文摘
隔离主要从其他细胞在胰腺胰岛β细胞胰岛的许多领域研究的重要性。然而,到目前为止,没有令人满意的方法已经被开发出来,它获得了大量可行的β细胞,没有相当大的α细胞污染。在这项研究中,我们研究了鼠β细胞是否可以隔绝nonbeta内分泌细胞通过操纵黄素腺嘌呤二核苷酸(时尚)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAD (P) H)自体荧光。β细胞从分散孤立的小岛通过流式细胞术,根据他们的高流行和NAD (P) H荧光。改善β细胞产量和纯度,细胞时尚和NAD (P) H内容被预培养改变培养基含有不同数量的葡萄糖和氨基酸。操纵细胞时尚和NAD (P) H荧光改善β细胞产量和纯度后排序。这种方法也是一种快速和可靠的方法来测量β细胞功能的可行性。可能的应用程序移植前评估β细胞的生存能力。
1。介绍
主要研究胰岛的β细胞需要在几乎所有领域的研究。不幸的是,它已经远离容易获得高数量的纯和可行的细胞。先前发表的方法净化内分泌胰岛β细胞与其他细胞基于沉降速度(1),标签的β细胞表面抗原(2),或β细胞的内源性荧光(汽车)(3- - - - - -6]。大多数这些方法适用性有限,因为它们是相关的收益率较低的细胞,细胞功能或永久恶化造成的细胞膜的强制性标签。
技术,我们觉得可能会发展成为一个有效的β细胞纯化方法,高收益,没有功能的严重恶化,β细胞的分类是基于他们的自体荧光。β细胞自体荧光显示高于其他胰岛细胞。这种自发荧光细胞含量高造成的黄素腺嘌呤二核苷酸(时尚)7- - - - - -9),一个电子受体代谢氧化磷酸化。隔离的原理适用性的β细胞自体荧光显示了因et al。4)和Van de温克尔et al。10),但导致了大量的α细胞做准备。
在这项研究中,我们调查了β细胞是否可以提高产量和纯度通过操纵胰岛细胞的新陈代谢和时尚自体荧光。此外,我们调查是否选择基于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸()(NAD (P) H)荧光是宝贵的二次分离参数。我们表明,预培养的胰岛细胞培养基含有大量的葡萄糖和氨基酸评分改变细胞自体荧光,隔离后胰腺β-细胞纯度和产量。
2。材料和方法
2.1。实验动物
刘易斯无菌近亲交配的雄性大鼠体重300 - 320克作为胰岛捐助者。所有实验动物都从哈伦(霍斯特,荷兰)。动物喂养标准的鼠粮和酸化水随意。动物实验都收到批准后执行机构格罗宁根大学动物保健委员会和所有的动物收到人类保健按照荷兰法律实验动物保健。
2.2。胰岛细胞的制备
大鼠胰岛分离(如前所述)(11]。胰岛隔离了克雷布斯铃声玫瑰(KRH)缓冲25更易与L玫瑰含有10% (wt /卷)。牛血清白蛋白(BSA)。胰腺导管扩张后KRH 10% BSA, 1毫米的器官被切成碎片2。接下来,组织碎片受到3连续洗涤步骤KRH 10% BSA移除蛋白酶可能泄露的外分泌胰腺的一部分。随后,切碎的胰腺被带进一个25毫升锥形烧瓶和孵化37°C 1.0毫克/毫升KRH 10% BSA的胶原酶。组织的总量和缓冲区总是13毫升。10分钟后,组织碎片被放置在一个50毫升管30毫升KRH 10% BSA在4°c .消化组织洗和沉淀2次删除exocrine-derived蛋白酶和胶原酶。接下来,组织碎片被放置在一个25毫升锥形烧瓶和孵化37°C 0.7毫克/毫升的胶原酶KRH 10% BSA的总量13毫升。8分钟后,组织碎片被放置在一个50毫升管30毫升KRH 10% BSA在4°c .最后,消化获准泥沙,洗两次RPMI 1640含有1% (wt /卷)。BSA。小岛被离心外分泌组织分开在不连续梯度(右旋糖酐12),通过人工挑选进一步纯化。纯化胰岛被洗RPMI 1640 (Gibco)含1% BSA至少8次,培养在CMRL与1375毫米(Gibco)补充葡萄糖,青霉素,链霉素,10%胎牛血清(FCS)(美国加州Gibco) 37°C, 5% C。
第二天早上,小岛被收集和清洗在磷酸盐两次被分散成单个细胞机械震动37°C 3分钟在0.05%胰蛋白酶,0.5毫米EDTA(美国加州Gibco)。酶促反应是通过添加KRH 10% BSA停止。细胞被洗了,剩余的细胞团被过滤删除细胞混合在一个35米孔隙大小过滤(BD猎鹰)。
平均每胰腺550小岛,和1500年到2000年每胰岛细胞。排除trypane蓝色阳性细胞表明,95%以上的细胞后可行的程序。
2.3。胰岛细胞孵化
在第一个实验中,分散的胰岛细胞在标准中孵化,也就是说,RPMI 1640(美国加州Gibco)含1% BSA在37一小时°C在β细胞排序。随后,在第二个实验中,研究不同浓度的葡萄糖和氨基酸的影响在β细胞纯度,分散的小岛是孵化后媒体包含不同葡萄糖和氨基酸浓度(见表1(一)和1 (b)MEM(美国加州Gibco), RPMI 1640(美国加州Gibco) CMRL(美国加州Gibco),或DMEM-F12(美国加州Gibco)补充1% BSA在37一小时°前C细胞排序。在第三个实验中,我们评估的影响葡萄糖和氨基酸在单独胰腺β-细胞纯度;因此,分散的小岛被孵化unsupplemented MEM培养基(5.5更易与L d -葡萄糖和氨基酸553 mg / L),或MEM培养基补充10,15或20更易与L d -葡萄糖(pH值7.4),或1000,1500,或2000 mg / L氨基酸(pH值7,4)一小时37°流式细胞术之前C。
在所有的实验中,20分钟之前分析2g / mL propidium碘(PI)(美国密苏里州Sigma-Aldrich)添加到细胞混合物排除凋亡细胞。
2.4。流式细胞术和细胞排序
在实验1和2,高和低荧光在荧光激活细胞分类MoFlo高速细胞分选仪(Dakocytomation BV、Heverlee、比利时)。在实验3中,流仪分析了光敏电阻II系统(美国加州BD生物科学)。在所有的实验中,侧面散射光收集在一个角的90°,信号的线性放大。远期和侧散射模式的细胞进行分析的波长488 nm。黄素腺嘌呤二核苷酸(时尚)的内容分析了细胞的激发波长488 nm,收集在525海里。分析了PI染色的激发波长488 nm,收集在675海里。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)(NAD (P) H)内容分析的激发波长350 nm (UV)使用氩激光器,并收集了在450海里。波长488纳米的激光操作在80 mW和氩激光器25 mW。流量是通常每秒几百个细胞。
流式细胞术结果分析活细胞使用Winlist 5.0上使用标准化的控制软件(软件真实的房子,Topsham,我,美国)。门后的细胞,散点图,这个门是复制到第二个情节中我们选择了活细胞(即。propidium碘-细胞)和盖茨都复制到一个直方图显示时尚荧光(见图1(一))。分析单个细胞的流式细胞术的激发波长488 nm导致了两种截然不同的autofluorescent细胞群。第一个细胞群显示低自发荧光(荧光强度单位(事业单位))。第二个细胞群显示高自体荧光(事业单位)(见图1(一))。在实验3中,我们测量的平均荧光强度高、低荧光细胞和评估荧光强度(即的增加或减少。,褶皱变化)引起的葡萄糖或氨基酸与unsupplemented媒介。
(一)
(b)
2.5。疣状
高和低荧光孤立的细胞玻片上分数被发现。每张幻灯片,50 000个细胞被发现,使用cytospin离心机。细胞被旋转在500 rpm在室温下5分钟。点干,这些细胞被固定在Bouin固定剂在室温下3分钟紧随其后的疣状后胰腺激素或激素的结合:胰岛素,胰高血糖素,somatostatin-pancreatic多肽(PP /生长激素抑制素)。
短暂、幻灯片染色对PP /生长激素抑制素被封锁在甲醇为内源性过氧化物酶20分钟含有0.9% (vol. /卷)。。幻灯片是清洗和孵化与主抗体(多克隆兔antirat PP (Abcam Inc .)质量,美国)1:6,和单克隆兔子antirat生长激素抑制素(美国密苏里州Sigma-Aldrich) 1:800)在室温下1小时。在磷酸缓冲盐水洗涤后,二级(山羊antirabbit免疫球蛋白辣根过氧化物酶(合)共轭(Dako、斯特鲁普、丹麦)(1:50)的1%山羊血清)和三级抗体(兔抗体免疫球蛋白结合,合(Dako、斯特鲁普、丹麦)(1:50)在1%的兔血清)在室温下孵化了30分钟。antibody-PP /生长激素抑制素的存在交互可视化一个酶促反应后使用3-amino-9-ethyl-carbazole (Sigma-Aldrich,密苏里州,美国)。细胞核是用苏木精染色1到3分钟。幻灯片是嵌入在凯撒的甘油明胶(默克公司& Co .公司,新泽西,美国)。随机,至少500个细胞每点光学显微镜下进行了分析。
幻灯片染色与主孵化了胰岛素和胰高血糖素抗体(单克隆鼠标anti-rat胰岛素(搞笑)(美国密苏里州Sigma-Aldrich) 1:750;或单克隆鼠标anti-rat胰高糖素(搞笑)(美国密苏里州Sigma-Aldrich)在室温下1:20 00 1小时。洗后,二级抗体(山羊anti-mouse搞笑FITC共轭(Dako、斯特鲁普、丹麦)(1:50)的1%山羊血清)孵化在黑暗中在室温下30分钟。细胞核染色使用5g / mL DAPI(美国新泽西州罗氏Inc .)在黑暗中在室温下20分钟。斑点嵌入cytifluor(琼脂科学,英国埃塞克斯)。胰岛素和胰高血糖素的存在染色分析使用徕卡DMRXA荧光显微镜,徕卡Qwin Pro软件。随机,至少500个细胞每点进行了分析。
2.6。统计数据
结果显示为平均值±标准平均误差(SEM)至少4的实验。的Mann-Whitney测试是用来确定统计上显著的差异。值<。05年被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。实验1:胰岛细胞荧光模式在标准培养基培养(RPMI 1640)
分离大鼠胰岛分散成单个细胞悬液,酶消化和RPMI 1640年孵化。平均,我们获得1872±507可行的细胞占总细胞数的(> 95%)/胰岛(见表2)。分析单个细胞的流式细胞术的激发波长488 nm (4,10)导致了两种截然不同的autofluorescent细胞群。第一个细胞群显示低自发荧光(荧光强度单位(事业单位)),组成占总数的%可行的内分泌细胞群。第二个细胞群显示高自体荧光(事业单位),由占总数的%可行的内分泌细胞群(见图1(一))。
为了调查这两个不同的细胞群的表型,高、低荧光细胞数量排序之后,免疫组织化学。低荧光内分泌细胞群组成%积极胰岛素β细胞(见图1 (b)),α%胰高糖素阳性细胞(见图1 (b))。高autofluorescent细胞群被证明是主要β细胞(%)(见图1 (b)),但也包含很大一部分α细胞(%)(见图1 (b))。
这些结果表明,β细胞排序基于细胞自体荧光是可能的;然而,纯度需要改善。
3.2。实验2:预培养不同的媒体对β细胞纯度的影响
如前一节所示,绝大多数β细胞被发现在高autofluorescent内分泌细胞群。然而,这种人口含有相当数量的glucagon-positiveα细胞(%)。我们质疑我们是否能改变高荧光的荧光模式β细胞数量和低荧光nonbeta-cell人口通过改变代谢内分泌细胞的状态。
细胞代谢状态是由短期改变在第二个实验中孵化在其他培养基,含有不同数量的葡萄糖和氨基酸。葡萄糖和氨基酸都是著名的代谢活动刺激,因此合适的候选人来改变细胞黄素腺嘌呤二核苷酸(时尚)内容和自体荧光。为此,内分泌单一细胞孵化RPMI 1640年,MEM、DMEM-F12, CMRL介质1小时前细胞排序。表1显示应用培养基的成分。预培养的内分泌单个细胞培养基含有不同数量的葡萄糖和氨基酸对时尚有着相当大的影响荧光的高、低autofluorescent细胞群(见图2(一个))。当孵化RPMI 1640,两个部分重叠的荧光观察细胞群。预培养的细胞在DMEM-F12或CMRL介质导致更多的分散荧光模式低荧光的细胞群和减少差异荧光强度之间的高荧光β细胞和低荧光nonbeta-cell人口(见图2(一个))。尽管改变荧光模式,高时尚荧光细胞的分类仍然导致了相当大的α细胞污染。分散的小岛在CMRL孵化时,α细胞污染与预孵化RPMI 1640没有明显不同。细胞DMEM-F12中孵化时,α细胞污染减少%,相比显著降低预培养的RPMI 1640 (Mann-Whitney测试(见图)2 (b))。然而,预培养的内分泌单个细胞在MEM培养基,含有葡萄糖只有5.5毫米和553 mg / L氨基酸,显示两个非常不同的荧光细胞数量增加2之间的荧光强度差异数量而RPMI 1640预孵化(见图2(一个))。此外,排序的高荧光胰腺β-细胞分数导致% nonbeta-cell污染(见图2 (b),2 (c),2 (d)),显著低于nonbeta-cell污染观察当内分泌细胞preincubated RPMI 1640 (Mann-Whitney测试),以及DMEM-F12 (,Mann-Whitney测试(见图)2 (b))。胰岛素阳性细胞比例高时尚荧光细胞分数稍微增加孵化时DMEM-F12或者MEM培养基,但这增加并不显著(见图2 (b))。分析存在的PP /生长抑素阳性细胞在高、低荧光细胞分数在MEM培养基和随后的预培养后排序显示这些细胞的存在低流行荧光细胞分数,但不是高荧光胰腺β-细胞分数(见图2 (d))。
这些数据表明,预培养内分泌单个细胞的培养基组成的高或低浓度的氨基酸或葡萄糖改变细胞时尚荧光。这个改变时尚新陈代谢可以应用于流式细胞术增加β细胞纯度。
葡萄糖水平和氨基酸似乎影响β和nonbeta-cell自体荧光。预培养单细胞内分泌细胞在MEM培养基,含有低浓度的氨基酸和葡萄糖,导致β细胞纯度高相比,预培养标准RPMI 1640。然而,预培养在MEM仍然结果在一个孤立的βα细胞污染的分数。
3.3。实验3:葡萄糖和氨基酸对β细胞自体荧光的影响
3.3.1。葡萄糖和氨基酸对时尚荧光的影响
正如在前一节中所讨论的,预培养MEM培养基导致内分泌细胞的β细胞的人口相对纯度高。然而,人口仍然含有3.18%α细胞污染。
葡萄糖和氨基酸不同媒体的不同,众所周知,和前面所示的实验中,这两个组件影响代谢状态,因此内分泌细胞的时尚内容。β细胞纯度和产量可能会进一步优化的预培养MEM培养基补充葡萄糖和氨基酸。分散的小岛被孵化unsupplemented MEM培养基或MEM培养基补充葡萄糖的浓度为10,15日和20毫米,或氨基酸浓度为1000,1500,或2000 mg / L。
孵化的分散与越来越多的葡萄糖显示胰岛β细胞数量的增加时尚荧光(高时尚荧光细胞群),这是在20毫米葡萄糖显著增加(时尚荧光折叠的感应时候unsupplemented MEM培养基相比,,Mann-Whitney测试(见图)3(一个))。的时尚荧光nonbeta-cell人口没有明显影响孵化与葡萄糖浓度增加(见图3(一个))。孵化的单一细胞内分泌细胞越来越多的氨基酸显示增加时尚荧光在胰腺β-细胞和nonbeta-cell人口,只有增加β细胞荧光的人口统计学意义(1500 mg / L:时尚荧光折叠的感应时候unsupplemented MEM培养基相比,,Mann-Whitney测试(见图)3 (b))。
(一)
(b)
3.3.2。葡萄糖和氨基酸对NADPH荧光的影响
除了测量时尚荧光,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸()(NAD (P) H)荧光也评估作为第二个参数通过流式细胞仪测量胰腺β-细胞的新陈代谢。测量在350 nm代表两种细胞自体荧光NADH和NADPH内容。
流仪分析内分泌单个细胞混合培养unsupplemented MEM培养基中显示单个NAD (P) H荧光人口350海里兴奋时(见图4(一))。当孵化与越来越多的MEM氨基酸,出现了更多的荧光的细胞群作为一个小肩膀(结果未显示),而在MEM孵化后包含越来越多的葡萄糖高荧光峰值出现(见图4 (b))。因此,葡萄糖和氨基酸似乎影响NAD (P) H荧光。
(一)
(b)
3.3.3。NADPH荧光的作用在增加β细胞的纯度人口使用流行的荧光
因为葡萄糖和氨基酸似乎影响NAD (P) H荧光,下一步是分析是否可以使用NAD (P) H荧光一起时尚荧光为了得到一个更加纯化β细胞数量比只使用流行的荧光。图5(一个)表明如果unsupplemented MEM培养基中细胞孵化,时尚的点阴谋荧光和NAD (P) H荧光显示三个群体:细胞低时尚和低NAD (P) H荧光细胞高时尚荧光和低NAD (P) H荧光,和一个小的细胞高时尚和NAD (P) H荧光。当分散的小岛被孵化与葡萄糖MEM补充20更易/ L d -葡萄糖,细胞数量不同(见图5 (b)):细胞的人口高时尚、高NAD (P) H变得更大。因为在我们的第一个实验表明细胞高时尚荧光细胞β细胞和细胞与低流行荧光细胞nonbeta-cells,这可能表明,与葡萄糖刺激后,β细胞(细胞高时尚荧光)也成为高NAD (P) H荧光。
(一)
(b)
在图6葡萄糖和氨基酸的影响在NAD (P) Hβ和nonbeta细胞的荧光进行了分析。根据实验结果1,β细胞被定义为高流行的荧光,而nonbeta细胞被定义为低流行的荧光。NAD (P) H荧光分析的水平这两个细胞群在分散的小岛表明孵化中包含越来越多的葡萄糖增加了NAD (P) H荧光的高流行荧光β细胞数量(,,成倍增加与unsupplemented介质分别为10、15和20更易与L d -葡萄糖,,Mann-Whitney测试中,见图6(一)),而低流行荧光nonbeta-cell人口没有影响(见图6(一))。
(一)
(b)
(c)
(d)
孵化的分散小岛与越来越多的MEM补充氨基酸显示轻微增加NAD (P) H荧光的高流行荧光β细胞人口(1500 mg / L:,,Mann-Whitney测试(见图)6 (b))。低流行荧光nonbeta-cell人口显示减少NAD (P) H荧光,以应对越来越多的氨基酸(见图6 (b))。这种减少是重要的氨基酸浓度2000 mg / L (,,Mann-Whitney测试)。
接下来,NAD (P) H的百分比高荧光细胞在胰腺β-细胞(高时尚荧光)人口测量(见图6 (c),6 (d))。这些数据显示,大约%的β细胞低NAD (P) H荧光细胞,而%的β细胞是高NAD (P) H荧光在细胞被孵化unsupplemented MEM培养基。当细胞被孵化与MEM增加葡萄糖浓度(见图6 (c)),高的百分比NAD (P) H荧光细胞内β细胞数量增加,而低荧光NAD (P) H细胞内β细胞数量减少(见图6 (c))。补充20毫米葡萄糖时,低的百分比NAD (P) H荧光β细胞减少% (,Mann-Whitney测试),而高的百分比NAD (P) H荧光β细胞增加% (,Mann-Whitney测试)。与越来越多的氨基酸,孵化后的百分比高NAD (P) H荧光细胞的β细胞人口持平(见图6 (d))。
总之,实验3的结果表明,葡萄糖增加β细胞时尚荧光和β细胞NAD (P) H荧光。这导致增加的百分比高度NAD (P) H荧光细胞内β细胞数量与提高孵化后葡萄糖浓度。Nonbeta-cell时尚荧光仅略有增加与葡萄糖浓度增加,孵化项目后在NAD (P) H nonbeta细胞的荧光是影响葡萄糖。
氨基酸略有影响β细胞时尚和NAD (P) H荧光,但比例高/低NAD (P) H荧光细胞内β细胞数量保持不变。Nonbeta细胞对孵化项目增加氨基酸浓度增加时尚荧光和减少NAD (P) H荧光。
4所示。讨论
在这项研究中,我们表明,β细胞和nonbeta-cell黄素腺嘌呤二核苷酸(时尚)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸()(NAD (P) H)荧光可以被分散的预培养胰岛细胞培养基中含有大量的葡萄糖和氨基酸评分。排序胰腺β-细胞的纯度和产量分数被孵化的胰岛分散优化培养基含有葡萄糖的5.5毫米和553 mg / L氨基酸。在这种情况下,胰腺β-细胞的荧光模式和nonbeta-cell分数显示最小重叠,导致一个高度纯β细胞分数后排序。β细胞时尚和NAD (P) H荧光可以显著提高孵化分散小岛与20毫米葡萄糖培养基补充。Nonbeta-cell时尚和NAD (P) H荧光不受这些条件的影响。排序的β细胞基于时尚和NAD (P) H荧光,在与葡萄糖培养基补充预培养后,可以提供一种方法来隔离一个纯从大鼠胰岛β细胞分数。
隔离方法在这项研究清楚地显示了改善β细胞隔离过程描述因et al。4]和Pipeleers Pipeleers-Marichal [1]。只有时尚荧光排序应用时,我们可以产生β细胞分数不超过约3%α细胞污染5倍低于16%污染用描述的方法因et al。4]和Pipeleers Pipeleers-Marichal [1]。纯洁度可能带来100%额外选择申请NADP (H)荧光
我们的研究显示一个明确的影响葡萄糖的内容应用媒体时尚荧光和单独的β细胞的能力从nonbeta细胞流式细胞术。当β细胞培养的时尚荧光MEM包含5.5毫米相比MEM补充15或20毫米的葡萄糖(以同样的氨基酸浓度)(见图3),我们看到一个明确的不同时尚beta和nonbeta细胞的荧光。尽管扩展较轻,同样流行的荧光β氨基酸的影响,nonbeta细胞。然而,d -葡萄糖和氨基酸成分的培养基并不是唯一的因素影响细胞时尚荧光。这是显示在我们的第二个实验中,我们比较MEM培养基DMEM-F12(以同样的氨基酸浓度)和CMRL(以同样的葡萄糖浓度)(见图2)。在这个实验中,我们发现影响媒介的时尚荧光的细胞数量,但它从来没有达到强大的时尚β和nonbeta细胞的荧光观察补充MEM培养基。这些结果可以解释为文化传媒之间的氨基酸组成上的差异。不同浓度的氨基酸(见表1 (b))已知的刺激β细胞胰岛素分泌,要求氧化代谢,即丙氨酸、谷酰胺,精氨酸一起L-Leucine [13- - - - - -18),可以解释不同的时尚荧光相比补充MEM培养基。但是,作为单独的氨基酸浓度相对较低与早些时候描述刺激浓度相比,氨基酸可以在协同工作或DMEM-F12,和CMRL可能包含其他因素比葡萄糖和氨基酸在流行音乐会荧光和细胞的新陈代谢。
我们隔离β细胞的方法的基础上,时尚和NADPH代谢不仅适用技术净化β细胞也是一个快速和直接测量的β细胞功能的可行性。细胞自体荧光,以激发波长488 nm,依赖于细胞的时尚内容。从时尚潮流产生在ATP合成线粒体氧化磷酸化。自体荧光测量的激发波长350 nm代表细胞NADH和NADPH的内容。在ATP合成NADH是主要的电子受体。在活跃的新陈代谢,时尚和NAD (P) H荧光被认为是在氧化还原平衡意味着增加时尚荧光和减少NADH荧光代表增加细胞氧化磷酸化率(19,20.]。分析胰腺β-细胞分数显示没有响应的NAD (P) H荧光增加浓度的氨基酸,但在NAD (P) H显著增加荧光与分级孵化时大量的葡萄糖。这些结果表明,除了刺激ATP生产,从而减少时尚时尚和NADH,其他代谢途径是活跃导致增加细胞NAD (P) H内容和荧光。众所周知,β细胞使用替代代谢途径,如丙酮酸苹果酸(航天飞机21- - - - - -27),增加细胞NADPH除了生产ATP水平。这些途径被认为有助于胰岛素的合成和胞外分泌。当β细胞刺激与高浓度的葡萄糖、丙酮酸羧化酶活性被看好在丙酮酸脱氢酶,有利于NADPH合成和ATP生产。因此,测量β细胞时尚和NADPH d -葡萄糖反应具体可以应用的快速测量功能性胰腺β-细胞制备的可行性。
NAD (P) H荧光模式nonbeta-cell分数表明NAD (P) H和时尚水平可能不是完全在这些细胞的氧化还原平衡。它也可能代表nonbeta-cell分数与细胞的污染。nonbeta-cell分数的荧光染色法显示大约10%的胰岛素阳性细胞的存在。这些β细胞的存在可能影响时尚/ NAD (P) H的平衡向更多的β细胞像时尚/ NAD (P) H平衡。测量减少NAD (P) H水平在回应中氨基酸浓度增加时尚的增加荧光确诊nonbeta-cell分数,也就是说,时尚/ NAD (P) H平衡。内分泌细胞的培养越来越多的氨基酸和葡萄糖证实发现nonbeta-cell自体荧光减少MEM含有低浓度的基本成分。nonbeta细胞似乎更流行应对越来越多的氨基酸对葡萄糖的反应相比,与一个最佳1500 mg / L。与时尚荧光显示,1500 mg / L氨基酸的最佳NAD (P) H进一步降低孵化时2000 mg / L氨基酸。
描述技术也允许一个明确的标识和隔离β细胞有不同的代谢活动。范Schravendijk et al。28)已经表明,不同β细胞亚种群应对高或中间葡萄糖浓度,和这些细胞被称为“高”和“低”反应细胞,分别。与时尚的结合应用自体荧光和NAD (P) H荧光,我们展示了两个不同的β细胞数量。这两个单独的β细胞数量可能代表这些“低”回应β细胞和“高”反应细胞。
在本文所述的隔离方法优于早些时候描述胰腺β-细胞隔离方法。隔离的β细胞检测的基础上高β细胞时尚和NAD (P) H荧光单独的β细胞提供了一个工具以最小的干扰细胞生理学。我们表明,孤立的产量和纯度胰腺β-细胞分数可以优化的预培养胰岛分散在MEM培养基补充葡萄糖。这些预培养条件下,β细胞时尚和NAD (P) H荧光增加,而nonbeta-cell荧光几乎是相同的。
缩写| 来自: | 任意单位 |
| BSA: | 牛血清白蛋白 |
| CMRL: | 康诺特医学研究实验室中 |
| DMEM-F12: | 杜尔贝科鹰介质的修改 |
| 时尚: | 黄素腺嘌呤二核苷酸 |
| FCS: | 胎牛血清 |
| 事业单位: | 荧光强度的单位 |
| KRH: | Krebs-Ringer-HEPES |
| MEM: | 最小的重要媒介 |
| NAD (P) H: | 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸() |
| PI: | Propidium碘化 |
| 页: | 胰多肽 |
| 扫描电镜: | 平均数标准误差。 |
承认
这项研究是由荷兰糖尿病基金会赞助。