优化研究黄酮迪-C糖甙的提取Premna叶由深共晶溶剂

抽象

深共晶的溶剂（DESS）正在成为新的提取溶剂从天然植物生物活性化合物的提取。在这项工作中，一个总的氯乙烯13胆碱DESS的合成和评价了从五个生物活性黄酮二C糖苷的同时提取Premna叶Craib。DES-F，其组成为氯化胆碱和1,3-丙二醇，显示出对黄酮二C糖苷的最佳提取效率，超过了以往的工业溶剂（40％乙醇）的。随后，对于超声辅助提取（液固比，在所选择的DES水含量（％），和提取时间）提取参数的响应面法进行了优化。此外，提取后样品中的微观结构的改变使用扫描电子显微镜进行评价。此外，我们进一步验证黄酮二C糖苷的从DESS使用大孔树脂的回收和评价DESS作为溶剂的可重用性。结果表明，DES-F是为生物活性的黄酮二C糖苷的从提取的有效和可持续的溶剂Premna叶Craib。因此，这种新的策略可能代表了生物活性产物的提取一个可持续的方法，并可以使植物化学更具吸引力和环保。

1.介绍

Premna叶Craib又名壮药“张骨”，属于马鞭草科，主要分布于中国广西[1]。健骨注射液是一种中药，由中药的根和茎制成Premna叶Craib [2]。临床研究表明健骨注射液广泛用于治疗颈椎病、腰扭伤、骨关节炎[3-7]。建顾注射的主要成份据报道，在我们先前的研究黄酮二C糖苷异构体[8]。五种黄酮二- c -糖苷同源物的结构如图所示1。此外，绝大多数的黄酮类化合物Premna叶Craib是黄酮C-糖苷[9]。今天，健固注射剂是由Premna叶Craib使用超声辅助提取，这已经取代了传统的技术，如浸渍（40％乙醇）[10，11]，它具有缺点，例如低效率和溶剂的蒸气压高。因此，有必要开发用于黄酮二C糖苷的从提取的有效和环境友好的技术Premna叶Craib。

深共晶的溶剂（DESS）正迅速成为一类新的绿色溶剂来代替有机溶剂和离子液体。DESS是通过氢键受体（HBA）和一个氢键供体（HBD）的络合得到共晶系统。其中最常用的HBA是氯化胆碱（氯仿），这是一种便宜的，可生物降解的，和无毒的盐。处理基于CHCL-DESS的毒性评估出版物它们为朝向测试细菌完全无害[12]和归类它们作为具有良好前景容易生物降解的用于绿色技术领域广泛使用[13]。因为大多数HBA和HBDS天然存在的，本DESS独特的物理化学性质，如低毒性，低的蒸气压，不燃性，和高生物降解性，并且可以廉价地制备。DESS已被广泛应用为从植物[提取或天然产物的分离14-18]。近日，段等。[19]已应用的合成将Dess提取3生物活性的黄酮从单C-糖苷金莲花。ChCl-ZnBr被证明是最有效的溶剂，但它是一种毒性或大或小且难以降解的离子液体。据我们所知，DESs提取生物活性黄酮二- c糖苷的效率Premna叶Craib仍然未知。因此，本研究的目的是引入一种更高效、更环保的DESs提取黄酮二- c -糖苷的技术。本研究考察了DESs作为绿色溶剂提取黄酮类二- c -糖苷的效果Premna叶Craib超声波辅助提取。制备了13个胆碱氯酰DESs，用于同时提取五种生物活性黄酮二- c糖苷。通过对萃取工艺的评价，确定了提取率最高的最佳DES。采用Box-Behnken设计对提取的自变量(液固比、所选DES的水含量(%)和提取时间)进行优化。最后，用扫描电镜观察提取后样品的微观结构变化。我们进一步验证了用大孔树脂从DESs中回收黄酮二- c -糖苷;考察了DESs作为溶剂的可重复使用性。

2.材料和方法

2.1。材料与试剂

Premna叶Craib是从当地的一个中药市场(广西玉林)购买的，研磨成细粉。参比化合物芹菜素6,8-二- c -β-D-glucopyranoside (1），芹菜素6-C-β-D-D-吡喃木糖基 - 8-C-β-D-glucopyranoside (2），芹菜素6-C-β-D-D-吡喃木糖基 - 8-C-β-D吡喃半乳糖苷（3），芹菜素6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-βD-吡喃木糖苷（4和芹菜素6-C-β-D吡喃半乳糖基8-C-βD-吡喃木糖苷（五)从健骨注射液(Premna叶如我们先前的报告所述[8]。

氯化胆碱、甘露糖、d -果糖、葡萄糖、木糖、甘油、乙酰丙酸、1,3-丙二醇、乙醇酸、d -乳酸、丙二酸、酒石酸、柠檬酸、尿素等制备DES的化合物均来自阿拉丁试剂公司(中国上海)。HPLC级甲醇购自默克公司(德国达姆施塔特)。水使用Milli-Q净水系统(Millipore, MA, USA)制备。其他试剂和化学品为分析级。

2.2。HPLC分析黄酮迪-C糖苷的定量

定量分析采用岛田LC-20AT高效液相色谱仪，配备LabSolutions软件进行数据采集和分析。5、Agilent Zorbax锑- c18柱(250 mm×4.6 mmμm)用于分离化合物。流动相为0.1%醋酸水溶液(溶剂A)和甲醇(溶剂B)，梯度如下:0-15分钟，5-20% B;15-50分钟，20-40% B;50 - 60min, 40-5% B;在190-400 nm波长范围内使用紫外检测。流速1.0 mL/min，柱温35℃。样品的峰面积在280nm处进行监测。典型的HPLC色谱图Premna叶Craib样品和五种黄酮二- c -糖苷参比化合物如图所示2。黄酮二- c -糖苷的质量是通过建立回归方程的校准曲线来确定的ÿ是峰面积和X为黄酮二- c -糖苷标准品的质量(μg).每个样品用高效液相色谱分析，重复测量。在高效液相色谱分析中，发现样品中DESs的存在并不影响所得的色谱图。

2.3。DESS的制备

戴斯是根据以往的研究方法制得。20]。总之，DESS，拟定了HBA到HBD的不同摩尔比。共晶混合物通过两个部件的旋转蒸发在80℃-90℃的水浴中，直到准备形成均匀的透明液体。表1礼物的研究DESS的组成，与用于他们这项研究的缩写一起。

2.4。DESs的提取过程和选择

的DES-based ultrasonic-assisted extraction procedure was as follows: an accurately weighed 100 mg sample of powderedPremna叶Craib(通过200目筛子筛选)添加到1.4毫升(DES:水= 1:0.4 v / v,相当于含水量28.6%)的13个不同的一部分在5毫升锥形烧瓶。将混合液(KQ5200B, 200w, 40khz，中国昆山)在50℃水浴中超声处理30分钟，然后12000 rpm离心10分钟。将悬浮液加水稀释三倍，用高效液相色谱法测定提取剂。提取一式三份。重复上述步骤，筛选参比溶剂(40%乙醇)的萃取性能[10]。

根据标准曲线方程(Eq.)计算提取液中黄酮二- c -糖苷的质量，根据此值计算提取效率(EE)，计算公式如下:

利用黄酮二- c -糖苷对不同DESs的提取效率，选择最合适的DES作为提取溶剂进行后续实验。

2.5。优化DES萃取参数

使用软件包设计-专家版测定总黄酮二C糖苷的最佳提取参数。8.0.6。使用在响应面法（RSM）组合箱Behnken法设计（BBD）以找到最佳值的三个独立的变量：液固比（X₁)、含水量(X₂)，提取时间(X₃)三个水平(−1,0,1)。设计实验以提取的五种黄酮类二- c -糖苷的总含量作为响应。利用实验数据进行回归分析。随后，我们进行了进一步的验证实验，以验证统计确定的实验策略的有效性。

2.6。扫描电子显微镜

按先前所述进行扫描电子显微镜(SEM) [21]。简而言之，试样被安装在铝桩上，并溅射一层薄薄的金。制备的样品使用EVO18蔡司扫描电子显微镜(ZEISS，德国)成像。

2.7。从戴斯的DESS和可重用性黄酮的恢复迪-C糖甙

使用大孔吸附树脂柱层析法[测定黄酮来自DES萃取二C糖苷的回收率10，11]。取1ml的萃取液置于装有10g D101大孔树脂的玻璃柱上。用100毫升去离子水去除极性DES组分，然后用100毫升乙醇洗脱样品。乙醇洗脱组分在真空蒸发器中干燥，再溶解于10ml甲醇中进行高效液相色谱分析。DES的解决方案被删除恢复在90°C下残余水真空泵。回收的DESs可用于黄酮二糖苷的进一步提取Premna叶Craib。

3.结果与讨论

3.1。方法验证

确定最佳HPLC条件，线性，检测限（LOD）的限制，和定量限（LOQ）后进行了评估。对于线性测试，以十种不同浓度水平的分析物的标准溶液一式三份注入。校准曲线通过绘制色谱峰的集成领域（建设ÿ）相对于所述分析物的注入的标准溶液相应的质量（X，μg)。

在测试的浓度范围内，每个分析物都获得了良好的线性度([R² > 0.99) (Table2)。的LOQ和LOD通过逐渐稀释用甲醇各个标准溶液确定，并计算为10和3分别的信号 - 噪声比（S / N）。在本研究中，LOD和LOQ值均小于0.06 μg和0.18μ克（表2），这表明所提出的方法具有优良的灵敏度，并允许直接测定黄酮二C糖苷的豆腐fulv未经过任何浓缩步骤的Craib。

3.2。在黄酮狄-C糖苷的提取各种DESS的评价

DESs的组成决定了它们的物理化学性质，从而影响天然化合物的EEs。在本研究中，13种不同的基于chcl的DESs(表)1)，以测试他们的EEs中黄酮类二- c糖苷Premna叶Craib。

但由于DESs的高粘度，传质速度慢，限制了其应用。据报道，在DESs中加入水会改变它们的粘度和表面张力，这可能会影响它们对目标化合物的萃取效率[22]。因此，DESs中28.6% (v/v)的含水量作为初步筛选的标准条件。设定提取温度为50℃，提取时间为30 min。为了比较DESs和参比溶剂(40%乙醇)的EE，在相同的操作条件下进行了3次重复提取。五种黄酮二- c糖苷通过不同的DESs获得的EEs如图所示3。

结果表明，黄酮类二- c糖苷的EEs含量受DES种类的影响。可见，粘度是固液提取过程中的一个重要性质，影响了黄酮的提取。与40%乙醇相比，四种DESs (de - a /B/C/D)显示总黄酮二-C-糖苷的EE值较低。然而，DES-J和L导致的EEs比DESs更低(desa /B/C/D);这可能是由于黄酮之间的化学反应di-C-glycosides丙二酸和柠檬酸酸碱密不可分,这改变了解决方案从淡黄色到深绿色在提取过程中。

下所设计的参数，合成DESS（DES-F / G / H / I）的四为总黄酮二C糖苷提供更高的EE。DES-F（氯化胆碱/ 1,3-丙二醇）具有比DES-G / H / I略高EE。该实验结果可以归因于DESS和目标溶质之间的氢键相互作用（黄酮二C-糖苷）。In addition, similar results have been reported in which choline chloride/1,2-propanediol, (1 : 2 mol ratio) was selected as the most effective solvent for extraction of flavonoids in花粉typhae[23]。然而，实验结果与Duan等人的报道并不一致[。19]。一种可能的解释是，每种植物中所含的黄酮c -糖苷种类不同，因此具有不同的物理化学性质，从而导致类似的DESs提取结果不同。结果表明，DES- f作为提取黄酮类二- c -糖苷的最佳DES进行了进一步的试验Premna叶Craib。

3.3。对于总黄酮迪-C糖甙的提取DES参数的优化

如上所述，DES-F(氯化胆碱/1,3-丙二醇)提供了黄酮二- c糖苷最高的EEPremna叶Craib。氯化胆碱/1,3-丙二醇的共晶混合物，摩尔比为1:1,1:2,1:3,1:4，用于提取黄酮二- c糖苷Premna叶Craib。结果表明，2:1摩尔比的DES-F具有最高的EE。获得的最优EE生物活性黄酮di-C-glycosides,三个因素(液固比(X₁，10-五0 mL/g), water content (X₂，10％-50％），和提取时间（X₃通过初步的单因素试验，采用Box-Behnken设计(BBD)进行考虑。响应面方法(RSM),一个有价值的多元统计技术的统计方法,采用同时优化研究因素的水平达到最高的EE在这项研究。实验顺序、变量水平和响应值见表3。以总黄酮二- c糖苷的EE作为设计实验的响应。

利用这些变量和响应拟合得到的实验数据，建立总黄酮- c -糖苷二次多项式模型如下: 哪里ÿ代表总黄酮-C糖苷的EE（毫克/克），并X₁，X₂,X₃分别为液固比(mL/g)、含水量(%)和提取时间(min)的编码变量。

统计分析(表4)指出了影响黄酮二- c -糖苷EE的显著变量以及变量间的交互作用。高F值(68.09)和低值(<0.0001)表明回归模型显著，能够准确地表征实验数据。的由于缺乏合适的值（ ）暗示与单纯误差相比不显著，说明所建立的预测数学模型能很好地解释所有数据。测定系数([R²= 0.9887)，是模型拟合程度和适用性的指标，调整系数(Adj。[R(- 2 = 0.9742)，回归模型的精度(22.075)表明，该模型具有较高的精度和可靠性。因此，统计结果表明，该模型能够很好地反映黄酮类化合物的情感表达与自变量之间的真实关系。

为了描述的提取参数和黄酮的EE之间的关系，三维（3D）响应面曲线用RSM研究，如图4。所有的3D响应表面被呈拱形，这表明变量的范围分别为实验的范围内，并得到适当优化。

基于二次模型和三维响应面,提取黄酮的最佳条件di-C-glycosidesPremna叶Craib计算如下(表五）: a liquid-solid ratio of 31.18 mL/g, water content of 32.74%, extraction time of 43.10 min, which gave the highest EE of total flavone di-C-glycosides (17.68 mg/g). Taking into account the accuracy of the instrument, the optimal conditions were modified to a liquid-solid ratio of 31.00 mL/g, water content of 33.00%, and extraction time of 43.00 min. Then, the verification experiments were carried out in triplicate. The EE of total flavone di-C-glycosides was 17.37 mg/g, which was close to the predicted value of 17.68 mg/g. The total EE was greater than that of the conventional extraction system (40% ethanol, 13.70 mg/g; Table五)。验证实验结果表明，该模型能较好地预测优化后的工艺参数。

3.4。微观结构表征用扫描电子显微镜

为了更好地理解为什么DES-F表现出最好的EE，通过对其微观结构的研究Premna叶用DES溶剂对萃取前后的Craib进行了表征(图)五)。的结构Premna叶Craib根的石细胞团（石细胞团）形成。在提取之前，细胞壁是光滑的和不可见的，并且在细胞腔有一个大的缝隙（图5(一个))。用40％乙醇处理后，细胞壁明显溶胀（图5 (b))。用DES-F处理后，将细胞壁显著溶胀，细胞腔的缝隙被削弱，这表明细胞间物质已经暴露并与提取溶剂接触。这符合先前的研究[24]，其中DES (ChCl: 1,2-丁二醇)形成多孔开口丹参邦吉由于纤维素的提取后的溶解，从而释放天然产品到周围环境中。

3.5。从DES中提取黄酮二c -糖苷及其重复利用性

DESs具有较低的蒸汽压，使得从提取物中回收提取的化合物相当具有挑战性。然而，几种方法，如液-液萃取、固-液萃取、超临界二氧化碳和重结晶可用于从DESs中回收目标提取物[25]。在这项工作中，总黄酮二C糖苷的恢复被选择作为评价指标，和固 - 液萃取法显示的81.59％的可接受的回收产率。结果表明，D101树脂也能有效地吸附黄酮二C糖苷在DES-F。然而，恢复和DES的可重用性仍有待解决。从去离子水的树脂D101洗脱DES后，从DES-F通过用真空泵在90℃下加热蒸发水。用于黄酮二C糖苷的EE方面的恢复和DES的可重用性的结果示于图6。三个周期之后，黄酮二C糖苷的EE是相同于CON的。然而，在随后的周期中，EE迅速下降，这有可能是由于在其性能参数的变化，由于在植物中的极性杂质。因此，DES-F可有效地通过简单的蒸发回收。

4.结论

综上所述，本文建立了一种简单、绿色、高效的提取方法，以DES为提取溶剂，提取具有生物活性的黄酮二- c -糖苷Premna叶Craib。摘要成功地合成了13种不同的氯代甲烷DESs，并用于提取五种具有生物活性的黄酮二- c糖苷。结果表明，DES-F(氯化胆碱/1,3-丙二醇)是最有效的溶剂。并通过正交试验，确定了黄酮二c糖苷的最佳提取条件。此外，利用D101大孔树脂可从DES提取物中回收黄酮二- c -糖苷，回收的DES可用于其他提取。基于DESs对目标化合物提取效率的有利影响，开发的DESs可能是一种可持续的提取生物活性产品的方法，从而使植物化学更具吸引力和环境友好性。

数据可用性

支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者或第一作者处获得。

的利益冲突

作者声明，本论文的发表不存在任何利益冲突。

作者的贡献

对这项工作，陈月渊和党阳都有贡献。

致谢

这项工作得到了广西创新驱动发展专项(GuikeAA18118015)和广西壮族自治区自然科学基金(2018GXNSFAA294031)的资助。作者感谢Editage (http://www.editage.cn）英语语言编辑。

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