文摘

产生的单核苷酸多态性(nsSNPs) DNA修复基因可能是DNA损伤和癌症风险的重要因素。我们应用一组筛选标准来大量nsSNPs和选择一个子集的单核苷酸多态性可能对表型影响DNA双链断裂修复(DSBR)。为了诱导和遵循DSBR,我们接触板的细胞系γ辐照和遵循的形成和消失 H2A。随着时间的推移X疫源地。所有的细胞系的面板显示数量明显增加,强度和疫源地面积小时和3小时的时间点。二十四小时曝光后,返回的病灶数预曝光水平在所有的细胞系,而病灶的大小和强度仍显著升高。我们看到没有显著差异 H2A。X焦点之间的控制和面板的任何代表不同nsSNPs细胞系。

1。介绍

双链断裂修复缺陷(DSBR)可以导致基因组不稳定,最终癌症(1]。一些疾病症状罕见的基因突变,破坏DSBR和与癌症风险增加导致表型包括连接酶IV (LIG4)综合征,严重联合免疫缺陷对电离辐射的敏感性(RS-SCID) Ataxia-telangiectasia (t),奈梅亨破损综合症(国家统计局)和Fanconi贫血互补群D1 (FANCD1) [2]。此外,越来越多的文献表明,DSBR共同多态性基因可以增加,在某些情况下减少,患癌症的风险(3- - - - - -8]。

最近重测序的努力环境基因组计划(9)和其他人已经大大扩展了已知的单核苷酸多态性(snp)的列表在DNA修复基因。然而,只有少数的这些单核苷酸多态性研究协会的研究,已经在体外功能特征的就更少了。很多的计算机工具,包括排序不能容忍宽容(筛选)(http://sift.jcvi.org/),多态性表现型(PolyPhen) (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/data/index.html)和SNPs3D (http://www.snps3d.org/)可以用来预测一个SNP对蛋白质的影响函数,结构,或基因调控,尽管最终需要体外功能的研究来证实这些预测。

双边带可以评估在体外的本地化H2A.X磷酸化形式的组蛋白变体。在组蛋白H2A应对双边带。139年X分子迅速成为磷酸化丝氨酸的一员磷酸肌醇(PI) 3-kinase家庭包括自动取款机,dna - pk,ATR(10- - - - - -14]。这些磷酸化H2A。X的分子,称为γH2A。X,可以跨2 Mb的染色质周围双边带,可以可视化显微镜下不同的焦点后荧光抗体标记(11,12]。不仅可以双边带,反过来H2A。X磷酸化,由外生代理如电离辐射诱导内生在DNA复制时,还可以发生在有丝分裂和减数分裂重组,细胞凋亡、衰老,端粒缩短,V (D) J重组(11- - - - - -13,15]。的形成γH2A。X焦点是细胞随周期变动和大S -比G1和G2 / m期,反映两个双边带中创建可用的DNA复制和数量的增加,双边带可能发生(16]。

先前的报道展示了双边带的数量和之间的直接关联的数量γH2A。X焦点(11,17]。一些研究也表明DSBR与动力学γH2A。在低剂量辐射X感应和间隙磷酸酶(17- - - - - -20.]。使用电离辐射剂量与使用在我们的研究中,一些组织使用γH2A。X疫源地形成和消失随着时间的推移,成功地检测DSBR缺陷细胞中与已知突变DSBR基因,如LIG4,XRS-6,dna - pk,自动取款机(17- - - - - -19,21]。

我们应用一组筛选标准和计算机预测工具来确定一组5 nsSNPs出现可能影响DSBR。使用γ辐照诱导双边带,我们评估板的人类基因组单体型图和环境基因组计划(出路正常人类lymphoblastoid细胞系代表每个snp和感应的动力学γH2A。随着时间的推移X疫源地和持久性。

2。材料和方法

2.1。选择Nssnps

使用dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP)(126年建立),我们列出了1455年在149个基因已知nsSNPs参与DNA修复(22]。其中,227年nsSNPs微小等位基因被发现,该杂合子在5或更多的人类基因组单体型图或出路细胞系,从而满足我们的最低频率要求。使用PolyPhen [23),227年49 nsSNPs预测“可能损害”或“可能损害”蛋白质功能系统的基础上,由SNP序列和结构变化引起的。这49个nsSNPs, 22日在基因参与DSBR,进一步评估后使用筛选分类(24),我们选择5 nsSNPs进行详细的功能分析(表1和2)。

表1
基于在计算机预测选择nsSNPs和后果。
表2
小选择nsSNPs等位基因频率。
2.2。细胞系的选择

对于每个nsSNP,至少5 Epstein-Barr-Virus-transformed lymphoblastoid细胞系是购买从人类基因组单体型图或多态性发现资源集合的出路(柯瑞尔医学研究所(美国新泽西州卡姆登)。根据特定的SNP等位基因频率,细胞系是等位基因的纯合子的兴趣(WRN, LIG4)或杂合的等位基因是罕见的(PNKP BRCA1, ATM)。在一些情况下,纯合的细胞系的WRN或LIG4等位基因变体也为另一个nsSNPs杂合的(PNKP、BRCA1或自动取款机)。为了建立一个控制面板细胞系我们确定了所有人类基因组单体型图或常见的等位基因的纯合的出路细胞系5候选人多态的网站。从这些,我们选择6控制细胞系(2每个3民族在人类基因组单体型图)后申请额外的标准以减少在其他多态网站5基因序列变异的兴趣。

2.3。细胞培养和辐照条件

Lymphoblastoid细胞系生长在37岁°C在5%股份有限公司2和维护tri-weekly亚文化的rpmi - 1640中l谷氨酰胺(美国加州GIBCO,卡尔斯巴德),这是补充15%胎牛血清(双子座生物制品、西萨克拉门托,加利福尼亚州,美国),和1%的抗生素/抗真菌的(美国加州GIBCO,卡尔斯巴德)。辐照的前一天,细胞被播种 细胞/毫升T25烧瓶(BD猎鹰,富兰克林湖,新泽西,美国)。细胞暴露于1.5 Gy冰1毫升完整的媒体在不断旋转使用j·l·Sheperd模型431137年Cs的剂量率辐照器0.77 Gy /分钟。

2.4。γh2a。x免疫荧光

未曝光的控制和辐照细胞resuspended在温暖的,完整的媒体,暂时放置在37°C水浴,转移到37岁°C孵化器完成余下的1小时,3小时或24小时孵化。初步剂量和时间课程实验使用控制细胞系(GM12154)是由允许细胞坚持poly-D-lysine (BD,富兰克林湖,新泽西,美国)涂布封面滑落。然而,所有后续的实验中,利用poly-D-lysine-coated室幻灯片。细胞被允许坚持10分钟4°C,然后固定在刚做好的4%多聚甲醛(美国电子显微镜科学,哈特菲尔德,Pa)在室温下15分钟。在PBS细胞被洗一次,放置在甲醇−20°C 1分钟,permeabilized 0.5% Triton x - 100年(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)10分钟,封锁在3% BSA(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)30分钟,然后孵化与antiphospho组蛋白H2A 1小时。X (Ser139)克隆JBW301 (1:1000;北部、Billerica质量,美国)。在这一点上,细胞被洗了三次1分钟在1% BSA,孵化1小时Alexa 488山羊antimouse免疫球蛋白(1:5000;分子探针,加州卡尔斯巴德,美国),然后再清洗1分钟1% BSA的三倍。接下来,细胞被孵化与20 nM 4 5分钟′6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(美国表达载体,加州卡尔斯巴德),洗了三次与PBS 1分钟,然后永久安装使用Fluoromount-G(南方生物技术,伯明翰,阿拉巴马州,美国)。幻灯片是存储在黑暗中4°C直到显微镜分析。

2.5。图像采集和处理

细胞图像,在室温下使用蔡司Axioplan 2荧光显微镜配备JAI M1雇佣电荷耦合器件(CCD)相机,Metafer v3.2软件(MetaSystems、Altlussheim、德国),和一个40 x物镜。DAPI通道是用来识别DAPI染色细胞,检测488 Alexa染色紧随其后γH2A。X使用FITC频道焦点。九个重点飞机在0.75被抓获μ米间隔为每个使用FITC通道细胞。自动图像处理了两通道(图合成图像1通过使用制造商推荐的设置)。成像操作应用统一所有幻灯片和时间点。

(一)
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(b)
(b)
图1
(一)代表细胞辐照和1.5 Gy孵化1小时后曝光。左面板:未经调整,noncompressed形象在DAPI通道;中间面板:未经调整,noncompressed形象在FITC通道;右面板:调整,合成图像。合成图像进行了一系列的图像处理操作包括使用非线性算法和应用复染色面具。(b)的四个面板图中显示一个不同的,从每个时间点代表细胞依次从左到右:预曝光,1小时,3小时,24小时后1.5 Gyγ辐照。所有代表调整合成图像。

对于每个核捕获图像,我们收集了总DAPI强度值来量化DNA存在于细胞的数量。为了弥补DAPI强度衰减图像捕获的一门课程,我们调整了衰落后,薄满乐的方法等。25]。

2.6。的量化和测量γh2a。x焦点

大约200个细胞得分为每个时间点/治疗组合(条件)在一个实验中,每个条件复制在一个实验,每个实验被复制到一个单独的一天。焦点从抓取的图像识别应用20%后强度阈值减少的背景。自动测量的数量、强度和区域(μ米2)γH2A。X疫源地进行了使用Metafer v3.2系统(MetaSystems, Altlussheim,德国)。使用低强度阈值或添加区域限制焦点的大小没有实质上改变结果(数据未显示)。

2.7。细胞周期分析

细胞被固定用冷70%乙醇和放置在−20°C直到流分析。细胞与PBS洗一次,在室温下孵化30分钟特里同x - 100, 0.5% resuspended propidium碘溶液(5μg / mL propidium碘(美国表达载体,加州卡尔斯巴德)+ 10 u /毫升核糖核酸酶(美国威斯康星州麦迪逊Promega)),并在黑暗中孵化30分钟前处理使用正欲(BD) FACSort流式细胞分析仪和分析使用CellQuest (BD,富兰克林湖,新泽西,美国)和Modfit软件(真实软件、Topsham我,美国)。

2.8。统计分析

初步剂量效应和时间响应数据的数量γH2A。X疫源地分析如下:两个复制幻灯片的均值计算的两个实验,这两个的意思是意味着及其标准误被确定。评估剂量反应趋势,我们使用线性回归方法。

我们主要分析DSBR nsSNPs的影响,我们使用混合模型回归技术26]。我们测量的三个特征γH2A。X焦点(即数量、强度和大小)在每四个时间点(即预曝光、1 - 3 -,和24小时曝光后(T0表示,T1 T3、T24 resp))。对于每一个功能,我们使用这些测量获得三个时间点相比响应变量。每个响应变量是一个比率代表褶皱的变化响应之间的时间点:T1 / T0表明诱导损伤,T3 / T1表明短期修复/持久性、和T24 / T1表明长期的修复/持久性。这些响应变量评估每个细胞株在至少两个复制实验在不同的日子。虽然容量限制我们最多运行九个细胞系在任何单一的实验中,一般每组实验包含控制由两个或两个以上的细胞系和四个或五个nsSNPs表示为一个细胞系。我们建模方法涉及配件单独为每个反应变量多变量回归。为了更好地满足正态分布假设隐含在我们的统计分析,我们使用以2为底的对数这些比例变量的拟合模型。混合模型包括平均响应模型和模型的变化反应。平均响应的回归模型包括一个拦截和五个因素,即变量的副本的数量(小)等位基因的每个5 nsSNPs(控制细胞系零拷贝的变体)。 The regression coefficients in this model measure the change in mean response associated with an additional copy of the variant allele at the given locus. This regression approach allowed us to accommodate cell lines that carried variant alleles at more than one nsSNP as well as cell lines that were either hetero- or homozygous for the variant allele. It also allowed us to estimate the geometric mean response that a cell line homozygous for any of the variants under investigation would have. Our model for the variation in response accounted for several distinct sources of variation and the correlations that they induce: among different cell lines with the same genotype, among experiments, and among replicates of a given cell line within an experiment.

3所示。结果

3.1。时间和剂量反应为γ辐照后病灶的形成

在初步实验中使用一个控制细胞细胞系(GM12154)贴在涂布封面,我们发现一个线性剂量反应关系(R2= 0.99)的平均数量γH2A。X疫源地每个细胞暴露后0.5小时1.5 Gy的γ辐照,最高剂量产生三倍数量的疫源地每个细胞相比,未曝光的细胞(图2(a))。后续时间课程实验表明,射线诱发疫源地的数量达到最大值0.5小时后暴露于1.5 Gy,减少了~ 50%从这个最大的3个小时,并返回到预曝光水平(图24小时2(b))。允许细胞词缀镀膜室的幻灯片,而不是涂布封面滑倒导致温和但类似的减少意味着数量的焦点在暴露和未暴露的细胞和减少实验可变性,我们利用幻灯片有房间的所有后续实验。根据初步流式细胞仪数据,我们估计,约有60%的细胞G0 / G1,因此我们使用调整DAPI强度作为衡量的DNA内容排除40%的细胞G2 / M和s阶段分析(数据未显示)。

(一)
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(b)
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图2
初步的剂量和时间响应模式基于控制细胞系GM12154的平均数量γH2A。X射线辐照后焦点。两个独立的实验中,每一个包含两个复制(~ 200细胞),用于分析。(一)线性剂量反应γ辐照后0.5小时(R2= 0.99)。误差线代表±1 SEM对两个实验。(b)非线性时间响应1.5 Gyγ辐照。元,时间点代表预曝光细胞。误差线代表±1 SEM对两个实验。

我们比较组细胞系代表每个DNA修复基因多态性的细胞系作为控制(图3)。所有组的细胞系表现出类似的时间进程响应模式的平均数γH2A。X焦点之前和之后每个细胞暴露于γ辐照(图1.5 Gy3(a))。疫源地的平均数量增加四倍从暴露前1小时曝光后在所有的细胞系组。平均数量的疫源地仍超过两个细胞系在所有组升高3小时后曝光,但所有组回到near-baseline水平24小时。

(一)
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(b)
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(c)
(c)
图3
总结的基因——(nsSNP)特定的时间响应模式1.5 Gyγ辐照后三个不同的应对措施。时间点是NT /预曝光,1小时,3小时,辐照后24小时。误差线代表95%可信限。(一)意味着数量的焦点。(b)的意思是焦点。(c)意味着强度疫源地。

尽管所有的细胞系验货出现类似的感应和消失的γH2A。X焦点,我们统计的测试是否有5 nsSNPs不同于控制使用一个混合模型回归分析与变异等位基因的副本的数量在每个nsSNP预测。这种方法可以适应细胞系,这可能是杂合的或纯合子的轨迹或可能变异超过一个轨迹。我们考虑三个反应变量构造成焦点的数量的比率在不同的时间点:感应的焦点1小时相比,预曝光(T1 / T0),这种损伤的修复时间超过3小时课程(T3 / T1),和持久性的伤害相比,24小时预曝光水平(T24 / T0)。所有组的细胞系有类似的估计对这些比率,我们认为没有证据表明任何群细胞株不同于控制(表3)。

表3
对比焦点的数量在不同的时间点(T0,辐照前;分别T1, T3、T24, 1小时,3小时,24小时,辐照后)。

除了测量细胞内焦点的数量,我们也测量病灶的大小和强度,又集中比率反应类似于前面提到的。一小时后曝光,个别疫源地的平均尺寸预曝光水平相比增长超过75%在所有组的细胞系和仍然上升,几乎维持在3个小时后曝光(图2(b))。甚至24小时后曝光,当焦点的平均数量每个细胞回到预曝光水平附近的平均大小疫源地仍明显大于,在曝光前的细胞( 对所有组织, 为PNKP)。一小时曝光后,焦点意味着强度增加两倍以上预曝光水平,它只是略有下降,从水平1小时3小时(图3(c))。意味着强度仍然显著升高后24小时内的所有组细胞系除外自动取款机和PNKP多态性,尽管这两个强度升高,24小时。

4所示。讨论

最近的重测序的努力大大扩展目录可用的单核苷酸多态性研究。该目录是越来越多地用于集中流行病学研究的癌症易感基因和更广泛的全基因组关联研究。DNA修复基因是有吸引力的候选人因为罕见突变的研究这些基因与癌症风险,因为基因组不稳定性和变异是癌症进程的重要特性(1,2]。最突出的先天疾病的候选snp因果关系是那些导致产生的氨基酸的变化,特别是小子集,预计将改变功能的蛋白质域结构。相对较少的这些snp评估在流行病学研究中,部分原因是次要的等位基因频率通常低于5%,因此需要大样本量足够的统计能力。因为困难的执行功能的研究,在体外实验中评估使用更少。

在网上使用几个预测工具来评估nsSNPs DNA修复基因,我们选择5个snp“可能”或“可能损害”的氨基酸替换基因参与DSBR。自动取款机,BRCA1 LIG4,WRN众所周知的与癌症协会或遗传疾病,使人易患癌症2,27- - - - - -29日]。

具体错义突变LIG4相关LIG4综合症导致增加辐射敏感度(27]。LIG4在NHEJ途径中扮演着重要的角色在双边带网站重新加入DNA的两端。“可能损害”变体,T9I与多发性骨髓瘤的风险降低有关(30.),但不被评估功能的影响。

有缺陷的WRN结果在维尔纳综合症的特征是癌症和其他与年龄相关的疾病的风险增加28,29日]。WRN是RecQ DNA解旋酶家族的成员都3′到5′解旋酶和核酸外切酶活动期间,可能会限制核苷酸切除NHEJ [31日]。虽然WRNC1367R多态性预测“可能有害,”一个功能酶活性的研究发现影响不大(32]。

PNKP磷酸化5′羟基末端和脱去磷酸3′磷酸目的地(33]。虽然一般特征作为基础切除修复基因,它还参与磷酸替代在受损的界标NHEJ [34]。PNKP与XRCC4和损失的这种交互结果的速度较慢,DNA修复和增加辐射敏感度(35]。的PNKPY196N变体在PNK39蛋白质域,进而被认为在单链断裂的修复中发挥作用造成的外生代理,虽然这种变体的功能后果没有以前的特点。

乳腺癌易感基因1突变个体乳腺癌和卵巢癌的风险增加(27]。在回答一个双边带,乳腺癌易感基因1促进人力资源和抑制NHEJ [36]。的乳腺癌易感基因1Q356R,多态性是位于网站的交互Mre11 / Rad50 Nbs1 (MRN)复杂36]。这个复杂的传感和修复双边带是重要的(36),虽然两个流行病学研究乳腺癌易感基因1Q356R多态性未能找到一个与卵巢癌风险(7,37]。

失活的自动取款机结果在一个t与辐射敏感度和癌症的风险增加有关27]。自动取款机激活电离辐射和磷酸化的蛋白质参与DSBR和检查点控制,包括p53,乳腺癌易感基因1,NBS1,相关的,RAD9,MDM2,H2AX(21,38]。此外,自动取款机是核小体所必需的破坏和组蛋白损失现场的双边带可能是必要的适当的招聘修复蛋白质(39]。据我们所知,唯一的研究到目前为止自动取款机变体P1054R发现没有证据表明与辐射敏感度在乳腺癌患者40]。

感应和消除γH2A。X 1.5 Gy辐照后焦点是非常一致的控制和5细胞株面板中代表不同的DNA修复基因多态性。预曝光水平相比,所有的细胞系面板显示数量显著增加,强度和疫源地面积小时和3小时的时间点。的数量γH2A。X焦点被证明是最敏感的风险指数在1和3小时,显示更大的褶皱变化预曝光水平比强度或焦点。此外,的数量γH2A。X焦点显示1到3个小时之间的大而显著下降而意味着强度焦点显示这两个时间点之间只有微小的变化,意味着疫源地面积几乎保持不变。而焦点的数量在24小时内回到基线曝光后,强度和疫源地面积仍显著升高而预曝光水平控制和大多数SNP面板。

我们的研究是有限的两个细胞系的数量构成每个面板,并且在许多情况下该是如此罕见,我们只能研究杂合的人。我们不能排除这样一种可能性,即nsSNPs我们评估可能有细微的影响修复双边带之外的灵敏度分析和样本大小。此外,有可能替代DNA修复途径可以弥补功能,从而减少面具微妙的功能效果,或nsSNPs我们评估可能有其他功能的后果,例如在修复忠诚,我们没有评估。

全基因组关联研究正变得越来越流行,因为是使用表型更好地理解复杂疾病的病因。然而,这些大规模的中间表型的测量难题往往限制选择。测量γH2A。X焦点的形成是一个有用的工具来评估双边带的感应和修复。发展这种分析大规模使用可以通过使用与多个井室的幻灯片,显微镜幻灯片与自动喂食器和成像能力,通过减少与细胞培养相关的体力劳动。关注内在表型的能力,如DSBR基因关联研究可以帮助我们更好地理解的因素,使人易患癌症。

确认

作者要感谢卡尔Bortner博士,玛丽亚Sifre,唐娜Stefanick帮忙用流式细胞分析仪和优化流协议,价值Reyes-Reyes博士帮助讨论关于优化免疫荧光协议,和博士丹尼尔·肖内西的帮助启动该项目。他们还想感谢Chris Halweg博士和丹尼尔•肖尼西批判性回顾手稿。这项研究是由美国国立卫生研究院的校内研究项目,国家环境健康科学研究所。