文摘

目的。先前建立的方法的基础上,我们开发了一个更好更稳定的2型糖尿病动物模型通过高脂肪饮食结合多个低剂量STZ注射。与此同时,这个新模型被用来评估小檗碱的抗糖尿病的效果。方法。纯种男性与普通食物喂养的大鼠4周收到车辆(对照组),对高脂肪饮食喂养的大鼠4周收到不同数量的STZ腹腔内注射一次或两次的(糖尿病模型组)和糖尿病大鼠服用黄连素(100毫克/公斤,小檗碱治疗组)。腹腔内葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验。此外,空腹血糖、空腹胰岛素、总胆固醇,甘油三酯测定评价动态血糖和脂质代谢。结果。最高的成功率(100%)在大鼠治疗一个注射STZ 45毫克/公斤,但是这个组的血浆胰岛素水平显著下降,ISI和对照组相比没有区别。30毫克/公斤的成功率STZ两次注射组明显高(85%)和这组大鼠2型糖尿病是胰岛素抵抗的一个典型特征,高血糖和血脂紊乱。所有这些症状观察30毫克/公斤STZ两次注射组恢复了小檗碱的治疗。结论。总之,这些结果表明,高脂肪饮食结合多种低剂量STZ(30毫克/公斤每隔周2周)被证明是一个更好的方法来开发一个稳定的2型糖尿病的动物模型,和这个新模型可能适用于药物筛选。

1。介绍

现在已经有一个悲剧性的糖尿病在全世界范围内,增加并联的超重和肥胖流行病。有95%的人属于2型糖尿病。因此,它是伟大的紧迫性找到更好的治疗方法和一种新的策略,可以防治老年人2型糖尿病。为了实现这一目标,适当的实验模型视为必不可少的工具对于理解分子基础,血管和神经病变的发病机制,治疗行为代理和遗传或环境影响2型糖尿病的风险增加。

虽然有很多动物模型(自然以及发达)可用于2型糖尿病的研究(1- - - - - -4),疾病模式的建立和发展他们中的大多数没有出现类似于人类的临床情况。因此,研究人员之间存在持续追求对建立更好的2型糖尿病动物模型通过调整现有的方法,开发新的方法,或两者的结合。

许多研究报道,与高脂肪饮食喂养的大鼠(HFD)开发胰岛素抵抗而不是弗兰克高血糖和糖尿病(5- - - - - -7]。建议HFD可能是一个更好的方法来启动胰岛素抵抗是2型糖尿病的重要特征之一。同时,链脲霉素(STZ)被广泛用于可重复诱导胰岛素依赖型和noninsulin-dependent目前糖尿病诱导β通过烷基化的DNA细胞死亡(8]。虽然高剂量STZ严重损害胰岛素分泌模仿1型糖尿病、低剂量STZ已经知道引起轻微损伤的胰岛素分泌的功能类似于后期的2型糖尿病1,2]。因此,调查人员已经开始开发一个老鼠模型与高脂肪饮食喂养动物密切关注低剂量STZ来模拟疾病的自然历史事件(从胰岛素抵抗β细胞功能障碍)以及人类2型糖尿病代谢特征(1,2,4]。成功建立这样的模型将会更便宜,方便,实用的调查以及测试各种化合物用于治疗2型糖尿病。虽然2型糖尿病的外观模式是通过结合HFD的喂养和低剂量STZ nongenetic治疗,out-bred老鼠,注射剂量STZ及其方法在这些研究不一致。其他报道称,在多个低剂量STZ还可能获得。它已被广泛用于1型糖尿病大鼠和小鼠的发展研究免疫反应在胰腺,自多个低剂量注射STZ诱导一个渐进,自身免疫性破坏β快速杀伤性细胞,而不是由一个高剂量诱导注射(9- - - - - -14]。然而,它还没有报道高脂肪饮食是否有协同效应加速的发展2型糖尿病与多个低剂量STZ。

本研究的目的是开发一个适当的,稳定的动物模型是类似于人类2型糖尿病通过结合高脂肪饮食与多个低剂量STZ注射。因此,我们提供一个合适的动物模型,了解2型糖尿病的可能的细胞和分子机制。与此同时,进行治疗。小檗碱()的主要活性组分黄连,化学名为5 6-Dihydro-9 10-dimethoxybenzo (g) 1, 3-dioxolobenzo quinolizine氯(5、6)。这是常用来治疗腹泻作为抗菌剂。最近,它已经表明,小檗碱用于治疗糖尿病患者(12- - - - - -15]。在目前的研究中,我们将提供小檗碱这个模型来评估它是否能治愈糖尿病引起的高脂肪饮食结合新模式的多个小剂量STZ注射。

2。材料和方法

2.1。材料

STZ购买从σ,胰岛素是购自礼来,长春,中国;葡萄糖、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)检测包从北京获得BHKT临床试剂有限公司有限公司,北京,中国;碘(胰岛素放射免疫检定法工具包是购自天津九个三脚医学与生物工程有限公司,有限公司,天津,中国;其他试剂购自北京通用化学试剂厂,北京,中国。小檗碱是一个礼物从东北制药工厂。

2.2。试验协议

雄性Wistar鼠(200 - 250 g)从实验动物购买控股吉林大学。动物们被安置在标准聚丙烯笼子(三只老鼠/笼)和维护控制房间温度和湿度与12/12-hour光暗周期。普通食物含有5%的脂肪,碳水化合物53%,蛋白质23%,总热值25 kJ /公斤,高脂肪饮食含有22%的脂肪,碳水化合物48%,蛋白质20%,总热值44.3 kJ /公斤被命令从stoye实验动物中心。实验在接下来的三个部分。

2.2.1。第一部分

100 Wistar鼠随机分为5组:对照组(CON1),模型组1 (DM1),模型组2 (DM2), 3 (DM3),模型组和模型组4 (DM4);对照组与普通食物,美联储和其他四组被给予高脂肪饮食4周;四个模型组腹腔注射不同剂量STZ (IP) (STZ只注射一次,DM1: 25毫克/公斤;DM2: 30毫克/公斤;DM3: 35毫克/公斤;DM4: 45毫克/公斤),而对照组小鼠受到车辆柠檬酸缓冲(pH值4.4)的剂量体积0.25毫升/公斤IP,分别。体重和食物摄入量是每周记录。8周注射STZ后,所有的老鼠都禁食12小时;空腹血糖(FBG)进行了分析。成功的利率计算。 The fasting blood insulin (FINS) was measured; intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) and insulin tolerance test (ITT) were carried out in control and highest successful rate model group.

2.2.2。第二部分

60 Wistar鼠随机分成3组:对照组(CON2)、5 (DM5),模型组和模型组6(德国);对照组与普通食物,美联储和其他两组被给予高脂肪饮食4周;两个模型组IP注射低剂量STZ (STZ注射两次,DM5: 25毫克/公斤;德国:30毫克/公斤)。光纤光栅测量,一个星期后,老鼠与光纤光栅< 7.8更易/ L再次注射STZ (DM5: 25毫克/公斤;德国:30毫克/公斤),而控制老鼠给车辆柠檬酸缓冲(pH值4.4)的剂量体积0.25毫升/公斤,分别IP。体重和食物摄入量是每周记录。8周注射STZ后,所有的老鼠都禁食12小时,光纤光栅。成功的利率计算。腹腔内葡萄糖耐量试验(IPGTT)和胰岛素耐量试验(ITT)进行了控制和模型组成功率最高。

2.2.3。第三节

100 Wistar鼠随机分为5组:对照组(CON3),控制+注射STZ组(C-STZ),高脂肪饮食组(HFD),高脂肪饮食+注射STZ组(HFD-STZ)小檗碱治疗高脂饮食加注射STZ组(BER);对照组和控制+注射STZ组与常规食物喂养,和其他三组被给予高脂肪饮食4周;C-STZ, HFD-STZ团体和误码率组注射IP与低剂量STZ(根据第二部分,选择与高剂量组的成功率:30毫克/公斤)。一周后,在这些三组光纤光栅测量,光纤光栅的老鼠< 7.8更易/ L再次注射STZ(30毫克/公斤),而控制老鼠给车辆柠檬酸缓冲(pH值4.4)的剂量体积0.25毫升/公斤,IP,分别。每周测量空腹血糖。注射STZ 4周后,大鼠的空腹血糖与nonfasting≥7.8更易/ L的两倍或血糖≥11.1 L更易被认为是糖尿病。小檗碱(100毫克/公斤体重)是口服药物与车辆悬架通过混合1%的剂量体积Na-CMC 0.5毫升/公斤体重治疗组的大鼠4周。动物的体重和食物摄入量也测量。老鼠被允许继续以各自的饮食,直到研究结束。在研究结束时,IPGTT和ITT公司进行五组; fasting plasma was collected for further measurement of insulin, TG, TC, and glucose. The insulin sensitivity index (ISI) was calculated according to the fasting insulin and glucose concentration.

2.3。测量的光纤光栅,鳍,TG, TC

老鼠禁食12 - 16个小时。从尾静脉血液收集;等离子体是由离心机分离3500 g×10分钟。空腹血糖(葡萄糖oxidase-peroxidase GOD-POD) TC (CHOD-POD,胆固醇氧化酶过氧化物酶),和TG (GPO-POD, glycerol-phosphoric酸氧化酶过氧化物酶)通过使用商用比色测定诊断包根据指令。血浆胰岛素被RIA根据指令化验。

2.4。糖尿病模型成功率和胰岛素敏感性指数

糖尿病模型成功率指糖尿病老鼠的百分比。老鼠的血糖水平和胰岛素水平相同的测量和计算胰岛素敏感性指数(ISI)为Ln(光纤光栅×鳍。

2.5。腹腔内葡萄糖耐量试验

一夜之间迅速(12到16小时)后,老鼠IP注射40%葡萄糖(2克/公斤体重)。收集血液样本的尾巴在0,30岁,60岁,120分钟测量葡萄糖。

2.6。胰岛素耐量试验

胰岛素(0.75 IU /公斤)是由腹腔内注射和收集血液样本0,30岁,60岁,120分钟血糖的测量。价值的比例提出了最初的血浆葡萄糖水平。

2.7。统计分析

数据报告为均值±SEM (/组)。统计分析是由方差分析的一种方式。被认为是实验组和对照组之间的统计学意义。

3所示。结果

3.1。光纤光栅和糖尿病组第一部分的成功率

表1说明了糖尿病成功率(域)和光纤光栅在老鼠与高脂肪饮食喂养结合STZ 25毫克/公斤,30毫克/公斤,35毫克/公斤,45毫克/公斤。是显示在表1的成功率25毫克/公斤,30毫克/公斤,35毫克/公斤注射STZ组很低(10%、35%和40%,分别地。)。然而,45毫克/公斤注射STZ成功率最高(100%),光纤光栅的水平也显著高与对照组()。

3.2。IPGTT、ITT公司和ISI集团的第一部分

我们的数据显示,45毫克/公斤注射STZ (DM4)最高成功率和更高的光纤光栅的水平。因此,IPGTT和ITT DM4和对照组测量葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。如图1(a), DM4显示高血糖控制老鼠相比,在120分钟后葡萄糖注射液。血糖曲线下的面积(更易/ L·min)明显更大的DM4组与对照组[(4000±153)更易与L·最小值和(967±46)更易/ L·分钟,]。探讨胰岛素敏感性的差异,我们执行一个ITT公司在不同的时间点(图1(b))。胰岛素腹腔内,血液收集的测量葡萄糖。在对照组中,葡萄糖浓度迅速下降后胰岛素管理和减少成为重要的30分钟。然而,没有明显区别45毫克/公斤注射STZ组和对照组在ITT公司。这个结果表明,注射STZ 45毫克/公斤后的大鼠胰岛素敏感;ISI(表也支持这一点2)。所有的数据表明,高脂肪饮食与45毫克/公斤注射STZ糖尿病模型开发了一个倾向于1型糖尿病。

3.3。光纤光栅和糖尿病组第二部分的成功率

表3显示,糖尿病患者成功率(域)和光纤光栅的老鼠与高脂肪饮食喂养结合STZ 25毫克/公斤,30毫克/公斤两次注射。这是观察到的成功率25毫克/公斤STZ注射组低(25%)的两倍。然而,30毫克/公斤的成功率STZ两次注射组相对较高(85%),和糖尿病大鼠的数量一直稳定,直到研究结束。光纤光栅的德国马克集团也比对照组显著增加()。

3.4。IPGTT ITT公司和集团的第二部分

自30毫克/公斤STZ两次注射组(德国)有较高的成功率和更高的光纤光栅,IPGTT ITT进行进一步在这组4周(图2(图)和8周3注射STZ后)。如图2(a), 4周注射STZ后,德国马克和对照组的葡萄糖水平达到最高水平在葡萄糖注射液后30分钟,然后慢慢下降在接下来的90分钟。但老鼠相比,德国显示高血糖血糖水平控制在120分钟。血糖曲线下的面积(更易/ L·min)明显提高注射STZ组与控制[(3278±274)更易与L·最小值和(1103±81)更易与L·分钟,]。与此同时注射STZ后8周(图3()),血糖曲线下的面积(更易/ L·min)仍大大增强注射STZ组与控制[(4498±333)更易与L·最小值和(913±47)更易/ L·分钟,]。探讨胰岛素敏感性的差异,我们执行ITT后4周(图2(b)和8周(图)3注射STZ (b))。我们发现,在对照组胰岛素管理后,葡萄糖浓度快速下降;然而,葡萄糖浓度下降缓慢,甚至不拒绝在德国集团在30分钟内。30分钟后,这两条曲线的斜坡是相似的(图2(b))。然而,德国马克初始葡萄糖水平的比例显示是显著高于对照组在120分钟。这些变化还重要的8周后注射STZ(图3(b))。这一结果表明,大鼠30毫克/公斤两次注射STZ后胰岛素抵抗。所有这些数据表明,高脂肪饮食与30毫克/公斤STZ两次注射了糖尿病模型是一种模拟与胰岛素抵抗和2型糖尿病高血糖。

3.5。的变化在30毫克/公斤体重和食物摄入量STZ两次注射组和对照组

根据上面的数据显示,30毫克/公斤注射STZ两次发达与胰岛素抵抗和高血糖的糖尿病大鼠模型。因此,我们测量了体重和食物摄取这组和对照组之间。如表所示4,身体体重增加在研究过程中没有统计两组之间的不同。热量摄取30毫克/公斤STZ两次注射组相比明显高于对照组()。

3.6。实验性糖尿病模型的稳定性

从数据第二部分所示,30毫克/公斤STZ两次注射可能开发一个更好的2型糖尿病大鼠模型。因此,在第三部分中,我们调查了这个实验性2型糖尿病模型的稳定性。

如图4光纤光栅的模型组每周测量;这个结果表明高血糖稳定约14更易/ L 4周注射STZ后注射STZ后8周。

生化参数和ISI的研究提出了在表5。可以看到,高脂肪饮食组体重与对照组相比显著增加;注射STZ chow饮食的老鼠的体重与对照组相比没有显著差异。高脂肪饮食集团提出更高的鳍,TG, TC水平,但没有显著差异在血糖水平与对照组相比。光纤光栅、鳍、TG, TC HFD-STZ组与对照组相比显著增加,三军情报局比对照组要低得多,这表明,胰岛素敏感性显著减少HFD-STZ组与对照组相比。此外,生化参数控制+注射STZ组与对照组没有显著改变。

3.7。有益的小檗碱对糖尿病大鼠的影响

此外,我们观察到的这种动物模型是否适用于医药研究。如图5小檗碱(100毫克/公斤)口头管理改善葡萄糖耐量,和增强胰岛素敏感性。经过4周的治疗,血糖曲线下的面积(更易/ L·min)仍在小檗碱治疗组相比显著降低糖尿病模型组[(2499±167)更易与L·最小值和(3822±344)更易与L·分钟,]。在治疗组,在ITT葡萄糖浓度迅速下降。与此同时,政府小檗碱显著降低光纤光栅,TC, TG水平相比,糖尿病模型组()、空腹胰岛素是改变但不显著,ISI是高于模型组,结果表明,小檗碱改善胰岛素敏感性和血脂异常。小檗碱治疗减少了体重轻微但与HFD-STZ组相比无显著差异(表5)。这个数据也证明了我们开发的糖尿病模型可能适用于医药研究。

4所示。讨论

2型糖尿病是一种复杂的、异构的和多基因疾病。有许多潜在因素导致高这些2型糖尿病患者的血糖水平。一个重要因素是人体的胰岛素抵抗,基本上忽略其胰岛素分泌。第二个因素是胰岛素的产量下降β胰腺的细胞。因此,一个单独的2型糖尿病患者可能的胰岛素分泌不足和行动。因此,实验动物模型,旨在模仿人类2型糖尿病的发病机制和临床特征最好应该这两个特征。在动物模型中,继承了高血糖症和/或肥胖在某些菌株已广泛用于调查,如ob / ob鼠标,Zucker老鼠,OLETF大鼠。然而,这些天生的糖尿病模型是比较贵,而且不容易繁殖。因此,2型糖尿病在啮齿动物模型研究了一代人时间短等原因和经济方面的考虑。

目前,许多研究报道,高脂肪饮食(HFD)喂养大鼠胰岛素抵抗的发展5- - - - - -7]。同时,低剂量STZ已经知道引起轻微损伤的胰岛素分泌类似于2型糖尿病的后阶段的特点(1,2]。因此,调查人员已经开始开发一种由高脂肪饮食后小剂量STZ大鼠模型,将密切模仿自然历史的疾病(1,2,4]。虽然2型糖尿病的外观模式是通过结合HFD的喂养和低剂量STZ nongenetic治疗,out-bred老鼠,注射剂量STZ及其方法在这些研究不一致。

本研究的目的是开发一个2型糖尿病的动物模型,模仿人类的自然历史和代谢特征综合症和能够响应医药治疗。另一方面,本研究的目的是开发一个既不是遗传的,也不是遗传肥胖动物模型,和方便,相当实惠,成功率高。结果表明,我们已经实现了我们的目标。

目前的研究是确定的主要尝试足够低的剂量STZ HFD患2型糖尿病模型大鼠有更高的成功率和没有太多的胰岛素缺乏。不同剂量STZ(25 30 35、45毫克/公斤,IP)进行了研究。注射STZ(45毫克/公斤,IP) 4周后弗兰克高血糖引起的高脂肪饮食有100%的成功率,这与文献报道一致(1]。此外,这些老鼠胰岛素敏感,呈现一种insulin-deficient症状相比控制老鼠。因此,这些fat-fed老鼠与高剂量STZ(45毫克/公斤)被认为是类似于1型糖尿病。相比之下,STZ(30毫克/公斤35毫克/公斤,IP)未能产生显著高血糖HFD-fed老鼠。Srinivasan等人报道了类似的结果表明STZ(25毫克/公斤,35毫克/公斤,45毫克/公斤,而55毫克/公斤,一旦注入)可以用来开发糖尿病模型。自剂量STZ(25毫克/公斤)没有产生显著的高血糖,和fat-fed / STZ(45 - 55毫克/公斤,IP)糖尿病大鼠表现出相当高的葡萄糖和身体重量大幅减少,他们最终选择了35毫克/公斤注射STZ最佳剂量,但这种方法的成功率并没有被报道(2]。

我们的第二个研究试图找出如果多个低剂量STZ可以达到我们的目标(2型糖尿病)的高成功率和性能。多个注射小剂量STZ诱导糖尿病及其并发症模型已报告在许多研究[9- - - - - -14]。多种低剂量STZ大鼠和老鼠可能引起毒性和免疫反应呈现逐步高血糖。调查员从韩国报道,男性Sprague-Dawley老鼠显示快速的化学破坏胰腺癌β细胞时,他们都被赋予了一项单一的大剂量注射STZ(80毫克/公斤,IP);有趣的是,多个小剂量注射STZ(20毫克/公斤连续5天,IP)可以诱导一个渐进,自身免疫性破坏β细胞(13]。小赖特和花边报道,老鼠接收多个低剂量STZ(25毫克/公斤IP在每周间隔3周)只有没有患糖尿病。免疫佐剂的协同作用,促使与多种低剂量STZ诱导的糖尿病大鼠(14]。因此,它可以证明,多种低剂量STZ诱导的渐进破坏行动β细胞。这可能发生在2型糖尿病的失代偿性的阶段。高脂肪饮食已被广泛用于开发胰岛素抵抗[5- - - - - -7]。因此,高脂肪饮食结合多个低剂量STZ可能开发一个合适的2型糖尿病动物模型也不仅提出了胰岛素抵抗,胰岛素缺乏。当前的研究证明了这一点。我们的数据表明,多种低剂量STZ(30毫克/公斤IP在每周间隔2周)产生弗兰克高血糖与高成功率HFD-fed老鼠,但是,并没有产生相同的常规chow-fed老鼠。三军情报局和ITT演示这些糖尿病大鼠的胰岛素抵抗。因此,HFD结合多种低剂量STZ(30毫克/公斤,在每周两次注射间隔)可以更认为2型糖尿病的病理生理学特征。

此外,我们开发生产高血糖的糖尿病模型约14.5更易/ L,合理治疗的治疗性化合物作为临床实践。在治疗上,很难减少胰岛素的升高血糖,除了政府。小檗碱、黄连的主要活性组分,临床上用于治疗腹泻作为抗菌剂。早在1986年,来自中国的调查人员已经开始报告小檗碱的降糖效果。1999年,元报道,小檗碱治疗糖尿病临床施加有益的影响;其他调查也证明了它的角色在诊所治疗2型糖尿病15- - - - - -18]。小檗碱的抗糖尿病的作用机制涉及多种因素。殷等人报道,小檗碱通过感应改善葡萄糖代谢的糖酵解在许多细胞系包括3 t3-l1脂肪细胞,16种肌管,C2C12肌管,和H4IIE肝细胞,这可能与抑制葡萄糖的氧化在线粒体19,20.]。其他人透露,底层机制改善胰岛素抵抗,降低血糖小檗碱可能通过激活活化蛋白激酶(AMPK)途径21]。它也表明,抑制IKK的磷酸化β可能是一个代数余子式的小檗碱在实现其抗炎和insulin-resistance-improving效应(22]。最新的研究也证明了小檗碱抑制fructose-induced胰岛素抵抗大鼠可能通过增加HNF-4表达式α在肝脏23]。HNF-4α是一个积极监管机构PEPCK增加HNF-4呢α将导致增加糖质新生。因此,我们管理小檗碱抗糖尿病药在目前的研究中,我们的结果也表明,小檗碱治疗可以减少胰岛素抵抗,改善葡萄糖耐量。与此同时,我们还发现,小檗碱能纠正脂质代谢紊乱,这表明,小檗碱的治疗可能在糖尿病并发症中发挥重要作用。,我们开发的糖尿病模型是合适的调查不仅发病机制,而且药物的选择。与此同时,目前的研究认为糖尿病的发病率。这种方法可以成功地产生2型糖尿病大鼠模型,以及提供足够数量的糖尿病大鼠一次这将使调查更有说服力。

最终,我们的研究表明,HFD和多个低剂量的注射STZ可以有效地用于生成一个老鼠模型,模拟自然历史和人类2型糖尿病的代谢特征。也有用在评估治疗效果的化合物在治疗2型糖尿病。

承认

本研究的研究是由来自中国国家自然科学基金的资助(30772604)。