文摘
目的/假说。数据表明,胰岛素原c -肽发挥重要的生理效应,显示了内源性肽激素的特点。本研究旨在探讨c -肽的影响及其碎片在红细胞可变形性,阐明相关的信号转导通路。方法。血液样本来自23个1型糖尿病患者和15匹配的健康对照组孵化为6.6 nM的人类的c -肽,c端hexapeptide, c端五肽,中间片段组成的残留11-19 c -肽或随机炒c -肽。此外,从7患者红细胞与c -肽孵化,表示“五”和hexapeptides /没有添加乌本苷,EDTA或百日咳毒素。红细胞可变形性测量用激光diffractoscope在剪切应力范围0.3 -60 Pa。结果。红细胞可变形性受18 - 25%相比,1型糖尿病患者在生理切应力匹配控制范围-12 - 0.6。c -肽,表示“五”和hexapeptide显著改善了受损的1型糖尿病患者的红细胞可变形性,而中间片段和炒c -肽没有可检测的效果。治疗红细胞与乌本苷或EDTA完全废除了c -肽,表示“五”和hexapeptide效果。百日咳毒素本身显著增加红细胞可变形性。结论/解释。c -肽及其c端片段同样有效改善红细胞可变形性在1型糖尿病。c -肽的c端残留是因果参与这种效果。信号转导通路端依赖和需要激活的红细胞,腺苷三磷酸酶。
1。介绍
在过去的十年中,几项研究已经证明,c -肽是一个内生肽生物活性。在摩尔浓度的细胞膜(结合具体1),可能G-protein-coupled受体,导致掩饰的肽(2和激活的——和MAPK-dependent信号通路3- - - - - -6]。细胞边缘效应包括刺激和诱导atp酶,以挪士以及一系列的转录激活因子(3,7- - - - - -10]。在1型糖尿病患者的研究缺乏内生c -肽生产表明,c -肽替代剂量导致管理区域血流量增加几个组织(11- - - - - -13)和改进的diabetes-induced周围神经的功能和结构异常和肾脏14- - - - - -16]。不仅全身本机c -肽,而且据报道,其c端五肽片段发挥生理效应(1,4,6,17,18]。
界普遍认为,糖尿病是与红细胞可变形性降低(19- - - - - -21]。这异常的临床意义的妥协血红细胞通过毛细血管的能力,减少组织灌注,损害组织供氧(4,22]。红细胞减少合规糖尿病背后的机制不是很清楚,但它已经表明,c -肽能够恢复正常水平,红细胞可变形性最有可能通过刺激红细胞atp酶(23]。在多大程度上c -肽片段将做同样的还未确定。因此,本研究的目的是检查c -肽的影响及其c端片段,以及中间段的异常的红细胞可变形性1型糖尿病患者。此外,可能的信号转导通路方面的评估。
2。主题、材料和方法
2.1。主题
血液样本被来自23个1型糖尿病患者和15匹配的健康对照组(表1)。入选标准是血清c -肽水平nmol / L,糖尿病持续时间年,血清肌酐mg / dL,没有临床相关的糖尿病长期并发症。血细胞比容值在正常范围内对所有患者和控制。
2.2。材料和方法
激光diffractoscopy执行使用Rheodyn SSD剪切应力衍射仪(Myrenne GmbH, Roetgen,德国)。激光的方法diffractoscopy之前已经详细描述(21,23]。总之,He-Ne-Laser检测红细胞变形之间的两个平行玻璃盘,其中一个旋转导致剪应力定义根据以下方程: 在哪里=剪切应力,激光光束旋转中心的距离粘度,身高差距的光盘时间。
调整各类设备值(25毫米,0.5毫米,24 mPa),方程是浓缩的 在rpm =转每分钟。
应用剪切应力范围是电子监管,包括8水平(0.3 Pa;0.6 Pa;1.2 Pa;3 Pa;6 Pa;12 Pa;30 Pa;60 Pa)。
红细胞可变形性测量检测散射光强度沿正交轴(A, B)的红细胞内的激光衍射光锥。红细胞伸长指数(EI)由以下公式计算:
所有的实验都在23日进行°C,恒温调节的。收集血液样本随后使用ammonium-heparinated瓶和分布式右旋糖酐中右旋糖酐(30μL血液/ 2毫升)。稳定性测试进行排除重大影响的存储时间和/或血清葡萄糖浓度红细胞可变形性衡量激光diffractoscopy(数据没有显示)。之前所有的测量红细胞可变形性进行了孵化与活性成分以及1,孵化后30、60分钟
c -肽和c -肽片段
人类提供的c -肽和c -肽片段都是创造性的肽的纯度(斯德哥尔摩,瑞典)%。c -肽及其碎片溶解在磷酸缓冲和孵化项目在6.6 nmol / L。探针的孵化和混合顺利完成,以避免外部剪切应力。本研究中使用的片段c端hexapeptide, c端五肽,中间片段,包括残留11-19和随机炒c -肽;他们的氨基酸序列表中给出2。
乌本苷
乌本苷是来自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。乌本苷治疗是滴定实现浓度1μmol / L。孵化项目和没有c -肽或碎片在23日持续30分钟°C。
乙二胺四乙酸
孵化项目与EDTA(1.6毫克/毫升)和没有c -肽或碎片在23日持续30分钟°c .单独使用EDTA的疗法并没有改变红细胞可变形性(数据没有显示)。
百日咳毒素
从Sigma-Aldrich百日咳毒素了。治疗百日咳毒素(1μg /毫升)进行60分钟37°C。
统计分析
结果表示为±SD的手段。高斯分布由Kolmogoroff-Smirnoff检查测试。统计分析是由two-site方差分析和学生的t测试。一个
值小于0。被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
红细胞可变形性显著降低1型糖尿病患者与健康对照组相比的剪切应力测试(图1)。在生理切应力范围,糖尿病患者和健康对照组之间的差异%孵化红细胞的1型糖尿病患者c -肽完全规范化红细胞defortmability测试剪切应力水平(表3)。孵化五- hexapeptides也导致在红细胞可变形性显著改善剪切应力测试的范围;对c -肽的反应和c端肽相似,有这三个治疗组之间没有显著差异。相比之下,中间片段没有施加重大影响diabetes-induced异常的红细胞可变形性。同样,正如所料,炒c -肽与一个随机的氨基酸序列没有有利于红细胞可变形性的影响。
预处理的1型糖尿病患者红细胞与乌本苷或EDTA完全废除了c -肽、五,hexapeptide-induced改善可变形性,如图2五肽的剪应力1.2 Pa。类似的结果为所有级别的剪切应力。预处理的红细胞百日咳毒素本身显著增加红细胞可变形性在-12年的剪切应力范围0.6 Pa。因此,可能影响蛋白失活的影响由c -肽及其碎片无法评估。
4所示。讨论
目前的结果确认和扩展以前的观测表明红细胞可变形性被破坏在糖尿病19- - - - - -21),这可以纠正异常c -肽(23]。因此,使用全血样品和激光diffractoscopy,方法重现性高(CV < 1%),红细胞可变形性测量在1型糖尿病患者的血液样本被发现减少18 - 25%生理切应力范围(0.6 -12 Pa),按照以前的结果使用相同的方法(23]。暴露从糖尿病患者血细胞6.6 nM, c -肽被发现完全正常化膜可变形性。我们现在不仅显示本机,完整的c -肽也c端表示“五”和hexapeptides拥有这种能力。相比之下,一个中间段由残留的11-19 c -肽没有效果。观察到的效应的特异性的炒c -肽的发现,一个控制肽以其残留在随机顺序组装,没有可检测的效果。
当前结果五肽与以往报道,它与c -肽细胞竞争绑定(1),它抒发的增加细胞内浓度(4),激活PKC,使磷酸化ERK1/2和物,和刺激腺苷三磷酸酶活性(6,17,24]。研究评估五肽的手机绑定/竞争特点,对细胞内的刺激效应浓度和ERK1/2磷酸化证明五肽的氨基端Glu-residue (c -肽的Glu 27)是最重要的生物活性;丙氨酸替代的其他四个残留有很少或没有影响五肽的生物活性4,25,26]。其生物活性已被发现是类似于上面的原生肽在体外研究和在比起现场实验评价其刺激影响全身葡萄糖利用率(18)及其抑制diabetes-induced肾小球反渗透法(27在streptozotocin-diabetic老鼠。
c端hexapeptide被发现同样的五肽和本机c -肽对其改进diabetes-induced异常的红细胞可变形性(图2)。只有信息几乎没有关于hexapeptide但目前发现的生理与以前的观测,它是刺激的能力腺苷三磷酸酶在肾小管部分效力类似于五肽(17]。与两个c端部分,发现没有迹象表明中间片段(残留11-19)产生一个可衡量的影响diabetes-induced异常的红细胞可变形性。变量结果已报告以前中间片段;轻微的刺激腺苷三磷酸酶在肾小管部分17),但不影响葡萄糖利用率在体内条件下(18曾被观察到。
暴露1型糖尿病患者红细胞从oubain或EDTA导致完全废除正常化的效果表示“五”和hexapeptides或c -肽红细胞可变形性。评价的g蛋白信号通路参与不能进行,因为接触的红细胞百日咳毒素本身导致变更的红细胞可变形性与以往发现兔红细胞(28]。然而,结果表明,肽的有利影响是通过介导的端依赖刺激红细胞atp酶,与先前建立的类比为c -肽和信号转导途径atp酶在人类肾小管细胞24),即使EDTA的结果可能表明,其他金属离子也信号转导的重要性(29日]。
暴露的红细胞c -肽及其c端片段因此可能导致增强生成和释放ATP,已经在c -肽的情况下直接观察到正常和糖尿病患者红细胞(29日]。ATP是公认的刺激血小板和红细胞的一氧化氮合酶(30.,31日]。一氧化氮,除了作为一个强有力的血管舒张,也有效地诱发改善红细胞可变形性的直接行动的一氧化氮红血球膜(32,33]。此外,C-peptide-related改善红细胞可变形性可能是介导而不是通过ATP红色细胞一氧化氮合酶的直接刺激。后者是功能上类似于内皮细胞(31日],c -肽及其c端片段也最有可能是已知的刺激,导致诱导内皮一氧化氮合酶(8,10]。上述机制可能有助于维护正常红血球膜的可塑性和他们修改的程度糖尿病是未知的。然而,无论涉及的确切机制,目前的研究结果表明,c -肽及其c端片段能够有效地规范diabetes-induced减少红细胞可变形性。很可能,这种效应贡献了重要的是观察到的区域皮肤的血液循环,改善肌肉、心肌,和周围神经在动物和1型糖尿病患者中,遵循管理c -肽生理浓度(11- - - - - -13,34]。此外,在早期神经病变(c -肽的有益的临床效果14和肾病15在1型糖尿病可能在一定程度上纠正异常红细胞可变形性和改善微循环。进一步的临床试验的文件和定义c -肽的作用及其c端片段在微血管并发症的治疗和/或预防1型糖尿病。