文摘
大多数之前的宫颈鳞状细胞癌可见子宫颈的变化,最常被子宫颈涂片检查。随着宫颈癌之前长癌前阶段,识别高危人群的检测的DNA倍性可能是该疾病的有效管理的重要性。这里我们试图关联DNA非整倍体生物行为模式及其影响的流式细胞术DNA倍性分析在正常值进行诊断轻度(79)的情况下,适度(36)和严重发育不良(12),以及“意义不明的不典型鳞状细胞(子囊)”(57)和控制(69),以了解其在恶性疾病进展的重要性。正常值诊断发育不良,用于DNA倍性研究中,39温和,28温和,和11个严重发育不良病例被发现非整倍体。的69个对照组,6例显示非整倍性模式和其余63受试者二倍体。一个非整倍性模式在57例8个子囊细胞学上评估。随后的研究结果表明,异常DNA内容可靠地预测鳞状细胞癌的发生在子宫颈涂片检查。流仪分析DNA倍性可能会提供一个战略癌的早期发现宫颈癌的诊断工具。因此,它是一个概念的HPV筛查反射细胞学结合DNA流式细胞术检测渐进损伤最大的可能的敏感性和特异性。
1。介绍
宫颈癌是全球第二个女性最常见的恶性肿瘤。据估计,全球每年466000人被诊断为宫颈癌新发病例。根据估计每年有231000妇女死于宫颈癌,其中80%来自发展中国家(1]。利用细胞学筛查技术,子宫颈(Pap)测试,大大提高了检测宫颈癌(2]。癌症的子宫颈出现一系列定义肿瘤出现前的病变细胞发育异常,增加称为宫颈上皮内瘤(CIN)一级,II, III。然而,CIN病变经常回归,并不是所有第三CIN病变,发展为侵袭性癌症(3]。集团(CIN很异类,尤其是在他们的临床行为。持久high-risk-type人类乳头状瘤病毒(人类乳头瘤病毒)感染是宫颈癌的最强的独立危险因素(4]。CIN病变引起的感染人乳头状瘤病毒,这些病毒的基因组中发现绝大多数宫颈癌标本(5- - - - - -7]。过程中肿瘤起始HPV-infected宫颈上皮细胞,DNA非整倍体模式发展(8),连同其后代显示遗传不稳定。DNA非整倍性反映了情况不受控制的增加和损失的基本信息(9),在肿瘤中扮演一个重要的角色转换。增加DNA非整倍体值增加宫颈非典型增生的成绩一直被认为是一个特定的恶性肿瘤预后标记(10]。然而,目前,没有成熟的技术,,定性,预测了宫颈非典型增生的临床结果除了巴氏涂片筛查,是可用的。大约15 - 30%的妇女发展低度鳞状上皮内病变(LSIL)的概率发展严重宫颈上皮内瘤(CIN II和III)在随后发现宫颈活检(11]。预防宫颈恶性肿瘤及其前体,几个辅助诊断方法提出了加强细胞学和组织学诊断的准确性12]。染色体非整倍性已被用作肿瘤发生的早期关键事件引起的遗传不稳定性(13,14仪等效的),染色体非整倍性检测到DNA流式细胞术可能作为肿瘤的一个标志和提供有价值的信息对宫颈癌的诊断和发病机制的理解。由于DNA非整倍体的模式是一个有用的参数预测的进展和持久性的“意义不明的不典型鳞状细胞(子囊)”,低度鳞状上皮内病变(LSIL /轻度发育不良/ CIN I),和高档鳞状上皮内病变(HSIL /中度和重度发育不良/ CIN II和III)在临床实践中,本研究旨在调查是否改变在细胞/核内容预测癌症的发生在宫颈涂片检查。因此我们使用流式细胞仪DNA含量估算和比较它与细胞学结果。
2。材料和方法
2.1。主题和抽样
正在进行门诊的病例来自细胞学筛查百货妇产科,乔治国王的医科大学(印度勒克瑙)目前研究。正常值诊断127例发育不良(79温和,36温和,和12严重),57例”意义不明的不典型鳞状细胞(子囊)”和69名对照,共招收了2004 - 2006年期间,是从一个前瞻性跟踪研究理解招募的生物学行为和自然历史宫颈癌癌前病变。没有CIN患者以往的历史或治疗CIN。所有的控制女性正常的涂片。对象的年龄范围从30到75年。
一位经验丰富的妇科医生收集宫颈样品与艾耶尔的钝端抹刀。两个新鲜的刮刀是用于准备。根据巴氏涂片固定在酒精和染色方法。的钝端第二抹刀立即转移到低温管,包含3毫升冷冻PBS pH值(7.2)和速冻−20°C直到flow-cytometric分析进一步使用。随访通过细胞学以及DNA流仪分析。
2.2。细胞学分类标准
与传统巴氏细胞学筛查进行染色的细胞学者训练。所有幻灯片都根据标准进行评估的系统[贝塞斯达15]。子宫颈癌的癌前病变分为正常、子囊,LSIL(轻度发育不良/ CINⅰ级),和HSIL(中度发育不良/ CIN II级,严重发育不良/ CIN三级和原位癌/ CIS)。
2.3。癌前病变的标准管理
了解宫颈癌癌前病变的生物行为,以下标准执行。(我)情况下最初诊断为LSIL (CIN I)和HSIL (CIN II和III)被迫接受第二个子宫颈抹片检查测试后30天。(2)细胞学证实发育不良病例登记为跟踪病人的同意。(3)最初病例诊断为CIN三世受到阴道镜活检在30天导演,是妇科医生进行进一步管理。控制细胞学检查完成后每6和3个月LSIL HSIL科目,分别被归类为“恢复正常”(形态归一化后);进展(当面对更高年级的发育不良);和没有变化(仍在同一等级的发育异常时)。样品也进行DNA倍性检测模式。(iv)子囊和所有非整倍体病例对照组随访一年。
2.4。Flow-Cytometric DNA分析
确定细胞DNA含量、Nicoletti等人之后的协议16]。总之,细胞被固定在冷乙醇30分钟4°C的温度。添加碘化propidium之后(美国小姐Sigma-Aldrich)混合物是存储在黑暗的室温1小时。淋巴细胞是用于校准。最大允许变异系数(CV)校准是2%。总共有15000个细胞数在每个样本。DNA直方图细胞循环分析如因所述17),使用ModFit LT Mac版本软件排除碎片通过使用电子门。G0-G1事件的年代,和G2-M阶段细胞周期的统计。情况下被视为可接受的用于分析如果G0-G1峰值为7.0的简历。病变被归类为二倍体、四倍体或非整倍体。如果两个不同的G0-G1山峰在场的DNA指数≥1.15(总细胞群的每个包含≥10%),直方图被视为非整倍体(DNA)的内容。按照惯例,第一G0-G1峰代表了二倍体峰。二倍体和四倍体病变分为nonaneuploid。直方图模式被称为二倍体如果有一个G0-G1高峰。直方图被归类为四倍体只有一个大峰观察G2-M DNA指数(1.80 - -2.2),包含≥20%的曲线和总也伴随着相应的8 N峰值。
2.5。统计分析
EPI-INFO软件用于计算和奇怪的比例(卡方检验)值。一个P. 05或更少的价值被认为是统计学意义(95% CI)。
3所示。结果
宫颈涂片检查被分为四组(见图1)。第一组合格的正常和分组69例。第二组(57例)合格的子囊。LSIL组成的第三和第四组(79例)和HSIL(48例;36例中度异生和12例严重发育不良)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
比较DNA的内容分析与行为LSIL或HSIL正常值的病人在诊断各种等级的发育不良以及控制和子囊组(表1)。127例不同等级的DNA倍性发育不良是用于分析非整倍体的78(62.99%)例(39温和、28温和和11例严重发育不良)和剩余49(37.01%)例(40温和,8温和,1严重)nonaneuploid,二倍体(见图2)。在控制和子囊组,6(8.70%)和8例(14.04%)病例发现非整倍体,分别为(见图2)。协会的非整倍性随着等级的发育异常被发现是重要的(P≤措施;表1,见图3)。
(一)
(b)
(c)
所有这些病例与非整倍体DNA含量和细胞学上诊断子囊和各种等级的异生随访1年在提到的间隔,为了研究DNA非整倍体的行为疾病进展/回归/持久性。57子囊患者中,49(85.96%)二倍体例恢复正常细胞学涂片,剩下的8例(14.04%)非整倍体显示进展/回归的迹象。一位病人在一年后面对与LSIL HSIL和三段跟踪。剩下的四个非整倍体退化子囊组正常的情况下,从二倍体明显的DNA。6非整倍体的情况下与正常细胞学诊断,随后4例,只代表一个案例从正常的轻微发育不良疾病进展的一年之后。
共有79名患者LSIL诊断,75例随访。39非整倍体的情况下,7个发达国家中等发育不良(CIN II)和30例细胞学(CIN I)没有变化,经过一段时间的登记之日起6个月。所有病例显示DNA非整倍体的跟踪研究。35例曾LSIL nonaneuploid DNA恢复正常和一个病人出现在细胞学没有变化,也就是说,保持在CIN i这个特定主题的示例显示DNA非整倍体单元的内容在后续研究中,35例正常二倍体(表2)。
36例中度异生,只有30例可供后续研究和6例接受子宫切除术。20例25岁被诊断出患有中度发育不良(HSIL / CIN II)和DNA非整倍体仍CIN II(71.79%)和一个非整倍体的DNA在后续研究中三个月后注册。此外,与顺式2其他患者确诊后,要积极跟踪DNA非整倍体。1患者二倍体DNA仍处在CIN II细胞学的跟踪和其他4二倍体显示回归模式。的11只3非整倍体严重发育不良(CIN III)紧随其后,其他规定接受治疗。3例,非整倍体,1例发展为独联体和2保持在CIN三世。协会与疾病进展的非整倍性被发现显著(表2)。LSIL测试值(P≤措施)和HSIL (P≤措施)是重要的。
4所示。讨论
有证据表明,宫颈癌发展持久性的非整倍性的基础上10]。研究表明,非整倍体条件显示浸润性癌或宫颈发育不良(潜在肿瘤发展18,19和在肿瘤发展中起到关键作用的20.,21]。
基因异常,如数值染色体畸变(非整倍性和四倍体性),在女性诊断为已报告和颈癌癌前病变和经常观察到人类乳头瘤病毒感染的存在(10,22,23]。根据Melsheimer et al。22),解除病毒致癌基因表达似乎导致染色体不稳定和aneuploidization第一,随后紧接着集成影响HPV基因组的细胞克隆。CIN和侵入性宫颈癌DNA倍性评估流仪技术已经建立预后因子,允许风险估计的相对进步到更高级的病变(8,24- - - - - -27]。发育异常的上皮代表潜在的癌前条件发展为癌症的风险通常是未知的。一杯啤酒和Motherby28]表明,DNA非整倍性鉴定的发育异常的鳞状上皮细胞可以增加恶性病变的预测价值超过90%。同样,我们的研究结果也证实了非整倍性的预测价值92%的非整倍体的情况下在所有等级的发育异常疾病(表显示进步的模式2)。
证据显示异常的细胞DNA含量的原因而不是结果恶性转变(29日,30.]。杜斯伯格等人指出,非整倍体癌症通常被认为是更危险的和侵略性比二倍体(31日]。Boecking等人进行了前瞻性研究,以确定宫颈涂片的发展为恶性肿瘤与子囊(32]。基于“高预后DNA-aneuploidy的有效性”研究人员得出结论,“非整倍体病变组织学上或被删除”应立即被控制的。根据上述发现,本研究的结果也证明了进步的模式从子囊组非整倍性疾病病例。Bollmann等人建议子囊情况下,那些有高危HPV DNA含量异常高,代表类似的生物特性与风险升高HSIL开发癌症(33]。因此,DNA含量可能反映了基因组不稳定性的细胞早期恶性肿瘤过程中,在恶性肿瘤的位置形态变化或初癌尚未明显34]。可以想象,定义为nondysplastic病变,因此被认为代表最小或没有宫颈癌症的风险,可能含有容易检测到大规模基因组改变即DNA异倍体性可能是恶性的信号变换(34,35]。分子生物标志物的鉴定持续HPV感染妇女被诊断为正常/子囊子宫颈抹片检查可能是一个有价值的工具在正确地管理这种疾病。我们还发现6非整倍体病例对照组,其中,一年时间后,一个案例提出了疾病的进展。
在这项研究中,我们已经表明,DNA非整倍体内容可以作为生物标志物颈进步对恶性肿瘤的改变。逐步增加非整倍性增加病变的严重程度(49.36%为轻度发育不良,77.77%为中度异生和91.66%严重发育不良)。我们的跟踪结果清楚地表明,越来越多的先进的疾病模式指出非整倍体情况下,DNA倍性可以作为宫颈恶性肿瘤的预后指标。比较的结果与子宫颈筛查和DNA倍性测量提供DNA非整倍体之间的正相关和疾病进展(表2)。此外,非整倍体的百分比高情况下对疾病的进展跟踪数据支持非整倍性的预后价值作为标志来识别损伤的进步行为。患者样本中出现非整倍性的异常恢复正常的形态,而患者细胞学疾病进展的迹象被发现明显更大的频率(,;表2)。高档病变(根据贝塞斯达分类)通常可以使用细胞诊断检测方法准确性好,但偶尔诊断依赖于主观参数。此外,抽样不足可能会导致轻微的形态学改变,尽管早期的进步的行为(36]。因此,流式细胞仪DNA含量的测量提供了定性信息和细胞学异常的非整倍性细胞样品,这可能成为一个有用的参数以及细胞学具有良好的特异性和敏感性37,38]。如果病人之前可以确定风险分析的参数,反映了真正的生物学性质的病变,治疗方法可以有选择地给改进目前宫颈癌症存活率较差情况下(39]。流仪分析DNA倍性可能会提供一个早期发现癌宫颈[战略诊断工具8,25]。因此,我们提出的概念的HPV筛查反射细胞学结合DNA流式细胞术检测渐进损伤最大的可能的敏感性和特异性。
确认
作者感谢Ashwani库马尔(工业毒理学研究中心、勒克瑙、印度)对持续鼓励整个研究。作者也感谢Vinita Das和女儿乌米拉辛格(妇产科学系乔治王的医科大学,勒克瑙,印度)对研究产生浓厚兴趣。作者也希望承认Neeraj Mathur说(期)的统计分析数据。作者非常感谢印度医学研究理事会(新德里,印度)提供研究为准会员m . n .卡尔拉辛格和高级研究奖学金。