文摘
客观的。子宫内膜癌在历史上被histomorphologic外形分类,这是interobserver分歧。分子和生物标志物检测日益可用,预后意义和histomorphologic诊断的准确性受到质疑。为一个大型的解决这些问题,前瞻性群组研究中,我们提供的结果集中的病理学检查和生物标志物分析1976年和2012年之间的所有附带子宫内膜癌发生在护士健康研究。方法。常规组织学( )综述了histomorphologic诊断病例。例随后种植在组织微阵列来探索各种生物标志物的表达(例如,ER、PR、p53、PTEN、我们,AMACR, HNF1β,Napsin p16、PAX8 GATA3)。结果。组织学亚型包括endometrioid(87.2%)、浆液性(5.6%),癌肉瘤(3.9%)、透明细胞(1.7%)和混合型(1.7%)。生物标志物在组织学亚型结果与现有文献一致:p53是异常频繁的浆液性情况下(74%),和HNF1β(67%)、Napsin (67%), AMACR(83%)表达在透明细胞癌频繁。数据集还允许审查的生物标志物表达non-preselected组织学。结果表明,(1)HNF1β没有特定的透明细胞癌,(2)TP53突变发生在许多组织学,(3)GATA3跨多个histotypes表示,75%的阳性病例展示高档功能。结论。我们的研究结果建立子宫内膜癌的亚型发生在护士健康研究,证实了某些行之有效的生物标志物的敏感性,并质疑以前确定的某些生物标志物之间的联系(如HNF1B)和特定histotypes。
1。介绍
子宫内膜癌在历史上被histomorphologic subclassified独自出现(1,2]。然而,histomorphologic分类患有interobserver协议问题,尤其是高档子宫内膜癌的情况下(例如,菲戈三年级endometrioid,透明细胞癌,浆液性癌和癌肉瘤)(3- - - - - -7]。此外,在分子时代,判定预后形态子类型化是不够的。最著名的就是癌症基因组图谱分子子宫内膜肿瘤分为四个类别是影响预后的重要不分组织形态学(8]。
尽管肿瘤的形态学分析的固有限制,histomorphologic诊断很大程度上决定了包含在癌症登记以及在临床和流行病学研究(9]。这些诊断可能遭受诊断类别的变化随着时间的推移,没有集中的病理学检查,而且,重要的是,没有确定的生物标志物(免疫组化)数据。
生物标志物的应用(例如,immunohistochemical staining) assists pathologists in rendering more accurate diagnoses. A recent study found that up to 40% of cases initially diagnosed as high-grade endometrial endometrioid adenocarcinomas may be reclassified as uterine serous carcinomas based on a panel of four immunostains (p53, p16, estrogen receptor (ER), and mammaglobin) [10]。然而,应用在日常实践中往往不追求由于病理形态学的确定性程度或模棱两可的结果的可能性。
此外,生物标志物有自己的局限性。敏感性和特异性生物标志物在很大程度上是由研究高度选择群肿瘤,通常只包括那些有明确的形态。因此,敏感性和特异性的标记往往转移一旦标记应用于临床,例不典型的形态。例如,肝细胞的核factor-1beta (HNF1β)表达最初认为100%到93的特异性透明细胞癌(11- - - - - -14];然而,加班,特异性被质疑为表达已经被记载在浆液性的一个子集,endometrioid癌(15- - - - - -17]。
在这项研究中,我们试图解决上述两个问题。首先,我们执行一个集中审查的子宫内膜癌病例出现在护士健康研究中,一个大型的、长期随访的前瞻性群组研究。其次,我们试图系统地应用一组生物标志物的子宫内膜癌病例,因此探索亚型的表达。我们探索当前行之有效的生物标记在他们的解释(例如,p53)以及更多的新颖的生物标记物(如GATA3)。进一步,我们探索应用生物标志物的局限性和福利回顾的一个大型的流行病学研究中,尤其是解释设置的组织微阵列的可行性。
2。材料和方法
本研究是人类研究审查委员会批准的布莱根妇女医院。本研究的协议是人类研究委员会批准的布莱根妇女医院,波士顿,MA,美国。
2.1。病例选择
使用数据从护士健康研究(18,19),121700名女护士的前瞻性群组发起于1976年,1976年和2012年之间的所有附带的子宫内膜癌诊断中被确认。
当可用时,石蜡包埋组织和苏木精和伊红染色幻灯片从患者的子宫内膜活检或子宫切除术。只有例石蜡块创建的组织微阵列是包括在内。完整的原始临床诊断的苏木精和伊红部分块接受中央病理学家(GM)病理学检查,和每种情况下使用的组织学诊断是呈现当前诊断标准(1]。额外的信息关于如何确定和组织微阵列建设发表在其他地方(20.]。
对于每一个标本,选择具有代表性的石蜡包埋组织块,三0.6毫米核心被种植在一个组织微阵列。串行部分的芯片被用于标记研究如下。
2.2。免疫组织化学研究
对于每一个标记研究,four-micron每个组织微阵列的厚部分染色在下列顺序:苏木精和伊红,标志复制1,pankeratin AE1 / AE3 (Dako猫# M3515 1: 200稀释),和标志复制2。以下应用使用徕卡进行债券三世染色平台使用以下主要抗体:雌激素受体(ER,小鼠单克隆ERID5 (Dako) 1: 300稀释)、孕激素受体(PR,小鼠单克隆PgR636 (Dako) 1: 150稀释),p53(鼠单克隆帕布1801(徕卡生物系统)1:300稀释),AMACR(兔单克隆Z2001(ζ集团)1:50),ARID1A(兔多克隆HPA005456(σ)1:200稀释),GATA3(鼠单克隆预示- 823 (Biocare) 1: 100稀释),HNF1β(兔多克隆HPA002083(σ)1:500稀释),Napsin一(鼠单克隆NCL-L-Napsin(莱卡)1:400稀释),p16(鼠单克隆E6H4 (Ventana) 1: 300稀释),我们(多克隆兔Z-RX2(表达载体)1:300稀释),PAX8(兔多克隆10336 - 1 - ap (Proteintech) 1: 600稀释),和PTEN(鼠单克隆6 h2.1(微孔)1:100)。
2.3。标记的解释
彩色幻灯片都是数码拍摄40 x放大由滨松nanozoomer整个幻灯片数码扫描仪。对于每一个标记,苏木精和伊红和keratin-stained图像匹配的组织微阵列部分被用来证实肿瘤组织和歧视的存在肿瘤细胞从背景。重复的污渍为每一个标记都独立得分标记肿瘤细胞内的特定信号(JW和通用汽车)(见表1评分方法)。不和谐的复制被rereview解决。标记平均得分连续尺度是在重复运行最终的数据分析。由于技术故障,组织辍学,高背景,或低信号被排除在外noninformative marker-by-marker基础上。
由于有限的肿瘤代表组织微阵列,p53只是解释为不正常的染色时扩散和强大;“零”表型没有报道由于没有染色的可能性或肿瘤的表达在不同的地区,因此假阳性的可能性(21]。
2.4。包含和排除标准
有些病人有单独的子宫内膜活检和子宫切除标本含有肿瘤。染色后,唯一标本每个病人(1)包括在最终的分析中,与偏爱子宫切除标本活检。Nonepithelial肿瘤被排除在外。癌肉瘤和混合癌病例包括在内。
2.5。协变量
诊断(连续)年龄和身体质量指数诊断(22(连续,公斤/米2)从过去两年一次的评估癌症诊断之前护士健康研究的调查问卷。
2.6。统计分析
执行统计分析在SYSTAT (v13.1 SYSTAT软件,Inc .,圣何塞,CA)。单向方差分析用于独立比较年龄和身体质量指数和诊断肿瘤的亚型。 - - - - - -测试,与单独的差异,采用比较生物标志物表达跨年龄和身体质量指数。结果与值< 0.05被认为是具有统计学意义。层次聚类的呈双峰得分(正常和异常)标记结果进行使用病房的联系和Jaccard距离度量相似系数。双峰得分连续完成百分比的雌激素和孕激素受体在阈值的10%。
3所示。结果
病理材料收到472年报道子宫内膜癌患者。入选标准应用程序后,360名患者有足够的组织包含的组织微阵列(343子宫切除标本和17个活检/刮除术)。
3.1。Histomorphologic审查
Histomorphologic诊断如下:314 endometrioid(87.2%)、20浆液性(5.6%),癌肉瘤14(3.9%)、6透明细胞(1.7%)和6混合endometrioid + nonendometrioid类型(1.7%)。在endometrioid集团244是1级,43岁的二年级,三年级27。
3.2。生物标志物在Histomorphologic诊断结果(表2)
透明细胞癌经常表示AMACR HNF1B, Napsin(分别为83.3%、66.7%和66.7%)。浆液性癌通常显示弥漫性、强p53染色(突变表型;73.7%)和p16扩散积极性(70%)。Endometrioid肿瘤表现出高水平的ER(92.7%)和公关(85.1%)表达式,最高的ER和PR的表达在菲戈1级Endometrioid肿瘤。
3.3。生物标志物的表达在Histomorphologic诊断
GATA3表达跨histotypes(总共16例;10 endometrioid(62.5%), 3浆液性(18.8%),癌肉瘤2(12.5%),和1透明细胞(6.25%))。积极与表达HNF1 GATA3表达相关β( )和p16 ( )我们和无染色( ),ER ( ),和公关( )。Rereview GATA3阳性肿瘤显示缺乏形态学结果符合中肾癌。进一步,12的16例显示高级形态模糊的细胞学(图1)。GATA3 PAX8,分别标记中肾和缪勒的起源,并不总是相互排斥的。79.6%的病例(262/329)是唯一的两个标记阳性,15.8%(52/329)-对,4.6%(15/329)的病例阳性。
(一)
(b)
(c)
(d)
扩散,强劲的p53表达(突变表型)遍布histotypes。p53突变的肿瘤(37),37.8%是浆液性,32.4%是endometrioid, 13.5%是癌肉瘤,8.1%是透明细胞癌,8.1%是混合类型。HNF1β显示出类似的缺乏相关性与特定的组织学类型endometrioid阳性病例的71.9%,10.5%,浆液性癌肉瘤7.0%,7.0%透明细胞癌,3.5%的混合类型。另一种方式,癌肉瘤的33.3%,66.7%的透明细胞癌,endometrioid癌的13.7%,混合型肿瘤的40%,和31.6%的浆液性癌彩色HNF1积极β。
突变型p53染色与异常的变量相关性p16染色,之前报道协会尤其是浆液性癌(23]。在我们的整体人群中,p16和p53染色是不和谐的在8.9%的情况下(31/347)。在这些病例中,48.3%(15/31)表现出突变型p53 p16染色只有不完整的。
3.4。标记的表达模式
层次聚类的生物标志物的结果240例完整的数据显示了两个主要演化支对应PTEN和P53突变类(图2)。
3.5。年龄、身体质量指数和生物标志物的表达
年龄在组织学的诊断被发现统计不同类别( ,表3),endometrioid类型肿瘤呈现在年轻的年龄(平均 比其他亚型y)。身体质量指数在诊断类别(没有显著差异 ,表3)。
当身体质量指数和年龄与生物标志物相比(表表达式4),发现了几个重要的关联。身体质量指数显著低于女性的肿瘤HNF1表示β(26.9 vs 30.5公斤/米2, ),Napsin (25.1 vs 30.0公斤/米2, ),和突变型p53 (26.0 vs 30.3公斤/米2, )。身体质量指数明显高于女性的肿瘤表达ER (30.3 vs 27.2公斤/米2, )和公关(30.4 vs 28.2公斤/米2, )。表达我们的损失与年轻有关诊断(68.6和70.5, )。
4所示。讨论
我们的研究解决两个关键问题。首先,我们进行了集中检查的子宫内膜癌的护士健康研究。其次,通过生物标记物的管理一个大型的、偶然的群体,我们研究了生物标志物的表达在子宫内膜肿瘤与变量的谱形态。
正如预期,大多数偶然情况下子宫内膜癌的护士健康研究(87.2%的病例)(即“1型子宫内膜癌”。雌激素刺激,endometrioid腺癌产生二次)。这种“1型”癌症占大多数的子宫内膜肿瘤,通常出现在肥胖,绝经后的妇女(24- - - - - -26]。(即“II型子宫内膜癌”。,predominantly nonendometrioid carcinomas arising in the setting ofTP53突变或1删除页)(25- - - - - -27),是不太常见的在我们的群体中,反映了一般人群的流行率较低。
我们的生物标志物的探索这些肿瘤证实了先前存在的I型和II型子宫内膜癌之间的关联与激素受体和p53表达。低级endometrioid癌(I型)高表达ER和PR的,支持致癌作用的激素通路。同样,我们2型肿瘤(nonendometrioid)证明频繁p53过度(突变表型)。这些发现并不新颖,但做支持的可行性和可靠性将生物标志物应用于大型流行病学研究回顾性的方式。
当我们在histotypes证实先前存在的生物标志物表达模式,我们研究的优势是能够评估生物标记在一个偶然的群histomorphologic亚型。多个marker-histotype相关性被发现比此前认为的那么具体。具体地说,虽然p53异常出现浆液性癌的73.7%,62.2%的p53肿瘤有nonserous组织学异常。这个经验是反映在其他纯粹marker-driven子宫内膜癌分类系统如genomic-based TCGA分类模式,在分子和组织病理类只有部分重叠,和一些独特的分子表型的临床利益(如聚合酶E突变)不能可靠地确定单靠组织学(8,16]。
另外我们的研究导致了越来越多的证据表明,HNF1β是一种非特异性的标记(15- - - - - -17]。三分之二的透明细胞沾HNF1病例β,31.6%的浆液性癌和13.7%的endometrioid HNF1癌表达β,使HNF1β染色透明细胞的一个不可靠的标记与浆液性/ endometrioid微分。因此,我们得出结论:HNF1β,就其本身而言,不应该被认为是一个特定的标记为透明细胞癌在临床实践中。
我们的研究结果对于表达GATA3也感兴趣的。之前的研究证明GATA3是一个高度敏感的和特定的标志中肾损伤的血统更低的女性生殖道(28,29日]。在我们的研究中,GATA3阳性染色的样品没有子宫肿瘤并不对应任何单个histotype。值得注意的是,所有的情况下,即使是那些低级的细胞学、显示中肾癌的经典形态学特征(例如,小圆管、立方形的或平台式上皮,使成角泡状核)。此外,16 12阳性病例显示高档或模棱两可的细胞学的特性,提高的可能性,低分化子宫内膜肿瘤可能表达GATA3不是由于血统而是由于功能获得突变。这进一步证明了我们的发现,4.6%的病例证明积极性PAX8和GATA3,两个污点应该彼此互相排斥。
无监督自组织系统树图的标记结果在我们的肿瘤显示了如何组合标志趋势可以定义肿瘤组(图2)。两个主要集群是显而易见的:p53突变的胳膊,PTEN /我们的手臂,对应“II型”和“I型子宫内膜癌”,分别。进一步,p16、p53群有别于Napsin / AMACR / HNF1β类。值得注意的是,GATA3表达式集群与透明细胞标记和/或p53 / p16的表达。这个集群提供了额外的证据表明GATA3表达式可能表示异常表达/功能获得突变在高档的突变引起的恶性肿瘤TP53而不是中肾血统。
鉴于我们独特的数据集,我们可以比较生物标志物表达在参与者的年龄和身体质量指数。正如所料,p53表达与显著较低的身体质量指数,和ER / PR表达明显高于与身体质量指数(额外的ER /公关报告在这个群体的研究[20.])。此外,endometrioid-type肿瘤倾向于出现在早期年龄比其他亚型。这些发现符合常见的子宫内膜癌形成机制要么荷尔蒙刺激(通常是在肥胖的设置)(30.]或p53突变导致肿瘤生长25,26,31日,32]。
我们研究并突出一些必需品和限制使用的组织微阵列。值得注意的是,当执行一个集中的病理学检查,我们发现它基本呈现一个形态学诊断整个圆)的幻灯片,而不是组织微阵列的准备工作。这是由于有限的肿瘤组织微阵列上。其次,偶尔由于缺乏内部控制的组织微阵列组织指出,我们建议运行单独的积极控制每个组织微阵列分析。我们还建议复制污点读取为特殊的运行控制,理想的情况是由相互独立的复制了盲目的病理学家。组织微阵列在我们的研究中使用的主要限制是无法可靠地解释零表型p53蛋白引起的罕见无意义突变(33]。因此,更多的情况下可能有异常的p53染色比我们可以从我们的组织微阵列准备可靠的结论。
在这项研究中,我们提供了一个集中审查的子宫内膜癌的护士健康研究以及生物标志物表达结果在这个队列。这些数据主要是适用于未来的临床和流行病学研究获取数据,对子宫内膜癌形成了护士健康研究。然而,我们也能够测试的假设,生物标志物的研究用例所预选的病理学家可能导致高估了敏感性和特异性。对于GATA3、p53和HNF1β,我们发现这个假设是正确的。我们相信我们的方法测试的生物标志物在附带的癌症提供了更为现实的意义上的效用的标记,当应用于偶然的疾病。进一步,我们发现模拟的癌症基因组图谱和其他数据收集从下一代测序中有很多重叠突变的肿瘤组织形态学定义的类别。我们得出这样的结论:一个生物标志物的表达(如HNF1β和GATA3)不应被解释为特定肿瘤的诊断也没有考虑组织学类型。我们建议,在组织学的怀疑,一个小组的应用,包括污渍冗余诊断(例如,PTEN、ARID1a和ER endometrioid腺癌;HNF1β,Napsin, AMACR透明细胞癌;p16和p53浆液性癌),执行而不是依靠单个应用。最后,我们表明,组织微阵列有一定的局限性;然而,生物标志物研究的结果在此设置在很大程度上是可靠的和可再生的。
数据可用性
护士健康研究数据整合在哈佛大学公共卫生学院的,不公开的没有IRB和应用程序的访问。
附加分
突出了。(1)本研究描述所有的护士健康研究子宫内膜癌。(2)我们的研究质疑特异性的几个常用的生物标志物。(3)我们证明组织微阵列是可靠的和可再生的回顾性研究。
信息披露
投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。相应的作者有完全访问所有的数据在这项研究中,并最终负责决定提交出版。她c·沃特金斯目前的地址是病理学系,马萨诸塞州总医院,55水果圣。,波士顿,MA 02114,美国。
的利益冲突
作者没有利益冲突的报告。
作者的贡献
她c·沃特金斯是主要的作者和参与免疫组织化学和统计数据收集、分析和解释。迈克尔·j·唐宁涉及组织微阵列结构和免疫组织化学染色技术,提供编辑最后的手稿。玛尔塔Crous-Bou参与流行病学的部分数据收集和编辑提供最后的手稿。埃文·l·布希参与流行病学的部分数据收集和编辑提供最后的手稿。玛克辛陈参与流行病学的部分数据收集和编辑提供最后的手稿。Immaculata De体内从护士健康研究的主要合作者协助研究设计和编辑最后的手稿。乔治·l .抱怨是首席研究员;设计研究,收集数据,并进行统计分析;并提供最终编辑手稿。所有作者都批准了最后一篇文章。
确认
作者要感谢参与者和员工的护士健康研究的价值贡献以及以下国家癌症登记他们的帮助:艾尔,AZ, AR, CA,有限公司,CT,德,FL, GA, ID,,, IA,肯塔基州,洛杉矶,我,医学博士,硕士,MI, NE, NH,新泽西,纽约,数控,ND,哦,好吧,或者,PA, RI, SC, TN, TX,弗吉尼亚州,佤邦,和为什么。我们也感谢钱宁分工网络医学,医学部门,布莱根妇女医院和哈佛医学院。最后,我们要感谢De Vivo和抱怨实验室的成员对他们的援助。护士健康研究由美国国家癌症支持制定全国性卫生研究院(听UM1 CA186107和P01 CA87969)。本研究由国家癌症研究所的资助(2 R01 CA082838-10)。ELB和MMC支持的部分资金来自美国国家癌症研究所(5 t32ca009001)。部门提供的额外的项目支持(病理学、BWH)研究基金(GLM)。