文摘
遗传和表观遗传变化描述人类nonsmall细胞性肺癌(NSCLC),但生物过程,创建或选择这些变化仍不完全调查。我们的假设认为约互惠关系倾向于启动子甲基化和基因缺失的倾向会导致不同的肺癌的分子表型。为了验证这个假设,我们检查了17个肿瘤抑制基因的启动子甲基化,表观遗传变化倾向的标志,和删除事件p21在3区,作为标记的基因改变。模型这些体细胞之间的复杂的生物学改变,我们利用一个项目反应理论模型。我们表明,肿瘤表现出超过30%的等位基因的LOH p21 3地区有显著降低甲基化的倾向。同时,肿瘤与激活喀斯特突变表现出显著增加倾向的甲基化位点检查,结果类似于结肠癌所观察到的。这些数据表明,非小细胞肺癌具有不同的表观遗传或遗传表型改变作用于肿瘤抑制基因和致癌增长促进基因的突变,如喀斯特与表观遗传表型相关。
1。介绍
肺癌是最事件之一癌症和癌症死亡的主要原因在美国男性和女性。在2006年,有162多000人死于肺癌在美国(1]。肺癌的主要原因是吸烟,尽管环境烟草烟雾、石棉和其他环境和工业暴露也有助于肺部致癌作用[2]。Nonsmall细胞性肺癌(NSCLC)来源于肺和支气管的上皮细胞的特点是各种各样的分子变化。其中包括在致癌基因(如激活突变cMYC,喀斯特,表皮生长因子受体,CCND1,和BCL2)和灭活病变肿瘤抑制基因(3,4]。肿瘤抑制基因的失活发生主要通过等位基因损失(包括单等位基因丢失和纯合子基因删除)或表观遗传沉默与启动子甲基化的CpG岛在这些基因的启动子5- - - - - -7]。
这些不同的遗传和表观遗传变化之间的关系保持相对未开发的,虽然现在知道有一个令人惊讶的是大量的基因改变明显在实体肿瘤(8]。一些团体报道,改变TP53,测量两个基因的突变或通过改变免疫组织化学染色,与大流行的LOH在不同位点(9- - - - - -11]。也有链接之间肺部致癌物质暴露和几个基因改变。例如,LOH的FHIT基因基因被发现经常在吸烟者和那些在职业暴露于石棉设置(12,13]。从我们的团队工作和其他人还建议,致癌物质暴露可能驱动类型的变化观察到特定的基因,如CDKN2A(编码P16INK4A分子),经常删除从未吸烟的人(14),但已经越来越流行的吸烟的增加持续时间(甲基化15,16]。同样的,变异的表皮生长因子受体在腺癌基因发生特别,通常在妇女和从不吸烟患者17- - - - - -20.]。这种类型的证据显示,不同的分子表型存在于非小细胞肺癌和曝光,生活方式,或这些因素的组合驱动这些表型。更好的数量和特征的定义这些表型可能是至关重要的关于病人疗程的临床决策,已经证明表皮生长因子受体突变情况下(21- - - - - -24]。因此,本研究旨在更好地定义在非小细胞肺癌分子表型,仔细检查这种疾病遗传和表观遗传改变之间的关系。
2。对象和方法
2.1。研究人群
符合条件的情况下由所有新诊断可切除的肺癌患者接受治疗在马萨诸塞州总医院胸外科,肿瘤学和肺服务从1992年11月到1996年12月25]。参与这些研究的病人提供书面知情同意在适当的机构审查委员会批准的协议。复发性疾病或nonoperable肿瘤患者被排除在外。260年一个随机子集分析体细胞损失p21 (LOH) 3。父研究的185名患者的一个子集新鲜肺癌肿瘤组织获得用于甲基化分析。肿瘤组织在液氮快速冻结,存储直到处理。人口统计学和流行病学数据,包括所有的烟草使用的数据,被面试官审查自行测试问卷收集完成的病人和审查由一个评论家对胸外科住院期间。
2.2。3 p21 Loh分析
分析等位基因丢失的3 p21地区微卫星标记D3S1029,D3S3582,D3S3667,D3S3640,D3S1568,D3S3026,D3S1478和统计分析的细节和施工的分数等位基因丢失(歧视)得分之前描述的人口(9,26]。
2.3。甲基化分析
DNA提取新鲜冷冻肿瘤组织使用Gentra Puregene DNA提取工具包(Gentra,明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国制造商的协议。亚硫酸氢钠改性合成的DNA进行如前所述[27]。简单地说,DNA变性在氢氧化钠和亚硫酸氢钠处理(σ化工有限公司,圣路易斯,小姐,美国)16小时。使用向导然后DNA纯化DNA清理工具(美国威斯康星州麦迪逊Promega,),治疗与氢氧化钠和乙醇沉淀。DNA是后续水化水用于PCR扩增。
我们有专门选择使用传统的甲基化特异性PCR (MSP) [27]分析这些研究启动子甲基化。之前我们有检查潜在的偏见的敏感性使用这个对相对定量测定Taqman-based方法(28),而没有看到潜在的偏见的证据基于肿瘤数量或肿瘤阶段样品分析。
亚硫酸氢钠修改DNA作为模板甲基化特异性PCR (MSP)如前所述在[27使用特定的引物甲基化的倡导者CDKN2A(27),RASSF1A基因(29日),APC(30.),PYCARD(31日),LAMC2(32),SFRP1,SFRP2,SFRP4,SFRP5(33),管理,DAPK,RARB,背景(34),CDH13(35),一种(36],CCND2 [37),而PRSS3(38]。优化所有甲基化特异性pcr检测超过5%甲基化衬底在每个样本。控制修改DNA的存在,引物特定于地区的修改ACTB基因不含CpG网站使用(39]。修改循环血液淋巴细胞DNA(从控制主题)获得和使用年代完全相同的淋巴细胞DNA甲基化党卫军我DNA甲基化酶和修改治疗与亚硫酸氢钠作为正面和负面的控制,分别在每个运行。
这些基因被选为启动子甲基化检测到使用这种方法已被证明是相关的转录沉默的基因,和他们发生在肿瘤特异性甲基化模式。我们也希望检查肿瘤抑制基因的沉默参与多种细胞过程和途径从而不限制分析基因在一个路径针对无所作为。已知的基因选择参与过程包括细胞周期控制(CDKN2A,RASSF1A基因,APC,和CCND2),细胞凋亡(DAPK,PYCARD),细胞外的交互(LAMC2,PRSS3)、转录调节(RARB),WNT信号(SFRP家庭),信息信号(背景,CDH13)和DNA修复(管理,一种)。
2.4。统计分析
我们之前已经证明没有谨慎的肿瘤组织的基因数量进行甲基化(5),我们发现,有一个很大的个人的甲基化位点之间的相关性,这样简单的计数个体肿瘤的甲基化位点数量统计上不合适。因此,我们采用项目反应理论(IRT)模型(40)已被证明是最合适的潜在特质技术(41)检查这种类型的离散数据(42)和甲基化倾向的建模可以被视为一个连续变量的回归框架。
构建我们的红外热成像模型中,我们使用一个逐步选择结合领域知识检查暴露在潜在的甲基化的影响变量。中包括年龄和性别与年龄相关的模型有报道称甲基化(43,44,有一个完善的膀胱癌的发病率不同性别。组织学(腺癌、鳞状细胞癌和其他人)最初是包括在模型中。我们检查了曝光的效果已被证明与肺癌发病率包括吸烟和职业接触石棉。吸烟是检查一个变量比较永远,前,和吸烟者以及使用措施的持续时间和强度。我们还研究了突变的影响喀斯特基因在这之前已经报道过了人口的肿瘤(25,45),这个途径的突变与methylator相关表型在结肠癌46]。作为一个标记的遗传改变,我们包括3 p21 LOH的歧视的分数。变量被排除在模型利用AIC确定最吝啬的模型。最终的模型包括性别、喀斯特突变,p21和3歧视(低高0.3和0.3)不除了17基因的启动子甲基化状态检查。
我们还研究了甲基化倾向之间的关系,再以甲基化潜在特质,和患者的生存。在第二阶段的分析中,我们使用甲基化潜在特质的预测和应用Cox比例风险模型检查的对数作为协变量的线性函数的死亡风险,包括甲基化潜在特质。所有分析都在2.4.1 [R版本进行47),为红外热成像模型,包括自定义软件可用。
3所示。结果
研究人口的人口统计数据如表所示1。正如预期的那样,大多数病人都是现任或前任吸烟者,平均年龄约为67年。大于50%的肿瘤是腺癌,鳞状细胞癌,约34%,其余的罕见的大细胞等组织学。如前所述,大约17%的病例有突变喀斯特在密码子1245),肺癌的热点,约34%有杂合性丢失(LOH)大于30%的等位基因3 p21地区(9]。
图1(a)介绍了流行的17个基因启动子甲基化研究的研究。这个变更出现高度可变的流行的基因检查,一些基因,如SFRP1和SFRP2发现hypermethylated近80%的情况下,而其他基因,如一种或APC本系列,很少表现出甲基化。有温和的相关性在单个位点甲基化,如图1(b),轻色调表示相关系数接近1。我们观察到,这种相对高甲基化事件之间的相关性,以及广泛的流行的这些变化在不同的基因,而不是把这些事件当作独立的分析,我们采用项目反应理论模型来调查这些肿瘤的甲基化倾向。这种方法考虑这种相关性和已被证明是适合类似的数据检测在膀胱癌42]。
(一)
(b)
项目反应模型的结果列在表中2,它提供了山坡上的系数值和拦截的每个基因检查在本系列。虽然拦截的值不能直接可判断的,他们为完整性提供了用于绘制潜在特质之间的关系和甲基化的概率。斜率,另一方面,表明潜在特质之间的关系的强度和甲基化的基因的概率。斜率值的范围方面,这些基因表明贡献不同的基因甲基化的建模的基本倾向。与整体患病率比较证明模型不仅仅是由流行,相对高发的基因,如RASSF1A基因甲基化在大约50%的情况下,事实上有一个无意义的和消极的项目反应,CCND2(编码Cyclin-D2),大约30%的甲基化的流行,有一个非常重要的斜率为1.3。
该模型还检查风险的影响,人口、肿瘤的特点,和其他分子改变底层的甲基化倾向。我们发现,只有喀斯特突变状态和分数等位基因的LOH损失分数3 p21明显与甲基化的倾向。性别在模型中一直是一个已知的糊涂喀斯特突变状态(25]。有突变喀斯特导致一个大约0.5单位增加在潜在特质意味着(潜在特质是按比例缩小的单位标准差)()。另一方面,有一个3 p21 LOH分数等位基因的损失0.3,这表明超过30%的信息位点检查在该地区LOH,与统计上显著相关减少0.5单元的甲基化潜在特质是指()。我们发现没有明显关联整体病人生存和甲基化在第二阶段分析潜在特质。
4所示。讨论
CpG岛的存在methylator表型(CIMP)已经被证明在许多肿瘤类型,大多数最终在结直肠,和胃肿瘤(44,48- - - - - -50]。在结肠癌,CIMP表型与基因突变有关BRAF基因,它也被认为这种表型,特别是通过其关联的甲基化一种基因,负责错配修复缺陷,因此观察到的微卫星不稳定性在结肠直肠癌的一个子集46]。突变的喀斯特基因也与结肠直肠癌CIMP [48,50]。我们最近的研究也表明,肿瘤的其他网站,包括肺癌、可能出现的潜在倾向的差异甲基化(5]。评估methylator肺癌是复杂表型的缺乏理解,应该评估,以确定哪些基因表型,像那些用于结肠癌可能不合适。因此,我们试图更彻底地研究哪些因素可能会推动这种倾向,如果有特定的分子表型现存在非小细胞肺癌。
我们先前证明,没有谨慎的分组的肿瘤基因的数量进行甲基化(5),发现了一些问题的存在methylator表型(51]。我们还展示了(图1(b)),有大量的单个位点的甲基化之间的相关性,这样简单的计数个体肿瘤的甲基化位点数量统计上不合适。因此,为了使用适当的统计方法以及避免偏见的分离肿瘤类任意数量的基础上,我们采用项目反应理论模型,该模型已被证明是最合适的潜在特质技术检查这种类型的离散数据(42)和甲基化的倾向可以被视为一个连续变量的回归框架。
使用这种方法,我们观察到的差异的贡献不同位点甲基化潜在特质的检查,观察将失去如果甲基化事件只是计算,因此被认为是相等的。这表明,一些基因,如SFRP2,SFRP5,CCND2,可能更多的信息(由于其重要的和更大的项目反应斜坡)比基因与无意义的或小项目反应的斜坡上,如RASSF1A基因或CDKN2A。这是感兴趣的CDKN2A(编码P16INK4A分子)通常被认为是CIMP在结肠直肠癌的一个标志49),但在非小细胞肺癌,这种基因的沉默似乎更少的信息预测总体甲基化倾向。CDKN2A也被证明是最早的基因识别成为hypermethylated在肺部致癌作用,检测可能在上皮细胞从吸烟者肺癌诊断之前52]。因此,这种基因的改变可能更重要的是在早期阶段致癌作用和可能是常见的肿瘤无论整体甲基化的倾向。
我们观察到肿瘤表现出更广泛的LOH p21在3区显示降低甲基化的倾向。这是特别有趣,因为通常认为LOH和甲基化可能发生一起因为2支安打需要灭活肿瘤抑制。此外,肿瘤抑制基因RASSF1A基因位于3 p21,包括面板的基因在我们的模型中,建议删除表型和甲基化表型相关甚至低于我们的报告在这里。我们的研究结果,从这次考试,我们之前考试的LOH 3 p21 [9),而我们的工作显示p16删除和甲基化是互惠的14),表明p21 3地区等位基因丢失,除了识别特定的网站NSCLC-specific肿瘤抑制基因,是一个更一般的标记基因的肿瘤抑制基因失活的倾向通过等位基因不平衡或损失。我们的数据表明,肿瘤倾向于这种类型的遗传改变不太可能接受表观遗传改变,反之亦然。也就是说,我们的结果表明,在非小细胞肺癌肿瘤抑制基因沉默产生通过优势等位基因丢失的事件或表观遗传沉默事件,发生在大约二分时尚。
我们的模型也证明了这一点喀斯特突变与更倾向于甲基化有关,类似的结果报道在结肠癌48,50]。图2提出了一种描述这种整体关系模型。背后的机制之间的联系喀斯特突变和增加甲基化倾向尚不清楚;事实上,建立关系也是如此BRAF突变和CIMP,尽管众所周知,这两种致癌基因操作在同一细胞信号通路(48,53]。我们的研究以及先前的研究不能完全辨别事件的发生,这些基因的突变或建立更大的启动子甲基化,但可以推测,致癌基因的激活喀斯特可能驱动细胞分裂,从而增加变更的启动子甲基化的可能性。同时,沉默在DNA损伤或修复相关基因的启动子甲基化的传播可能会允许这些致癌基因的突变。方法采用模型系统与致癌突变的增长促进基因可能有助于阐明这些事件的时间和帮助回答这个问题。
本研究的一个限制是使用一组选定的位点和有限的区域检查删除。因此,我们的结果可能暗示gene-specific选择事件,而不是更广泛的表型,我们提出了。更多的最终检查,这需要基因组层面方法申请考试的表观遗传和遗传特征在同一肿瘤,和新技术正变得可用,可以允许这种类型的检测临床标本。随着这些技术的发展,它将使用适当的和严格的统计方法至关重要,比如那些用在这里,来分析数据,以便了解生物学推动这些变化。然而,我们的研究结果提供了一个动力测试这些假设使用这些更全基因组的方法。
更广泛地说,这些结果表明存在的不同的分子途径散发性肿瘤的肿瘤抑制基因失活。肿瘤分类基于这些通路可能导致改善这些疾病的病因的理解,因为它可以提高总体分类的疾病基因关联研究。例如,人们可能会认为个人与多态性,也许,在DNA修复基因(特别是重组修复)导致修复能力下降,可能在肿瘤转基因子类的风险更高。这个改进的子分类还拥有巨大的临床效用,因为它可以帮助定义病人应对特定的化疗方案。在本系列中,我们没有观察到任何甲基化潜在特质之间的关系和整体病人生存,但我们不能检查特定的子组治疗的基础上,可以理解这种关系的关键。
确认
这项工作是由美国国立卫生研究院拨款ES05974 ES007373, CA100679和乘务员医学研究所青年临床科学家奖(c . j . Marsit)。