPRCA比那些没有肾病()和糖尿病()。ANCOVA分析调整糖化血红蛋白显示ADPRCA和肾病相关性不显著。然而,肾病logistic回归分析显示,决定因素是收缩压和ADPRCA,糖化血红蛋白。结论/解释。与糖尿病肾病ADPRCA下降显著相关。ADPRCA PBMCs将与糖尿病肾病相关的一个重要标志。
1。介绍
糖尿病的特征是慢性高血糖和diabetes-specific微血管并发症的发展。由于这些并发症,糖尿病是晚期肾脏疾病的主要原因(ESRD) [1]。实际上,糖尿病肾病是日本ESRD的最常见原因(2]。最近的流行病学数据表明,日本的2型糖尿病患者的数量在肾脏替代疗法在不到15年增加了两倍,和日本的2型糖尿病患者可能特别倾向于肾病(3,4]。因此,高风险的日本主题为糖尿病肾病的早期检测对早期干预防止ESRD相当重要。
慢性低度炎症和激活先天免疫系统的密切参与糖尿病及其微血管并发症的发病机理(5,6]。炎症活动中心糖尿病肾病的发病机制7- - - - - -9],炎性细胞因子参与发展和进展10]。巨噬细胞来源于单核细胞循环最近关注糖尿病肾病的进展中发挥核心作用[11,12]。因为PBMCs主要包括淋巴细胞和单核细胞,这两种导致糖尿病肾病的进展,参与细胞内的监管信号激活PBMCs可以作为一个可能的治疗目标和/或临床糖尿病肾病的预后指标。
环腺苷5 'diphosphate-ribose (cADPR)扮演了一个在多种哺乳动物细胞第二信使的作用,包括胰腺β细胞,肾系膜细胞,PBMCs [13]。Ca的快速释放2 +光滑型内质网(SER),最具有Ca2 +细胞器,是刺激诱发的两种受体在SER阿诺定、肌醇三磷酸(1、4、5)。cADPR从beta-NAD催化+CD38 ADP-ribosyl-cyclase活动(ADPRCA), CD157和其他ectocellular膜结合酶(14- - - - - -18]。cADPR最近演示了刺激多种哺乳动物细胞功能,包括增殖、分泌,收缩和血管舒张19- - - - - -25]。例如,几项研究已经检查ADPRCA在肾系膜细胞(26,27],cADPR报道诱导平滑肌收缩,肾小动脉(28]。
自从cADPR调节适应性免疫识别的过程PBMCs [29日),我们假设受损的监管信号ADPRCA PBMCs会导致糖尿病血管并发症的进展。然而,没有临床研究执行检查CD38和糖尿病并发症之间的关系。
基于此背景下,本研究调查之间的联系ADPRCA PBMCs和糖尿病血管并发症,尤其是肾病。
2。材料和方法
2.1。研究人群
研究病人的资格,如果他们表现出糖尿病。糖尿病诊断和分类是根据世界卫生组织(世卫组织)标准(30.,31日]。学科与其他内分泌疾病或显著的肾和/或肝疾病被排除在外。研究伦理委员会批准金泽大学研究生院医学科学,是依法进行的赫尔辛基宣言》(1964),和所有病人之前书面知情同意参与这项研究。
糖尿病并发症的定义
ssessment和诊断糖尿病并发症进行如下(32]。被诊断为肾病蛋白尿的存在,蛋白尿和/或肌酐清除率< 60毫升/分钟。蛋白尿是指尿白蛋白排泄20到200毫克/ 24小时或尿白蛋白30和300毫克/尿肌酐比值gCr。蛋白尿是指Albustix (Ames)阳性。肌酐清除率Cockroft-Gault值计算的公式。视网膜病变诊断的基础上直接检眼镜检查(通过瞳孔)由一位经验丰富的眼科医生和/或荧光素血管造影。周围神经病变评估对患者神经病变的症状,包括感觉异常、感觉迟钝,腿和脚的疼痛和基于临床检查(即。,测量异常膝盖或脚踝反射和Semmes-Weinstein单丝),证实了传导速度的测量尺(运动和感觉),胫骨,腓骨肌和腓肠神经。Macroangiopathy被认为是在受试者满足以下三个条件:(1)心血管事件的历史和/或心绞痛的存在和/或永久性脑缺血心电图异常静止或缺血性异常压力测试(通常是结合心脏非侵入性成像技术);(2)跛行和/或废除外围脉冲和/或足部病变由于血管疾病证明了多普勒回波描记术和/或血管造影术;或(3)颈动脉血管疾病,所评估的多普勒回波描记术。
药物治疗糖尿病
药物治疗2型糖尿病患者被分为三个类别:饮食疗法没有药物,胰岛素注射,口服降糖药物包括磺脲和alpha-glucosidase抑制剂。2型糖尿病受试者没有接受治疗与药物胰岛素增敏剂(包括和双胍类)参加本研究。
2.2。实验室测量
身体质量指数(BMI)计算体重(公斤)除以身高(米)的平方。静脉血样后得到迅速一整夜。血糖测定的葡萄糖氧化酶法和高压液相色谱测定糖化血红蛋白。血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)测定酶的方法,和高密度脂蛋白胆固醇(hdl - c)水平是衡量一个polyanion-polymer /洗涤剂方法。低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白)使用Friedewald公式计算。
2.3。测量Adprca
Pbmc的隔离膜分数
在得到书面知情同意后,外周血样本收集。PBMCs孤立使用Ficoll-Paque +(σ)33- - - - - -35)和离心机。孤立PBMCs悬浮在10毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸溶液,液pH值7.4,5毫米MgCl2为每个样本(2毫升)4°C 30分钟。悬挂在Teflon-glass均质机均质;合匀浆离心机在4°C 5分钟1000×g删除完整的细胞和细胞核。原油膜分数是由离心(两次)匀浆的105×000克15分钟。撤掉上层清液,和沉淀悬浮在10毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸溶液,液pH值6.7 [36,37]。对于每一个实验,膜是刚做好的,立即用于酶促反应。
荧光测量Adp-Ribosyl环化酶的活动
ADPRCA决心fluorometrically使用基于转换的测量技术β-NGD+在荧光产品cGDP-ribose [36- - - - - -39]。总之,2.5毫升的反应混合物包含60μ米β-NGD+,50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸,液pH值6.6,100毫米氯化钾,10μM CaCl2和膜(62 - 297μ克蛋白质)维持在37岁°C在不断搅拌。样本然后在300 nm,兴奋和荧光发射连续监测在410 nm日本岛津公司rf - 5300 pc spectrofluorophotometer(日本京都)。活动的计算数据点记录每毫克膜蛋白在5分钟以前报道(37]。
2.4。统计分析
所有数据显示为平均数±标准差。连续变量由单向方差分析比较(方差分析)或协方差(ANCOVA)在调整年龄、BMI,和性。常态分布的Ln (ADPRCA)证实了Shapiro-Wilk W-test。两组之间的差异被气相比2分析(分类变量)或非参数Mann-Whitney u测验(连续变量)。逻辑回归分析澄清临床参数导致分类变量。逐步多元回归分析阐明临床参数导致连续变量的水平。所有统计分析进行了Macintosh os x 10.5人民币6.03 (SAS研究所有限公司、卡里、数控、美国)。一个P值小于0。被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
Adprca和临床参数之间的关系
总共60日本糖尿病患者(31雄性和雌性29日)和15个非糖尿病患者控制(6雄性和雌性9日)参加本研究。研究对象的基线特征如表所示1。ADPRCA显示与糖化血红蛋白水平(统计上显著的负相关P= .040,R2= 0.073,图1)。如表所示2ADPRCA之间,没有明显的相关性观察和其他临床参数(空腹血浆葡萄糖水平,收缩压和舒张压,血清总胆固醇、血清TG的对数,高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白,年龄、糖尿病、时间BMI,性别差异,类型的糖尿病(图2(一))或药物治疗糖尿病(图2(b)))。
(一)
(b)
Adprca在患有糖尿病的并发症
图3显示ADPRCA和糖尿病血管并发症之间的关系。ADPRCA显著低于比那些没有肾病患者P= .0198)和非糖尿病的控制(P= .0332)(图3(a))。学科与其他并发症也显示类似的倾向;然而,ADPRCA之间无显著相关性,视网膜病变,神经病变,或观察macroangiopathy(数据3(b) -3(d))。尽管糖化血红蛋白水平与ADPRCA显示的关系,没有观察到显著差异ADPRCA主题之间与任何糖尿病并发症(数据未显示)。
(一)
(b)
(c)
(d)
作为ADPRCA糖化血红蛋白明显相关,我们检查是否糖化血红蛋白导致ADPRCA和肾病的关系。ANCOVA的结果表明,只是没有达到统计学意义差异调整后糖化血红蛋白(表3)。接下来,检查是否ADPRCA肾病的存在可能是一个独立的因素,我们进行物流分析调整的收缩压,舒张压,TG,高密度脂蛋白,低密度脂蛋白,性别,类型的糖尿病,糖尿病,时间药物治疗糖尿病、糖化血红蛋白、体重指数。收缩压和ADPRCA极大地推动了肾病(表的存在4)。
4所示。讨论
本研究的主要发现是糖尿病肾病,且显示ADPRCA下降。然而,PBMCs促炎州糖尿病血管病变可能与增加ADPRCA等一些细胞因子包括引发、IFN-gamma移植细胞内CD38活动(17),我们的研究结果有趣的是表现为PBMCs ADPRCA降低。物流分析显示,只有收缩压和ADPRCA,但不是糖化血红蛋白,肾病的发病率显著相关。因此,贡献ADPRCA糖化血红蛋白的关系和肾病应考虑小范围。ADPRCA与肾病的关系似乎是合理的。
首先,讨论在PBMCs cADPR-mediated信号的作用,因为ADPRCA可以刺激血管紧张素ⅱ(37),与糖尿病肾病肾组织会显示ADPRCA增加。金等人的最新报告显示增加ADPRCA STZ-induced糖尿病小鼠的肾脏(18]。我们测量ADPRCA PBMCs,这种差异可能是可以接受的。有趣的是,CD38的角色PBMCs血管并发症的影响是双向的。绑定的PBMCs争胜anti-CD38抗体,刺激ADPRCA,诱发释放促炎细胞因子il - 1、il - 6、tnf在短期内(40]。炎症细胞因子释放可以使一个重要的贡献在糖尿病血管并发症的早期阶段负责。另一方面,争胜CD38结扎抑制细胞生长和凋亡在b细胞前体(41)调解磷脂酰肌醇3-kinase信号(42),虽然对成熟的淋巴细胞有刺激的影响。抑制效应由CD38也观察到实验与patient-derived骨髓白血病细胞和小鼠细胞系(43]。此外,表达CD38据报道在循环单核细胞而不是常驻巨噬细胞和树突细胞(44,45]。分化的单核细胞巨噬细胞表面表达CD38的差别导致了对这些46]。CD38强烈表达的淋巴细胞前体,拒绝在分化,然后再调节在成熟浆细胞(47]。CD157建议显示类似的表达趋势髓细胞(48]。因为高血糖直接提高蛋白质ADP-ribosylation培养神经母细胞瘤细胞(49),从而增强ADPRCA糖尿病主题,我们推测,降低PBMCs ADPRCA可能反映了降低抑制的影响CD38 CD157和分化细胞的数量增加。
第二,让我们考虑争胜CD38的自身抗体的影响,对所示从人工培养的胰岛胰岛素分泌50通过ADPRCA激活)。在人类中,大多数anti-CD38自身抗体(~ 60%)显示论争的属性51,52],它展示的能力引发Ca2 +释放在淋巴细胞细胞株53]。同意这些功能特性,存在anti-CD38相关自身抗体在2型糖尿病患者空腹血浆c -肽和胰岛素水平显著升高,而anti-CD38负面话题。因此,anti-CD38自身免疫可能表示一个相对保护β细胞衰竭和风险较低的胰岛素需求(52,54,55]。先前的报道的临床特点anti-CD38自身抗体运营商没有进入深度糖尿病并发症,虽然可能恶化糖尿病并发症的争胜的影响anti-CD38自身抗体在PBMCs指出了Mallone et al。51]。然而,一些讨论应该需要之间的关系CD38自身抗体与糖尿病血管病变争胜CD38自身抗体可能刺激胰岛素rsecretion导致高胰岛素血症,糖尿病大血管病变,著名的风险因素和血管紧张素ⅱ诱导肾动脉收缩。我们只是推测,那些anti-CD38自身抗体糖尿病肾病应该表现出较低的频率,和其他血管并发症在长期随访研究由于更好的血糖控制和增加成熟PBMCs ADPRCA反映少。
第三,我们所有的受试者糖尿病,我们有必要提到Okamoto糖尿病发病机理的模型。CD38-related信号已经被记录在糖尿病(18,56- - - - - -58]。我们的结果显示减少ADPRCA显著相关,增加糖化血红蛋白与先前的研究在某种程度上反映出兼容Okamoto模型(59- - - - - -61年]。有趣的是,在我们的研究中,没有明显的关系观察ADPRCA和空腹血糖。我们建议ADPRCA可能比空腹血糖水平与餐后,前者被强烈响应胰岛素分泌(27,29日]。
最后,我们的结果的临床意义:CD38表达,代表ADP-ribosyl环化酶,已经应用于临床,作为艾滋病病毒感染的预后标记对象(62年,63年)和慢性淋巴白血病(CLL) [13,56,64年]。因为其他ADP ribosyl环化酶包括PBMCs CD157驻留在细胞表面,限制考试CD38不会完全覆盖cADPR-mediated信号损伤。测量ADPRCA会因此成为一个更好的方法在萎靡不振的团体的风险从一般糖尿病患者中糖尿病肾病。我们设想ADPRCA测量同样引入临床设置检测受试者高危糖尿病肾病,从而促使早期干预防止迹象。
这项研究有一些局限性。首先,我们没有数据anti-CD38自身抗体。ADPRCA在每个主题部分取决于先前存在的糖尿病的独立因素,包括CD38遗传多态性和CD38的自身抗体。我们推测更高ADPRCA值可能反映拥有anti-CD38自身抗体。第二,我们没有检查淋巴细胞或单核细胞成熟分化的标志。进一步的研究应该检查。
总之,我们的研究表明,减少ADPRCA PBMCs明显与糖尿病肾病相关,测量的ADPRCA PBMCs可以作为与糖尿病肾病相关的一个重要标志。应该引入进一步的前瞻性研究来澄清机理和预测的意义下降ADPRCA糖尿病并发症。
确认
作者要感谢玲子夫人为她Ikeda技术援助在数据分析和评论关于这个手稿。m . Ohtsuji和k .八木的贡献同样这项工作。