文摘
我们评估bcl - 2家族成员在mRNA的表达、蛋白质含量以及Caspase-3活动,为了研究细胞凋亡的发生STZ-induced糖尿病大鼠的海马。我们选择24 Wistar鼠;其中一半是糖尿病患者的腹腔内注射单60毫克/公斤剂量链脲霉素(STZ、IP),而其他人则收到了生理盐水和担任控制。bcl - 2的表达,,伯灵顿信使rna和蛋白质测定使用rt - pcr和免疫印迹,分别。Caspases-3活动是由使用Caspase-3 / CPP32荧光测定。结果表明,信使rna和蛋白质的bcl - 2和水平较低的海马体糖尿病组比对照组,而伯灵顿的表达在糖尿病大鼠海马是高于控制mRNA和蛋白水平()。高血糖发现提高6.9倍海马caspase-3活动与对照组相比,糖尿病组()。因此,糖尿病的感应与伯灵顿比率增加/ bcl - 2、Bax /,在海马caspase-3活动增加,这表明细胞凋亡在海马地区被看好。
1。介绍
糖尿病是全球最严重的问题之一,这是明显上升。目前,世卫组织账户有1.77亿糖尿病患者,而2030年这个数字预计将翻一番1]。糖尿病是一种异构的代谢障碍诊断的高血糖产生的胰岛素分泌受损,胰岛素抵抗行动,或两者兼而有之(2]。高血糖,糖尿病条件下发生,通常是与并发症有关,如心血管疾病、肾衰竭、视网膜病变和外围,自主神经病变(3,4]。近年来,有人建议,糖尿病也会影响中枢神经系统(5,6]。在中枢神经系统内,海马体被认为是一个特定的变化与糖尿病相关的目标(7]。海马体是大脑边缘系统的一部分,作为一个关键集成中心学习和记忆等认知功能在哺乳动物的大脑8]。据报道,在内存中障碍,学习和认知的应用都是口头较多、笔头比非糖尿病患者的糖尿病人。在1型糖尿病中,海马神经元极其脆弱的(9- - - - - -14]。对高血糖影响神经元的机制(15]。
细胞凋亡可以提出一个可能的高血糖诱导海马神经细胞死亡的机制。已经表明,细胞凋亡与几个神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森氏症、亨廷顿氏舞蹈症,和肌萎缩性脊髓侧索硬化症11,16]。细胞凋亡是由基因发生特殊的形态学特征,包括染色质缩合、收缩的细胞和细胞核,膜起泡,和DNA碎片(17]。有几个因素导致细胞凋亡,但关键元素在两个主要家庭的蛋白质分类包括半胱天冬酶酶和bcl - 2家族(18]。半胱天冬酶酶作为级联工作和半胱天冬酶3是最重要的家庭成员也发挥着有效的作用在中枢神经系统神经元细胞凋亡(19]。bcl - 2家族是一组胞质蛋白调节细胞凋亡。这个家庭的两个主要群体,bcl - 2、Bax蛋白,在功能上是反对:bcl - 2和Bcl-xl采取行动,抑制细胞凋亡,而伯灵顿抵消这种效应(19,20.]。
因此在本研究中,我们评估bcl - 2家族成员在mRNA的表达、蛋白质含量以及Caspase-3活动,为了研究细胞凋亡的发生STZ-induced糖尿病大鼠的海马。
2。材料和方法
我们选择24雄性Wistar鼠体重(200 - 250 g)在这项研究中。动物被随机分为两组(每组= 12):控制(C)和糖尿病(D)组。他们在动物房(阿维森纳研究所、马什哈德大学医学科学,马什哈德,伊朗)在实验开始前一周为适当的适应环境控制条件下的照明光(12小时/ 12小时黑暗)和温度23±2°c,他们被安置在理想的实验室条件下,保持在标准颗粒饮食和水随意整个实验周期。所有的程序都按照指南的实验室动物保健和使用马什哈德大学医学科学,伊朗。
糖尿病在夜间禁食诱导实验组由单个STZ腹腔注射(σ,60毫克/公斤体重)溶解在生理盐水,而对照组只注射了生理盐水(21]。STZ管理局三天后,尾静脉血糖水平是衡量所有的动物。250毫克/分升以上的血糖水平被认为是糖尿病(22]。在第八周结束的时候,我们测量大鼠的体重和血糖水平。然后,动物麻醉与氯仿和头骨开放沿着中线和大脑被放置在一个冰冷菜板。脑膜被仔细地删除和海马解剖的半球,提前在液态氮冷冻和储存在−70°C提取DNA, RNA和蛋白质的摄取量。
2.1。隔离的总RNA和互补脱氧核糖核酸的合成
RNA被隔离使用TriPure隔离从老鼠的海马组织处理试剂(罗氏公司、德国)根据制造商的指示。总RNA和MBI反向转录(RT) cDNA RevertAid (Fermentase、生命科学、立陶宛)根据生产厂家的说明书,和互补脱氧核糖核酸样本存储在-20°C。
2.2。rt - pcr
半定量逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)进行了确定bcl - 2的水平,Bcl-xl,伯灵顿mRNA表达。20的rt - pcr混合物(最后一卷μL)包含3μL (cDNA、10μL试剂盒的多重PCR大师混合2 x(试剂盒、德国)和10 pmols bcl - 2,每个引物互补特定的Bcl-xl,伯灵顿序列以及GAPDH (Glyceraldehydes-3-phosphate脱氢酶;GAPDH基因序列作为内部控制(表)1)。样本变性,享年95岁°C 15分钟,并使用95周期的放大°C 30秒,60°C 80秒,72°基因和5 C为45秒伯灵顿95年的周期°62年30秒,C°C为60秒,72°25 C 30秒,以及95年的周期°64年30秒,C°C 80秒和72年°C为bcl - 2和Bcl-x 30秒l基因最终伸长72紧随其后°C 3分钟Corbett研究thermocycler(澳大利亚悉尼)。最优数量的周期已经选定的所有三个基因的扩增实验,这样放大的指数范围和还没有达到一个高原。5毫升的最后放大产品ethidium-stained运行在3%琼脂糖凝胶和拍照。量化的结果是通过测量光密度的标记带,使用计算机成像程序Kodack-1D(美国)。值归一化GAPDH强度水平。
3所示。免疫印迹分析
组织收集和冰冷的均质均质化缓冲(50毫米Tris-HCl, 150毫米氯化钠,EDTA 1毫米,0.5毫米Triton x - 100, PH值7.4)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒平板电脑(罗氏公司、德国)。与Bio-Rad蛋白质测定的蛋白质测定方法。海马蛋白质溶解产物(50μg /)相隔SDS-PADE减少条件下(12.5%)和转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)(美国微孔)。膜处理Attoglow免疫印迹系统装备,根据制造商的协议(美国Biochain)。短暂,屁股被封锁阻止缓冲区(5%不胖奶粉在PBS)。阻塞后,屁股被孵化与anti-Bcl-2多克隆抗体(1/500,v / v) anti-Bcl-xl多克隆抗体(1/1000,v / v)和anti-Bax多克隆抗体(1/250,v / v)为20小时(美国Biovision) 4°c .墨迹洗了4乘以0.1%渐变20在PBS和孵化合conjugated-secondary抗体(美国Biochain 1/5000, v / v)在室温下1小时。bcl - 2, Bcl-xl和伯灵顿蛋白质乐队使用增强可视化chemiluminescnces (ECL)方法(英国syngene Bioimaging、系统)。
4所示。检测Caspase-3活动
Caspase-3活动决心使用Caspase-3 / CPP32荧光测定工具包(K105)从Biovision购买,Inc .(美国加州山景城)。对于每一个化验,50使用g的组织细胞溶解产物。样本读入一个荧光计装备(Jasco、fp - 6200、日本)买下400 nm励磁和505 nm排放过滤器。Fold-increasein Caspase-3活动是由比较荧光7-amino-4-trifluoromethyl香豆素与STZ海马控制和治疗。
5。统计分析
所有使用的结果进行评估结果分析了Mann-Whitney和配对t测试。一个概率水平的P<。05年被认为是显著的。
6。结果
糖尿病大鼠血糖的浓度都超过250 mg / dl STZ管理后3天。血糖水平的最后8周在糖尿病组与非糖尿病患者相比显著增加(控制)组()。
起初,两组体重相似。体重增加在对照组8周;然而,糖尿病组相比失去了体重控制的()(表2)。
6.1。伯灵顿,Bcl - 2和Bcl -基因在mRNA水平
如图1,伯灵顿的表达增加海马STZ-induced糖尿病组与对照组相比,虽然Bcl-x和bcl - 2的表达l是减少了。此外,伯灵顿/ bcl - 2和伯灵顿/ Bcl-xl海马体的比率增加STZ-induced糖尿病组与对照组(数字2(一个)和2 (b))。
(一)
(b)
(c)
(一)
(b)
6.2。伯灵顿的表达、Bcl - 2和Bcl -蛋白质
八周后,proapoptotic Bax的表达蛋白质增强海马STZ-induced糖尿病组与对照组大鼠相比。另一方面,bcl - 2的表达抗凋亡和Bcl-xl蛋白质是减少海马STZ-induced糖尿病组与对照组的老鼠(图3)。
6.3。评价Caspase-3活动组织提取物
Caspase-3活动在STZ-induced明显高于糖尿病组与非糖尿病患者相比组(174.2±36和25±10.25,)。发现高血糖增加6.9倍海马组织caspase-3活动在糖尿病组与非糖尿病患者相比(图组4)。
7所示。讨论
尽管广泛的调查,但机制(s)激活凋亡通路在糖尿病患者的大脑还没有完全理解(23]。在目前的研究中,我们显示高血糖的影响在bcl - 2家族蛋白的表达水平和Caspase-3 STZ-induced糖尿病大鼠海马的活动。
我们的研究结果表明,8周后,伯灵顿的表情大大增加在STZ-induced糖尿病大鼠海马信使rna和蛋白质含量,而bcl - 2的表达和Bcl-xl在信使rna和蛋白质含量显著降低。此外,伯灵顿/ bcl - 2、Bax / Bcl-xl比率,凋亡细胞死亡的一个主要指标,显著增加;标志着高血糖诱导的海马细胞凋亡STZ-induced糖尿病老鼠可能由线粒体通路(24]。
其他研究表明,糖尿病中枢神经系统发生凋亡以及neuronal-related组织,包括周围神经系统、视网膜神经节,(11,25,26]。几个实验模型支持,伯灵顿的超表达可以诱导细胞凋亡在细胞体内和体外11,27]。此外,细胞凋亡被报道成神经细胞细胞培养对待糖尿病人血清(28]。·沙里夫等人表明,多余的葡萄糖浓度增加导致了伯灵顿表达蛋白质,然后诱导PC12细胞凋亡(15]。细胞凋亡,减少在bcl - 2表达的主要神经元中发现糖尿病大鼠的脊髓背根神经节(29日,30.]。
在这项研究中,我们能够揭示proapoptotic蛋白的激活和抑制抗凋亡蛋白在STZ-induced糖尿病大鼠海马信使rna和蛋白质含量。有两类调节蛋白bcl - 2家族证明相反的对细胞凋亡的影响:凋亡成员包括bcl - 2和Bcl-xl保护细胞免受某些形式的细胞凋亡,proapoptotic成员包括伯灵顿,贝克,Bcl-x年代程序性细胞死亡的进展。凋亡信号收敛到一个共同的死亡通路,还存在执行细胞凋亡和bcl - 2家族蛋白调节(31日]。有绝对的证据表明,三个主要的信号引起apoptogenic线粒体的释放介质包括proapoptotic bcl - 2家族的成员,胞内钙水平升高,活性氧自由基(ROS)或(32]。此前透露,活性氧和一氧化氮(NO)可以改变线粒体膜电位通过线粒体渗透性转换孔开放注射(mPTP药物),细胞色素C的释放和随后的激活还9和3,最终导致细胞死亡。bcl - 2家族成员的赞成和抗凋亡。之间的平衡,从这个家庭有一个核心作用和抗凋亡信号在细胞色素C的释放及其成功后果(33]。
此外,我们发现caspases-3的活性,细胞凋亡的效应起着关键作用链接的承诺和退化阶段(34),显著增加STZ-induced糖尿病大鼠的海马与非糖尿病的老鼠相比,这与先前的研究一致(35- - - - - -38]。
并发与我们的研究结果,文森特等人表明,在糖尿病高血糖观察与氧化应激相关的神经细胞和雪旺细胞死亡通过增加半胱天冬酶3活动(39]。
这发生在高血糖诱导细胞凋亡的确切机制还不清楚,但它已经表明,高血糖可以提高海马神经元细胞中活性氧导致的神经细胞胞内钙(40]。罗素等人显示线粒体活性氧过剩由于高血糖去偏光线粒体膜ATP活性下降和增加Caspases-3和9导致Caspase-dependent凋亡[29日]。因此,糖尿病的感应与的比率增加伯灵顿/ bcl - 2、Bax / Bcl-xl以及增加海马caspase-3活动表明,细胞凋亡在海马地区被看好。在我们的实验中我们也等替代方法,银染色为暗神经元,体视学、电子显微镜和DNA梯法支持获得的结果与bcl - 2家族基因表达和caspase-3活动(未出版)。
8。结论
一起服用,这可能最终会得出结论,STZ-induced高血糖导致海马神经元细胞死亡,而细胞凋亡起着重要的作用可能通过伯灵顿的一个增量/ bcl - 2、Bax / Bcl-xl比,以及增加caspase-3活动。Diabetic-induced记忆和认知赤字可能是部分原因是促进细胞凋亡和本研究提供进一步的知识机制参与STZ-induced海马细胞凋亡。
承认
格兰特马什哈德大学医学科学所提供的支持(妈妈)(没有。85146)。