文摘
肾和肾小球肥大的关系反渗透法和蛋白尿在体外早期糖尿病的发展进行了探讨。控制糖尿病,phlorizin-treated控制,和糖尿病男性费舍尔老鼠。根皮甙(一个葡萄糖协同转运抑制剂)在剂量足以血糖正常化。菊粉间隙()和蛋白排泄率(每)测量。形态测量学、肾脏部分和高碘酸希夫染色。在一个星期,每增加2.8倍(糖尿病),增长了80%)。肾湿和干重增加了10% -12% (),肾小球簇面积增加了9.3% ()。根皮甙预防蛋白尿、反渗透法和肾脏肥大,但不是肾小球肥大。因此,反渗透法、蛋白尿和整个肾脏肥大与高血糖相关但不肾小球的增长。糖尿病肾小球肥大构成肾小球病变的进展的早期事件发生在缺乏系膜扩张和持续即使蛋白排泄和肾小球滤过率(GFR)的变化通过血糖控制是相反的。
1。介绍
肾病发生在大约35%的糖尿病和糖尿病肾病患者负责大部分肾透析和移植1]。肾反渗透法和肥大是糖尿病肾病的早期表现,许多研究致力于精心如果这些是主要贡献者明显的肾脏疾病的发展。
肾小球增长一直被视为最初在糖尿病肾事件,发现之前管式增长(2]。认为肾小球增长与相关的表面积的增加过滤中观察到糖尿病动物和病人(3,4)是肾反渗透法的主要决定因素(5]。
其他人建议相反,反渗透法是初始事件和被认为发生由于减少传入小动脉的语气在高血糖,可能由早期糖基化产品(6]。过滤然后过剩会导致肾小球高血压和肾小球肥大细胞反应过度拉伸(7,8),最终导致肾小球硬化(9]。
最近,它提出了整个肾脏增长之前(10),导致反渗透法(11,12),肾小球肥大的管状的重大贡献,而不是通过改变tubuloglomerular反馈反渗透法的发展。提出,在不受控制的糖尿病增加了管状葡萄糖重吸收(13),由于过滤葡萄糖负荷的增加和增加SGLT1, SGLT2和GLUT2转运蛋白在近端小管细胞(14]。远端减少交付将导致增加肾小球滤过率(GFR)通过tubuloglomerular反馈(TGF) [12,15]。
尽管肾(肾小球和肾小管)增长和反渗透法可能对公开的糖尿病肾病的发展作出了重大贡献9),这些早期肾糖尿病事件之间的相互关系尚不清楚。因此,本研究的目的是鉴别肾小球和肾形态变化的重要性超过滤的发展在早期的实验性糖尿病蛋白尿,并研究屏蔽管的影响葡萄糖重吸收肾小球和肾肥厚性增长和反渗透法和蛋白尿。
2。材料和方法
2.1。动物
男性费舍尔老鼠(8周)被放置在一个房间里8:00-20:00光,20:00-8:00黑暗周期,保持在°C和%的湿度。的老鼠有免费水和标准的鼠粮(英国801151年,特殊饮食服务)。所有的动物都是依照照顾指导实验室动物保健和使用的和本研究中使用的所有实验协议是在科威特大学研究管理委员会批准。四组被使用:控制老鼠(C),糖尿病大鼠(D),糖尿病大鼠治疗根皮甙(DPLZ)和控制(非糖尿病患者)大鼠治疗根皮甙(CPLZ)。这组添加到研究任何直接肾根皮甙的影响。
2.2。诱导的糖尿病
糖尿病是由腹腔内(i.p)注入55毫克/公斤链脲霉素(STZ, s - 0130,σ,美国),溶解在50 mM trisodium-citrate缓冲区,pH = 4.5。控制有柠檬酸缓冲(车辆)。注射STZ后,动物被置于代谢笼和发展糖尿病确诊16小时后如果明显糖尿和多尿症发达。
2.3。根皮甙治疗
糖尿病(DPLZ)和控制老鼠(CPLZ)处理根皮甙(美国σp - 3449)开始16小时后STZ或柠檬酸缓冲知识产权注入。根皮甙在室温下溶解在丙二醇(1 2-propanediol 82282、丙烯酰胺、瑞士)。第一天的老鼠400毫克/公斤根皮甙南卡罗来纳州。分成剂量200毫克/公斤早上8点和下午8点。第二天剂量提高到400毫克/公斤每天两次和治疗持续了6天16]。
每天两次测量血糖水平在治疗组样本的尾巴,使用一个(GLUCOTREND 2、罗氏、德国)。Nonfasting测量血糖水平在所有的群体在牺牲之前,治疗后7天。
2.4。蛋白排泄率
尿蛋白浓度测定使用修改后的酚试剂法测定(17]。从尿蛋白排泄率(每)计算蛋白质浓度(毫克/毫升),和尿流率(ml / 24小时)。收集尿液样本超过二十四小时从老鼠置于代谢笼。
肾小管性蛋白尿评估,打赌的尿排泄微球蛋白进行了测试。的浓度选择微球蛋白来测大鼠尿液的赌注微球蛋白宠物装备(0052 K, DAKO、丹麦)。吸光度的变化在340 nm(日立911型,勃林格曼海姆,德国)打赌的浓度成正比微球蛋白在已知浓度的标准。尿排泄的赌注微球蛋白计算从尿浓度和尿流率。
2.5。肾血流动力学
肾小球滤过率估计通过测量肾等离子体间隙的菊粉()。每个大鼠体重和麻醉Inactin (Thiobutabarbital钠t - 133,σ,英国)的剂量100毫克/公斤IP。左股动脉是乳胶连续监测动脉血压的压力传感器。收集血液样本的动脉导管。气管造口术进行,以确保适当的通风。股静脉是乳胶和注入无菌林格氏溶液(5.61毫米154毫米氯化钠,氯化钾,2.16毫米CaC,5.95毫米NaHC,5.55毫米葡萄糖)开始0.06毫升/分钟的速度使用注射泵(英国哈佛仪器有限公司)。膀胱是空心不锈钢套管收集尿液。套管是连接到一个适当大小的挠性管收集尿液。尿流率的估计,尿管小心地删除,清空在配衡的埃普多夫管和体重。
45 - 60 mininutes稳定的时期后,注入含菊粉(σ从菊苣根,我——2255年,美国就开始了。灌注的解决方案包含36毫克/毫升的林格氏菊粉,并注入0.06毫升/分钟的速度。启动是静脉注射剂量160毫克/公斤。30分钟后平衡期,三个或四个定时收集尿液样本(15 - 20分钟)。在每个尿液收集期间的中点,动脉血液样本300l在干heparinzed收集管,以及离心机在2000克10分钟。血浆和尿液样本存储在−70°菊粉浓度C为以后分析。
菊粉的浓度测定在尿液和血浆样本18降水与10%柠檬酸后)。间隙值表示每100克毫升/分钟的初始体重。
2.6。形态测量学
STZ或车辆治疗7天后,老鼠麻醉;右肾切除、重干,reweighed。左肾是perfusion-fixed neutral-phosphate缓冲福尔马林的10%。15分钟后灌注,左肾切除手术和3毫米厚横截面切割和放置在福尔马林。二十四小时后部分被嵌入在蜡,切成4微米的部分,安装在猿(3-aminopropyltriethoxysilane,σ- 3648)涂布幻灯片形态学研究。周期性acid-Schiff (PAS)染色用于测量总肾小球的簇和系膜基质区域(19]。的部分水分,然后放置在0.5%高碘酸(5 - 10分钟)。幻灯片是洗,先后脱水在70%,95%,100%乙醇和100%二甲苯,与盖片使用DPX保护,允许干燥过夜。总共15到20完全圆的肾小球显示的簇连接门选择随机从所有在每个动物肾皮质区。肾小球的形态测量学是中科院200细胞分析系统(Becton & Dickinson形象血细胞计数系统,美国)。肾小球簇总面积(GA,)计算后手动跟踪每个簇的轮廓。肾小球丛卷制造中心估计 在哪里是一个球体的形状系数和大小分布系数。
每个肾小球系膜基质区域簇使用阈值测量方法有选择地突出了簇内所有PAS-positive领域。
2.7。统计分析
所有结果都表示为±SEM和分析一维方差分析建立群体之间的差异。当F显著,两组间的比较进一步测试使用未配对的双尾学生t以及根据平等平等或不平等的方差方差检验。相关研究使用皮尔逊的测试。软件SPSS 11用于Windows。所有统计测试的P值小于0.05被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。血糖、主体和肾脏重量、尿流和蛋白排泄率Phlorizin-Treated和未经治疗的糖尿病大鼠
体外实验引起的糖尿病血糖浓度明显增加,尿流率、每体重明显下降(表1)。
七天的治疗和根皮甙降低糖尿病大鼠血糖水平正常(表值1(图)在60小时1);然而,仍有明显的利尿和体重下降(表1)。利尿和身体减肥phlorizin-treated控制老鼠(表中也被观察到1)。
一周的糖尿病导致小(10 - 12%),但明显()增加肾湿和干重表示为百分数的初始权重(表1)。根皮甙治疗预防轻度肾增长观察糖尿病大鼠。根皮甙没有影响肾湿或干肾脏重量控制老鼠。
3.2。肾小球形态和蛋白尿Phlorizin-Treated和未经治疗的糖尿病大鼠
在一周的糖尿病、肾小球毛细血管丛面积和体积增加了9.3%和14.6%,分别,没有显著改变PAS-positive系膜基质面积(表2,图2)。根皮甙治疗并没有阻止肾小球增长(图2、表2)也改变了系膜基质的区域。然而,根皮甙预防糖尿病蛋白尿/以来PLZ-treated糖尿病大鼠没有明显不同,在PLZ-treated控制。高1.7折/观察到PLZ-treated控制大鼠与未经处理的控制是一致的一个独立的根皮甙对肾的影响处理的蛋白质。
(一)
(b)
(c)
排泄的打赌微球蛋白测定评估管状蛋白质重吸收(20.]。没有赌注的痕迹在控制尿液微球蛋白,糖尿病大鼠。然而,有大量的选择微球蛋白phlorizin-treated控制和糖尿病大鼠的尿液。尿道分泌物的打赌微球蛋白是和毫克/ 24 h PLZ-treated控制和PLZ-treated糖尿病大鼠,分别为()。因此,虽然一周糖尿病并不改变肾的处理选择微球蛋白,根皮甙有肾小管重吸收的抑制作用微球蛋白在控制和糖尿病大鼠。
每增加3 - 4折早期糖尿病危害并没有发现与肾小球簇或系膜基质区域或卷,而是与(图3,,),这表明主要是相关的功能,而不是总形态肾小球的变化。
3.3。肾小球血流动力学改变Phlorizin-Treated和未经治疗的糖尿病大鼠
平均动脉血压组研究(表中是相似的2)。一周糖尿病老鼠有一个高出80% ()比vehicle-treated非糖尿病的时间控制(表2)。根皮甙治疗预防糖尿病危害增加。根皮甙没有显著控制大鼠血液动力学的影响。
总结了根皮甙对diabetic-induced变化的影响图4。这些结果表明,在糖尿病、根皮甙、近端小管的抑制剂sodium-glucose再吸收,防止肾小球反渗透法,蛋白尿和全肾(管)增长但不是肾小球簇增长。
4所示。讨论
一周后链脲霉素诱导糖尿病、肾肾小球肥大和反渗透法在费舍尔老鼠。肾脏肥大,虽然小,是重要的和独立的体重发生变化。反渗透法被显著增加明显类似于SD大鼠(早些时候报道21]。
一周的根皮甙治疗预防肾整个肾脏增长和反渗透法;然而,这并没有阻止肾小球簇增长。肾小球持续增长的根皮甙治疗可能是相关的高血糖持续至少60小时后请和STZ治疗。高血糖引起的释放生长因子VEGF等(22,23),TGF -β(24),血管紧张素ⅱ(25)居民肾小球细胞和巨噬细胞浸润(26]早在一天后,入侵肾小球STZ治疗(26]。诱导后,肾小球增长持续即使血糖规范化,请至少三天,这表明肾小球增长可以独立存在的葡萄糖协同转运,高血糖。营养影响肾小球的根皮甙本身并没有被报道。足细胞(27)和肾小球系膜细胞(28说明]显示SGLT 1表达在这些细胞葡萄糖协同转运是活跃。阻止这个途径与根皮甙将减少葡萄糖入口(28),降低它们的大小(29日)而不是诱发他们的增长或扩散。
相比之下,增加糖尿病肾小管增长,体现在干态和湿肾重量(总30.),完全避免了根皮甙治疗。这表明在STZ糖尿病,肾小管细胞肥大取决于高血糖和相关的管状葡萄糖协同转运,迅速扭转正常化血糖浓度。因此,糖尿病患者肾小管和肾小球肥大显示不同的动态血糖正常化和可能涉及不同的发展途径。
在本研究发现糖尿病危害增加肾小球滤过率(GFR)独立于肾小球的增长,因为根皮甙治疗肾小球滤过率(GFR)没有升高,尽管肾小球持续增长。此外在糖尿病、肾小球滤过率(GFR)的增加80%时,肾小球簇的横截面积仅为14%。由于流量正比于横截面积的平方,肾小球滤过率(GFR)的增加可能是因为大多数的变化pre或postglomerular抗性而非肾小球横截面积。
类似的发现在这项研究中,根皮甙没有控制大鼠血液动力学的影响(31日]。控制老鼠,葡萄糖协同转运代表总数的5%运输的肾元(31日]。然而,在糖尿病大鼠近端端依赖葡萄糖重吸收增加(13,32)增加过滤葡萄糖负荷和葡萄糖转运蛋白的表达(过剩2)(14,32]。增强的近端钠重吸收减少远端交付导致preglomerular扩张和反渗透法tubuloglomerular反馈(TGF) [12]。急性注入根皮甙,剂量不正常血糖水平,显示降低肾小球滤过率(GFR) (13]。阻止diabetes-enhanced钠葡萄糖协同转运GLUT2的请减少表达式(33),大大降低近端钠的重吸收,增加其远端交付,导致肾小球滤过率(GFR)的标准化,可能通过逆转TGF [12]。根皮甙预防反渗透法的影响在当前的研究中(早些时候报告类似13),但请更高剂量导致normoglycemia发生和正常过滤葡萄糖负荷在60小时的请治疗。因此,在我们的实验中,可以直接根皮甙对肾小球滤过率(GFR)的影响,由于抑制肾小管重吸收的葡萄糖和间接,通过规范化的血糖水平和过程,如增强的近端sodium-glucose协同转运依赖于高血糖。预防反渗透法与低或高剂量的请表明激活TGF是主要的机制在糖尿病和高血糖增加肾小球滤过率(GFR)其他影响肾血管对早期糖尿病反渗透法几乎没有影响。
减少,请不能占的效果请在细胞外液量(ECFV)。Phlorizin-treated糖尿病老鼠24小时尿流率和利尿剂林格氏反应注入类似于糖尿病老鼠表示两组类似的水合状态。因此,请对这些动物的ECFV没有显著的影响。根皮甙治疗减少体重DPLZ和CPLZ老鼠,但减少了只有在DPLZ动物。因此,体重的变化与请治疗没有直接影响。
反渗透法是与轻度蛋白尿在这个模型中早期的糖尿病。然而,由于相关性并不一定表示因果关系,当前数据不允许我们定义糖尿病是否会导致轻度蛋白尿只有通过反渗透法或者额外的效果。早期糖尿病蛋白尿完全阻止了一周根皮甙治疗表明,以及反渗透法,是由于过程依赖于高血糖和独立于肾小球簇增长并没有逆转时血糖和根皮甙治疗规范化。没有排泄的赌注微球蛋白,管状蛋白质运输的一个标志20.),观察糖尿病大鼠表明没有早期糖尿病对管状蛋白质重吸收的影响。
在这项研究中我们观察到持续肾小球肥大没有蛋白尿,反渗透法、或整个肾脏增长当血糖控制。我们推测,持久的肾小球增长可能是某种前兆的肾小球硬化和肾机能不全(低平没有发生蛋白尿或肾脏肥大的大约20%的糖尿病肾病患者(34- - - - - -36]。
5。结论
这项研究表明,在糖尿病早期肾小管和肾小球肥大,轻度蛋白尿和反渗透法发生在费舍尔的老鼠。观察到的数据表明,肾脏功能变化在糖尿病早期(反渗透法和蛋白尿)不能占观察肾小球肥大,肾小球增长相比,很容易逆转phlorizin-induced血糖正常化。肾小球肥大是一种STZ-diabetes-induced肾小球病理发展的早期事件,发生在缺乏系膜基质的扩张和持续在短期血糖正常化。早期肾脏功能和一些结构性的减轻和根皮甙(小管肥大)变化在糖尿病,与视网膜(29日),支持其在降低糖尿病微血管疾病潜在的治疗作用。还需要进一步的研究来调查如果diabetes-induced肾小球肥大导致肾小球硬化症以及如何预防或逆转。
确认
作者承认研究核心设施通用01/01医学院,科威特大学图像分析仪的使用。财政支持的大学研究生院、科威特大学。