文摘
c -肽,乳沟胰岛素原分子的产物,长期以来被认为是生物惰性的,仅仅是作为一个服务代理的标志胰岛素释放。最近的调查结果表明c -肽的生理保护作用当I型糖尿病患者管理。数据表明,c -肽似乎绑定在摩尔浓度细胞表面受体是最有可能g蛋白耦合。绑定的c -肽启动多个细胞效应,引发细胞内钙,PI-3-kinase活动增加,刺激的Na+/ K+atp酶,增加以挪士转录激活MAPK信号通路。这些细胞信号传导效应研究了多种细胞类型的多个组织。这些观察整体提高的可能性c -肽可以作为一个潜在的治疗代理长期并发症的治疗或预防糖尿病。
1。介绍
历史上胰岛素原c -肽一直被视为一种惰性胰岛素合成和加工的副产品。然而,在过去的十年里,出现了一个扩大的证据从几个实验室报告体外和体内c -肽的影响巨大的潜在的病理生理学和治疗糖尿病的相关性。观察,c -肽可能表现出特征的肽激素有益影响神经、肾和微血管功能在糖尿病患者(糖尿病动物和1- - - - - -7),激发了兴趣的分子机制引起c -肽的细胞信号转导到细胞和器官的行为改变。
2。c -肽受体
显然如果c -肽肽种行为,有必要假设一个受体的存在。事实上,特定的和可替换的绑定125年第一次证明了I-labelled c -肽Flatt et al。8)派生一个曲线Scatchard情节具体的c -肽结合胰岛b细胞。
随后,用复古的序列和all-D-amino酸c -肽对映体、被罩等。9)建议C-peptide-induced改善神经功能和血管通透性血液流动在糖尿病增加Na+K+腺苷三磷酸酶活动并非源于c -肽受体结合立体定向的方式。相反,它是假定的c -肽的生物活性依赖于定义糟糕的膜的相互作用,由于结构特点与c -肽序列,但独立于它的方向或手性。midportion的c -肽序列,主要是守恒的,组成一个高比例的非极性氨基酸侧翼C16脯氨酸还涉嫌参与了这个活动。
其他研究人员也研究了c -肽片段使用Na生物活性+K+腺苷三磷酸酶活性在大鼠肾小管部分读出(10]。两段c -肽的演示功能的重要性。大鼠c -肽羧基末端五肽、EVARQ引起100%的完整的c -肽的活性而其余部分的分子,缺乏这5个氨基酸序列,完全是不活跃的。在这只老鼠系统中,人类c -肽的终端五肽(EGSLQ)引起75%活动;特别是在位置1谷氨酸和谷氨酰胺在位置5在哺乳动物通常是守恒的。定义良好的c端功能序列相似还发现在胃泌激素和缩胆囊素。总的来说,的行为C-termimal五肽在这些研究是典型的肽配体与一个特定的受体交互。相比之下,几个c -肽midregion序列能够部分概括完整的活动分子,但表现出截然不同的性质。有关这个地区活动未见des - -C-peptide第27 - 31(),和几个包含序列显示一些活动分子违背自然的酸。这些片段的活性下降,如果他们的长度大于9个氨基酸。 This behaviour is not reminiscent of peptide-receptor interactions, but similar to the nonspecific type interactions of C-peptide with plasma membranes postulated by Ido et al. [9]。
提供的活动如何平衡这两个地区的c -肽分子体内表现还不是很清楚。最近的研究表明,有效的激活信号通路需要守恒的谷氨酸残基的存在位置3,11日和27的c -肽,helix-promoting残留在氨基的存在(11]。结合相关数据其羧基端,整个画面现在新兴的构效关系的三重结构的c -肽分子是一个终端部分参与功能的相互作用,与midregion形成连接段(11]。
rhodamine-labelled分析人类的c -肽绑定到各种各样的体细胞膜已经使用高度敏感的荧光相关显微镜,允许在单分子水平测量膜的相互作用在sub-fL卷12]。观察高亲和性特定绑定的c -肽协会速率常数3海里;half-maximal占领结合位点是在0.3 nM c -肽;并在0.9 nM c -肽完全占领。结合位点的最大数量,大约1000 - 1500细胞,被发现对人类肾小管细胞膜。绑定可以通过完整的c -肽过剩和流离失所的c端五肽,但不是通过一个随机组装炒c -肽、胰岛素和胰岛素样生长因子(IGF) -我或IGF-II。重要的是,c -肽的绑定也可以主要由百日咳毒素抑制(PTX)预处理细胞(12]。总的来说,这些结果强烈支持一个特定的存在GTP-binding protein-coupled c -肽受体(GPCR),要么蛋白有关亚基克我或Go,这与c端penatpeptide区域的c -肽分子。
试图确定一个c -肽受体基因克隆策略或利用蛋白质组学方法,到目前为止,未获成功。西郊鹭鹚等人最近报道他们无法分离出c -肽受体通过筛选人肺成纤维细胞λ噬菌体cDNA表达文库或蛋白质组学分析的蛋白质co-immunoprecipitated使用anti-C-peptide从c -肽治疗人类成纤维细胞抗体(13]。这个信息发表在人们讲论文的背景下,因此方法描述必然是短暂的。当然这些数据并不能证明一个受体不存在,然而仍然是完全可能的,替代方法可以成功地识别c -肽受体在未来。努力在这个领域是合理的和迫切需要。
3所示。c -肽和Na+k+腺苷三磷酸酶
Na+K+腺苷三磷酸酶是一种无处不在的膜相关蛋白复合物,利用ATP水解的能量来驱动的counter-transport钠和钾质膜。人们普遍认为受损Na+K+atp酶活性存在于各种细胞类型的糖尿病,导致糖尿病并发症的发病机制14- - - - - -17]。第一个迹象表明,c -肽调节细胞内酶的活性可能来自Na的研究+K+腺苷三磷酸酶。
肾小管是一个特别的丰富来源Na+K+腺苷三磷酸酶和Ohtomo等人所描述的这种酶的激活大鼠c -肽在大鼠肾小管低到高摩尔浓度(18]。这种效应被PTX废除,由Ca抑制2 +-calmodulin-dependent蛋白磷酸酶2 b钙调磷酸酶抑制剂吸收FK506,出现细胞内钙依赖2 +浓度。有趣的是c -肽在Na的刺激效果+K+腺苷三磷酸酶在这些实验大大增强了神经肽Y (NPY)。
扩展这些发现,同一组研究人员研究了c -肽片段的能力激活Na+K+atp酶在大鼠肾近端小管部分10]。共36个不同的多肽和氨基酸对应于不同地区的完整的c -肽。Carboxy-terminal利乐,penta-peptides引起全活动同时midregion肽引起部分活动。这些结果是在广泛的共识和被罩等。9](如上所述),第二年发表的c -肽结合的研究(12),总体来说,他们支持的新兴概念c -肽绑定到一个特定的受体与后续下游效应器酶的激活。
出于这些观察C-peptide-induced增加Na+K+atp酶活性和改善神经系统和肾脏功能有关,提出,c -肽水平低和减少Na+K+红细胞细胞膜atp酶活动中观察到的1型糖尿病可能是相关的。因此,它是发现,在1型糖尿病患者和完整的c -肽缺乏,红细胞活动Na+K+腺苷三磷酸酶一直低于健康对照组(19]。在2型糖尿病,红细胞Na+K+腺苷三磷酸酶显著低于来患者比口服治疗那些代理。禁食c -肽水平确实是唯一的变量研究,独立与Na+K+腺苷三磷酸酶活性(19]。随后,结果表明:注入c -肽的1型糖尿病患者导致血浆cGMP和红细胞膜钠的增加+K+atp酶活性。c -肽剂量反应是明显在这些研究最大血浆c -肽水平的观察,取得了良好的效果3.5 nM (20.]。类似的改善大鼠神经Na+K+atp酶活性和功能也被观察到在外生管理c -肽(9]。
c -肽的机制(s)激活Na+K+atp酶已被检查。使用隔离大鼠肾脏髓厚提升肢体小管(MTALs) c -肽被发现激活Na+K+腺苷三磷酸酶在生理浓度(21]。此外,与c -肽治疗MTALs导致磷酸化的Na+K+腺苷三磷酸酶子单元和Ca的易位2 +端依赖蛋白激酶C (PKC)细胞膜,活化的索引。这些后者的影响都被PKC抑制剂(21]。
总的来说,研究Na+K+腺苷三磷酸酶活性划定一个刺激信号作用的c -肽的生理依赖于细胞内钙浓度2 +PKC和敏感PTX表明c -肽GPCR的存在。替代c -肽在动物和糖尿病患者糖尿病对Na有有益的影响+K+腺苷三磷酸酶活性在各种组织受到糖尿病并发症的影响。
由于这个证据表明c -肽Na+K+atp酶,也考虑到抗利尿激素刺激Na+K+腺苷三磷酸酶活性,Maestroni et al。22]研究了c -肽影响最近描述后叶加压素受体;vasopressin-activated钙动员受体(VCAM-1)。他们发现在人类皮肤成纤维细胞和间质细胞,c -肽的表达增加VCAM-1 RNA和蛋白质含量(22]。影响最大,由PTX 1 nM c -肽和抑制。尽管没有直接联系C-peptide-induced增加VCAM-1和增强Na+K+atp酶活性进行了研究,增强抗利尿激素行动通过upregulation VCAM-1提供了进一步的c -肽作用机制有关Na+K+腺苷三磷酸酶。
4所示。c -肽的影响内皮一氧化氮合酶(以挪士)
一个一致的观察后体内管理c -肽在1型糖尿病微血管血流量的增加,组织和器官包括肌肉、皮肤、和肾脏23]。的可能性,这些影响可能是由c -肽调节一氧化氮(NO)提供的首次发现,增加葡萄糖利用率在糖尿病大鼠刺激通过c -肽链脲霉素敏感的共同抑制NOS N-monomethyl-l-arginine (L-NMMA) [24]。这一发现与早期的研究一致,描述了一氧化氮通路葡萄糖运输和代谢的肌肉组织(25,26]。随后,表明,c -肽介导的小动脉的扩张依赖没有(27,28]。
机制的细节c -肽的能力没有提供生产增加Wallerath et al。29日]。使用牛主动脉内皮细胞模型(BAEC),这些研究者报道,在生理浓度餐后6.6 nM, c -肽刺激细胞内钙释放间接在上升2 +。这些作者推测,c -肽信号导致激活的Ca2 +敏感的内皮NOS增加Ca后(以挪士)2 +涌入,从而解释在很大程度上通过影响体内观察到的c -肽(29日]。
其他工人已经证明upregulation c -肽的表达以挪士。在BAEC,增强没有释放了c -肽伴随着upregulation以挪士基因的转录(30.]。这种效应似乎依赖于上游磷酸化和激活细胞外signal-regulated促分裂原激活蛋白激酶(ERK)。
激活c -肽没有系统的信号也可能有其他的后果。在c -肽,注入大鼠表达以挪士是增加基底主动脉没有生产。减少细胞表面粘附分子的表达P-selectin和ICAM-1微血管内皮观察结果白细胞/内皮交互减(31日]。
5。刺激的有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPKS) c -肽
MAPKs是进化保守的细胞表面受体或酶联系化学和物理压力关键监管目标细胞内(32- - - - - -34]。MAPKs使磷酸化丝氨酸和苏氨酸和多个目标,因此,控制增长等许多重要的细胞功能,基因表达和细胞生存和适应。MAPK家族包括erk 1和2,c-Jun n端激酶(JNK1, JNK2 JNK3), p38 (p38,人们,人们、p38δ)和ERK5。
近年来,一些报告描述了c -肽的能力诱导磷酸化和激活MAPK家族的成员。研究在这一领域发展的初始动力从c -肽之间的协同作用的早期观察和NPY信号激活的Na+K+atp酶(18]。NPY是众所周知的激活MAPK [35,36),因此这一发现促使Kitamura和他的同事们研究MAPK的可能性c -肽介导的信号,在小鼠胚胎成纤维细胞系瑞士3 t3 (37]。同时使用免疫印迹的磷酸化ERK1和ERK2 phosphospecific抗血清,体外激酶试验的读数ERK激活,这些工人表明孵化与c -肽3 t3细胞导致的激活ERK明显的浓度低至1点和最大1 nM c -肽(37]。这种刺激效应也与NPY,和激活ERK NPY和c -肽被PTX废除。制动顺序和所有人类c -肽分子酸刺激的兵。并不是所有的细胞类型测试,这些工人对c -肽ERK激活。没有看到3 t3-l1细胞效应,L6E9肌肉细胞HepG2肝癌细胞,NG108.15神经母细胞瘤细胞,或C6神经胶质瘤细胞(37]。
激活ERK参与以挪士基因的转录,事件之前也显示增加了c -肽(见上图)。为了链接这些现象,研究进行LEII鼠肺毛细血管内皮细胞检查c -肽的能力来激活转录因子(38]。在这个细胞类型,c -肽刺激p38和ERK MAPK活动,但不是c-Jun n端激酶。相比之下,胰岛素是只能激活ERK但不是p38 MAPK。此外,c -肽激活营响应元件(CRE)结合蛋白(分子)/激活转录因子- 1 (ATF-1) p38但不是ERK-dependent方式,造成这些转录因子CRE有约束力。因此,这是证实,增强以挪士转录后BAECs c -肽治疗确实是MAPK-dependent [39]。因此c -肽反应不同细胞类型之间的差异明显存在。在BAECs,以挪士需要ERK激活转录,而转录因子激活LEII细胞遵循c -肽p38的刺激。
肾小管细胞的损失是糖尿病肾病的一个突出特征。因此管状细胞生长和生存的意义可能是由c -肽调制信号。负鼠的肾脏(OK)近端肾小管细胞中被永久地传颂行c -肽也有说服力地激活ERK,最大限度的浓度下降300点,之后与一个钟形的剂量反应曲线(40]。此外,c -肽也诱导Akt激活的细胞。这个事件是渥曼青霉素敏感,表明phosphatidylinositide-3-kinase (PI-3-kinase)激活。Akt激活显示最大效应的剂量反应曲线的c -肽浓度5 nM,此后保持不变的c -肽浓度100海里,因此从对ERK激活截然不同。此外,c -肽Ca的涌入造成的2 +成的好细胞PKC的顺向易位和激活是绝对依赖40]。这些发现符合Tsimaratos等人的早期研究显示PKC-induced激活肾脏钠+K+atp酶c -肽暴露的管状部分(21)(见上图)。最重要的是,这些信号事件与重要的增强扩散功能结果在c -肽治疗细胞(40]。所有这些事件敏感PTX再次提供的证据可能存在GPCR的c -肽。
最近人们发现c -肽促进低分子量的易位GTP-binding蛋白质,ρ,从细胞质到人类肾脏近端肾小管细胞的膜41]。这种效果是完全依赖于上游激活磷脂酶C (PLC)。事实上,在这些细胞ERK的活化物,以及PKC-ε-δ每个敏感PLC抑制,表明c -肽的专性依赖于上游PLC激活。再次,所有c -肽是PTX敏感刺激的影响(41]。
c -肽的分子机制激活MAPK现在可以描述一些精度。信号转导通路包括:(1)c -肽结合GPCR PTX敏感;(2)PLC的激活;(3)随后增加甘油二酯和胞内钙2 +水平刺激几个PKC亚型;(iv) PKC-dependent激活和易位的RhoA质膜;和MAPKs (v)磷酸化和激活。
6。c -肽激活Pi-3-Kinase
π3-kinases家族的酶,使磷酸化的羟基3 phosphatidyinositol肌醇环的位置。PI-3-kinases调节一个非常多样化的细胞功能,包括生长、增殖,生存、分化、能动性,和胞内运输42]。PI-3-kinases也胰岛素信号通路的重要组成部分,这是大量糖尿病的兴趣。许多这些功能完成测试题的相关PI-3-kinase激活protien激酶B(一种蛋白激酶)42]。
健壮的c -肽激活PI-3-kinase现在已经证明了一些作者在不同的细胞类型。因此,众所周知,c -肽的生理浓度可以调节几个方面PI-3-kinase好的细胞信号通路(40)、瑞士3 t3成纤维细胞(37[],SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞43),人类CD4+T细胞(44)16种肌母细胞(45]。作为一个直接后果,现在意识到刺激的PI-3-kinase c -肽单独行动负责(i)增强神经细胞和肾小管细胞增殖的40,43];(2)增加T细胞迁移(44];(3)刺激过氧物酶体摘要受体-(PPAR)在肾小管细胞和相关基因转录46];和(iv)调节糖原合成在骨骼肌细胞(45]。
7所示。c -肽对转录因子的影响
鉴于许多细胞表型发生变化的结果的信号通过生物活性分子介导的基因和蛋白质表达改变,也就不足为奇了c -肽调节几个关键转录因子的活性。
扩展他们的观察c -肽激活MAPKs Kitamura等人描述分子的磷酸化和激活,ATF-1, ATF-2 LEII细胞(38]。事实上1 nM c -肽和佛波醇酯,积极控制,在这方面都是均等的。和ATF蛋白质分子结合的转录因子激活特定响应元素时,DNA的CRE,从而调节转录。凝胶迁移转变化验显示绑定的CRE在c -肽分子细胞治疗。在后者中,特定的基因受监管并不确定。然而使用神经母细胞瘤细胞,据报道,c -肽治疗增强表达和易位的核factor-κB (NF-κB)和Bcl的表达式2protein-an凋亡的重要中介效应由NF-κB [43]。控制NF-κB c -肽在瑞士3 t3也得到了证实。在这些细胞中,1 nM c -肽激活转录cyclooxygenase-2 (cox - 2)通过水涝NF-κB上游激活PKC的47]。细胞因子诱导基因,cox - 2是病原反应酶花生四烯酸转化的前列腺素,但其upregulation c -肽的潜在后果尚不清楚。
我们进行了详细的研究转录因子激活好近端小管细胞(46,48),比较c -肽胰岛素和关注PPAR的影响和NF-κB。核激素受体家族的一员,PPAR目前的目标是下蛋白质的耐受性thiazolidinediones用作治疗2型糖尿病的治疗药物49]。PPAR的表达也可能是由胰岛素(50]。使用一个过氧物酶体扩散国的瞬时转染响应元件(PPRE)荧光素酶记者构造,我们表明,胰岛素和c -肽transactivated通过PPAR PPRE(46]。c -肽(EC504海里)比胰岛素(EC更有效5010 nM)在这方面,但是这两个特工诱发PPAR的磷酸化通过激活PI-3-kinase类似。PPAR的结果之一c -肽和胰岛素增强转录激活的被PPAR调节基因,CD36 [46]。很明显,因此,胰岛素和c -肽之间存在一定程度的重叠信号与代理的影响是直接通过对PPAR PI-3-kinase。然而,只有c -肽的影响被PTX衰减,因此c -肽必须通过受体信号系统从根本上不同于胰岛素。这些数据表明一个重要的小说机制c -肽和胰岛素可能交互调节glycaemia和PPAR调控基因的表达,比如那些参与代谢控制和炎症。
下一步是建立原理证明,c -肽的能力作为保护剂在糖尿病肾病。为此,我们研究了c -肽是否能够抵消负面影响沉淀的政府TNF -好近端小管细胞(48]。肿瘤坏死因子-公认为是一个主要玩家在糖尿病肾病的发展和可能导致肾小管细胞凋亡和管状萎缩明显观察到糖尿病肾病(51- - - - - -55]。肿瘤坏死因子-是一种多效性的肽细胞因子,能够引起广泛的细胞反应,包括分化、增殖,炎症,通过互动和细胞死亡有两个肿瘤坏死因子受体家族的成员,TNF-R1和TNF-R254]。主要是由单核细胞/巨噬细胞,但也由T淋巴细胞和肾小球系膜细胞(55,56),肿瘤坏死因子-绑定TNF-R1可能同时触发凋亡通路的招聘死亡效应适配器分子随后激活半胱天冬酶级联,涉及肿瘤坏死因子和凋亡通路的通路receptor-associated factor2 (TRAF2)和核factor-κB (NF-κB)。集成这些事件决定了最终的细胞反应TNF -刺激。特别是NF-κB刺激转录调节细胞凋亡蛋白酶级联的凋亡因素,因此NF-κB活动作为检查点细胞生存的决定或apoptose针对给定的刺激。
当应用到好的细胞,肿瘤坏死因子-显著降低生存能力和诱导细胞凋亡48]。这是完全由预处理预防胰岛素和c -肽。同时,胰岛素和c -肽活性NF-κB根据荧光素酶记者分析。NF-κB激活胰岛素演示了一个典型的s形剂量反应,应用100海里的浓度最大。另一方面,c -肽NF-κB刺激表现出完全不同的钟形曲线,最大5 nM应用浓度。在先前的研究中,PTX阻塞只有c -肽的效果。但是在这些研究中,G的存在我有关GPCR了使用一个额外的技术,c -肽而不是胰岛素刺激三磷酸鸟苷S绑定到G我在好的细胞膜。在这工作,防止TNF - c -肽的能力全身的细胞凋亡似乎是由于其诱导表达的能力,通过NF-κB激活,生存的基因如TRAF2 [48]。
该研究提供了证据的c -肽的调节能力有益基因的表达在面对病理生理刺激与糖尿病肾病的发展和病理相关。再次,c -肽似乎通过G我,尽管c -肽与胰岛素分享一些信号属性显然拥有自己独特的信号功能。
8。c -肽是一个模仿胰岛素吗?
毫无疑问,一些组件的c -肽胰岛素信号通路与共享。例如,激活MAPKs之后下游事件描述和PI-3-kinase insulin-insulin受体相互作用[57]。在缺乏充分描述c -肽受体,并考虑到c -肽表现出一些胰岛素样等操作增加肌肉葡萄糖运输(58,59),格伦伯格等人怀疑c -肽的激活信号可能只是解释胰岛素受体信号系统。他们发现16种成肌细胞中c -肽(0.3 - 3海里)激活胰岛素受体酪氨酸激酶,酪氨酸的磷酸化胰岛素受体底物(IRS-1)、MAPK, PI-3-kinase, p90核糖体S6激酶(p90RSK)和糖原合成酶激酶3 (GSK3)和糖原的合成45]。Submaximal胰岛素和c -肽的浓度是添加剂的效果,而最大浓度。c -肽刺激糖原合成被PTX不废除,虽然早期信号通路中的具体步骤并不以这种方式测试(45]。这些发现与那些鉴于等人的发现没有证据表明人类骨骼肌(c -肽胰岛素受体激活的59]。然而他们的结果让格伦伯格等人推测,在其他的可能性,c -肽本身可能激活胰岛素受体(45]。
然而有一些证据在此。最引人注目的是多个作者描述的特定PTX c -肽影响的敏感性,以及最近的观察c -肽引起三磷酸鸟苷S绑定到G我,(48)观察兼容鸟嘌呤核苷酸交换发生在GPCR的结扎后的蛋白。此外,胰岛素的剂量反应曲线通常为c -肽s形而常常是钟形在更高浓度的减少活动。至少在体外c -肽似乎比胰岛素在摩尔的基础上更有效。典型的c -肽浓度midhigh点信号的影响是显而易见的,最大的1 - 5纳米,之后下降。相反,胰岛素反应通常变得明显10 nM增加到100 - 1000 nM高原。最后,使用等离子体共振没有c -肽的相互作用与可溶性纯化胰岛素受体或胰岛素样生长因子受体是在最近的一项研究发现60]。
有证据表明,c -肽的平衡调节其独特的通过GPCR信号。肯定是有一些重叠的信号通路激活c -肽和胰岛素但这是一个生物系统中常用的观察。GPCR激活信号之间的串扰和受体酪氨酸激酶激活通路由transactivation发生。这个很好的描述信号系统之间的交流机制,使细胞整合多个信号来自它的环境。Transactivation后表皮生长因子受体的激动剂刺激G我或G问耦合GPCRs代表这个系统的范例,但是类似的事件已经被描述为血小板衍生生长因子受体,胰岛素样生长因子- 1受体,IRS-1。
9。摘要和结论
在过去的10年中,有考虑c -肽的革命。现在可以毫无疑问的c -肽真正产生不同的生物效应。这些影响被确凿的证据支撑的细胞信号事件(列于表1通过特定的GPCR),最有可能介导。c -肽的浓度需要引起信号与已知输出是完全相等的绑定为其假定的c -肽受体的亲和力。应该承认,然而,缺乏详细的识别/克隆受体仍然是一个弱点。尽管如此,这些信号影响的重要性不能被低估。通路刺激的基本细胞功能和表型,影响生命和死亡等基本过程。下一个挑战是确定的受体和c -肽接近临床领域,以测试它的潜在好处在改善糖尿病的灾难性的后果和并发症。