文摘
凋亡能力(AC)在初级淋巴细胞可能是癌症易感性标记,和功能单核苷酸多态性(snp)基因参与凋亡通路调节细胞交流应对DNA损伤。进一步研究凋亡基因型和表型之间的相关性,我们snp基因分型14发表在11 apoptosis-related基因(即,p53、bcl - 2、BAX、CASP9 DR4、Fas, FasL, CASP8, CASP10 CASP3,CASP7),并评估了AC苯并[a] pyrene-7, 8 - 9, 10-diol环氧(BPDE)从172年癌症学科主要培养的淋巴细胞。我们发现,其中14个snp, R72P,内含子3 16-bp del / ins,基因内区6 G >−938 c >bcl - 2,I522LCASP10在single-locus BPDE-induced淋巴细胞交流的重要预测因子分析。在综合分析的三个变异,我们发现diplotypes携带的个人0 - 1常见的副本R-del-G单体型与其他基因型相比有更高的AC值。尽管该研究规模可能没有统计能力检测其他snp在交流的作用,我们的研究表明,一些内在的凋亡通路中的基因的snp可能调节淋巴细胞交流,以应对BPDE暴露在普通人群中。需要更大规模的研究来验证这些发现为进一步研究个体对癌症和其他apoptosis-related疾病的易感性。
1。介绍
细胞凋亡,也被称为程序性细胞死亡,是一个生物过程,调节生理细胞死亡和扮演重要的角色在多种人类疾病的发病机制,包括癌症(1]。抗细胞凋亡或减少细胞凋亡能力(AC)提供了一种生存优势的可能发展成癌细胞的细胞,在几乎所有类型的恶性疾病,常见和突变基因参与凋亡通路是致癌的分子机制之一(2,3和癌症治疗3,4]。
[一]苯并[a]芘(B P)是一个典型的能损伤dna含有致癌物质环境烟草烟雾和燃料燃烧的结果(5]。bioactivated形式,苯并[a]芘二醇环氧化物(BPDE),可能会导致不可逆转的损害DNA通过共价结合或氧化形成DNA加合物6,7]。如果这些加合物未修理的,细胞将通过激活凋亡p53, caspase-9 (CASP9)和caspase-3 (CASP3)[8,9]。作为细胞DNA损伤反应的关键调节器,转录因子编码的p53肿瘤抑制基因已经明显涉及B[一]P-induced凋亡和p53蛋白表达水平与B的水平[一]P-DNA加合物(8,10]。尽管细节引发细胞凋亡的信号通路在淋巴细胞仍不完全清楚,可能的机制包括转录激活的bcl - 2家族成员11)和转录upregulation死亡受体(DRs) [12,13]。这些复杂的蛋白质参与激活一个连续信号,调节两个主要的凋亡通路(4]。一个是内在或线粒体通路,p53-Bcl-2通路的刺激导致的激活CASP9和线粒体细胞色素c的释放14]。,称为extrinsicor胞质通路,包括一组蛋白质如DRs,膜结合Fas配体,Fas复合物,Fas-associated死域,caspase-8 (CASP8)和caspase-10 (CASP10)[15,16]。激活这两个途径启动一个常见的下游蛋白水解级联,包括CASP3和caspase-7 (CASP7) [4]。
这些凋亡通路的效率很可能是由基因决定的。因此,我们假设功能多态性基因参与这些凋亡通路可能调节交流表型,从而导致个体变异来响应DNA损伤。为了验证这个假设,我们选择14潜在功能在11个基因多态性,也就是说,p53,bcl - 2,伯灵顿,和CASP9参与的内在途径;DR4,Fas,FasL,CASP8,CASP10参与了外在途径;和CASP3和CASP7,有效的casp。我们为这些14多态性基因分型和评估体外AC与终端原位dUTP-biotin缺口末端标记(TUNEL)测定使用BPDE-treated初级淋巴细胞从172例癌症来评估他们的凋亡基因型之间的联系和交流表型。
2。材料和方法
2.1。研究人群
对象在当前的研究中对照组的分子流行病学研究肺癌之前描述的17]。简单地说,172年在本研究的受试者从池中随机选择的癌症控制受试者招募Kelsey-Seybold诊所,一个大型multispecialty医生组织在休斯顿市区和几个诊所。每个主题都将接受采访后书面知情同意。面试后,大约20毫升的静脉血液样本收集从每个主题。批准的研究协议是德克萨斯大学安德森癌症中心和Kelsey-Seybold基金会制度审查委员会。
2.2。SNP的选择
我们使用了国家生物技术信息中心(NCBI) dbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov),国家环境卫生科学研究所(NIEHS)环境基因组计划SNP数据库(http://egp.gs.washington.edu/directory.html和http://www.genome.utah.edu/genesnps/)和文献检索识别潜在的功能变体基因的内在和外在的凋亡通路。多态性与未成年人等位基因频率(加)≥0.05包括,如果他们理论上可能导致氨基酸的变化(产生的SNP, nsSNP),位于启动子等调节地区,据报道或与已知表型的影响。三个报告p53SNP选择,包括著名的密码子72个SNP (R72P G > C)和两个intronic变体(16 bp-del / ins在基因内区6基因内区3和G-to-A过渡中被发现,因为他们的单体型功能(18]。两个之前报道调节snp在bcl - 2家族成员的推动者,bcl - 2(938 c >)伯灵顿(248 g > A)19,20.),也包括在内。为casp,我们发现一个nsSNP从每个CASP8(D302H G > C),CASP10(I522L > T) (21),而CASP7(D255E C > G,http://www.ncbi.nlm.nih.gov),其中一个CASP9nsSNPs在紧密连锁不平衡(LD) (Q221R G >,http://egp.gs.washington.edu/directory.html和[22]。因为没有发现nsSNP编码区域CASP3,我们选择了一个常见的变体在其启动子区域:−1337 c > G (http://www.genome.utah.edu/genesnps/)。死亡受体基因,nsSNP之一DR4和三个子单核苷酸多态性Fas和FasL选择:T209R (C > G)在吗DR4-1377 G > A和-670 G >Fas,和-844 t > CFasL(23- - - - - -26]。
2.3。基因分型
基因分型方法用来区分14选在11 apoptosis-related基因多态性在桌子上1。多态性的基因分型方法七以前描述:p53R72P [27]),p53内含子3 16-bpdel / ins和基因内区6 G > (18),DR4T209R [28),Fas-1377 > -670 G > A和G (29日),而FasL-844 t > C [30.]。剩下的七个多态性(例如,bcl - 2 C >,伯灵顿 248 g > A,CASP9Q221R,CASP8D302H,CASP10I522L,CASP3-1337 c > G,CASP7D255E)发现通过使用primer-introduced限制分析(PIRA)聚合酶连锁反应(PCR)测定(31日),总结在表1。基因分型进行了没有知识的受试者的表型;超过10%的样本随机选择确认,结果是100%的整合。七自行设计的基因分析、PCR产品包含每个目标基因型纯化和序列经直接测序。
2.4。细胞凋亡检测
细胞凋亡的表现型(即。,一个poptotic capacity [AC]) was detected with the TUNEL assay previously described [32]。简单地说,两个平行的短期文化从每个血液样本在37孵化°C没有有限公司267小时前BPDE治疗。在孵化的结束,两个平行的文化之一就是对待BPDE(98%的纯;中西部研究所,堪萨斯城,密苏里州,美国)的最终浓度4m .额外5小时的潜伏期后,所有的细胞都是由离心颗粒状的,resuspended与裂解缓冲(人类红细胞溶解设备,研发系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国),固定为1小时,用磷酸盐盐水冲洗,最后保存在乙醇在-20年的70%°直到用TUNEL分析C。
TUNEL分析,我们使用了APO-BRDU工具包(凤凰流系统,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)并遵循制造商的建议的协议。的比例不同的凋亡细胞百分比BPDE-treated和未经处理的文化主题凋亡细胞的比例在未经处理的文化记录交流(AC % = [- - - - - -)/]100)(32]。
2.5。统计分析
DNA的基因的质量或数量不足2主题;因此,最终的分析包括170人。不同基因型之间的不断交流测量/ diplotypes凋亡基因的利用学生的评价t -测试。趋势检验是由使用一般线性回归模型和调整年龄和性别。我们一分为二的连续表型的测量使用中位数(150%)作为截断值获得几乎等于低交流群(84例)和high-AC组(86例)。逻辑回归分析被用来估计遇比率(ORs)和95%置信区间(CIs)之间的遗传变异和一分为二AC表型与调整年龄和性别。等位基因/单体型与低AC表型个体被称为“高危”等位基因多态性分析以下。我们使用阶段2.0程序(33)来推断单体型频率根据观察到的每个基因的基因型。Diplotype是最可能的单体型为每个单独的一对。潜在的基因基因相互作用是通过逻辑回归分析评估和测试通过比较异常的变化(2日志可能性)模型之间的主要影响有或没有的交互项。所有的统计分析与统计分析系统软件(v.9.1.3;SAS研究所,Inc .,卡里,数控、美国)。
3所示。结果
平均年龄(±SD、年)的170名研究对象(119男性和51岁女性),我们使用的截止值60岁一分为二促进年龄组之间的比较。无统计差异被发现在连续子组之间的交流测量根据年龄和性别(数据没有显示)。表2显示了连续的交流测量选择凋亡基因的基因型。观察到的基因型频率都与预期一致的哈迪温伯格平衡(数据未显示)。内在的凋亡通路中的基因的单核苷酸多态性,该变体p53内含子3 16-bpins / ins,p53基因内区6 AA,bcl - 2−AC 938 aa都明显高于相应的野生型比如(与为p53内含子3 16-bpdel / ins,P= .027;与为p53基因内区6 G >,P= .021,与为bcl - 2 938 c >,P= .046)。然而,重要的P值较高的交流越来越多的趋势只观察等位基因的变体p53R72P(.016)和bcl - 2−938 c >(.037)作为评估的一般线性回归模型对年龄和性别(表调整2)。相比之下,只有该变体CASP10I522L所有在外在凋亡通路中的基因单核苷酸多态性显著降低交流()比二世纯合子(,P= .046)以及较低的交流的一个重要趋势,越来越多的变异等位基因(P= .046)。
连锁不平衡(LD)分析表明,这三个基因座p53在LD (= 0.14,= 0.64 R72P和内含子3 16-bpdel / ins;= 0.24,= 0.85 R72P和基因内区6 G >;和= 0.60,= 0.79为内含子3 16-bpdel / ins和基因内区6 G >)。因此,我们进行单体型/ diplotype推理使用阶段2.0程序基于观察到的基因型。总的来说,三种常见hapolotypes派生(表3)。diplotype承载的零拷贝p53R-del-G单体型和diplotype携带的两个副本p53P-ins-A单体型都明显高于AC(称为“保护”以下)的制约和影响,R-del-G单体型剂量反应的方式(P趋势:.016;表3)。
4所示。讨论
在genotype-phenotype分析,我们研究了潜在的功能变体选择的角色在AC表现型BPDE诱导的凋亡基因治疗在初级淋巴细胞。我们发现R72P,内含子3 16-bpdel / ins,基因内区6 G >p53-938 c >bcl - 2,和I522LCASP10可能的AC预测指标,但的影响p53变量也可以调制通过其下游基因参与的内在途径。我们所知,这是第一个基因genotype-phenotype相关分析与初级淋巴细胞的凋亡通路在人口水平。
因为有组织特异性致癌物质暴露,这将是理想的比较BPDE-induced不同组织之间的交流测量的同一个人。然而,很少有研究报道解决这个组织特异性,我们的研究也有这样一个机会。据报道,B[一]P-induced小鼠Hepa1c1c7细胞的凋亡是通过CASP-9激活与p53积累和激活(8],bcl - 2的表达与伯灵顿比下降过程的另一个特点是(8,34]。虽然来自不同的细胞类型,这些发现符合我们目前的观察,遗传变异的内在凋亡通路中的基因可能发挥重要作用的预测AC表型。进化的bcl - 2家族是一组守恒的支持和抗凋亡蛋白的调节中发挥关键作用的mitochondrial-mediated(内在)凋亡通路35]。bcl - 2抑制凋亡通过heterodimerization proapoptotic bcl - 2家族的成员,如伯灵顿,还通过形成渠道,稳定线粒体膜(36]。bcl - 2表达也被牵连在癌症的发病机制37,38,伯灵顿比bcl - 2的表达似乎是重要的在确定在体外和体内对化疗药物(39]。最近,变异的等位基因bcl - 2−938 c >被发现与降低患前列腺癌的风险在白种人在病例对照研究中,可能由于消除Sp1的结合位点,bcl - 2 mRNA转录水平的差别一个对这些基因,不受监管的程序性细胞死亡(40),这是符合我们发现在当前的研究中(变异等位基因携带者与high-AC表型有关,可以帮助消除可能的恶性细胞)。
我们的研究结果上p53多态性不符合公布的数据。例如,72 r野生型等位基因被发现增加诱导细胞凋亡的能力,以应对辐射或细胞毒性药物(18,41,42]。然而,其他的数据表明,72 p的等位基因有更强的转录效应响应DNA损伤,导致增强凋亡表型(43]。这些以前的研究主要是基于分析与细胞系(18,41)和遭受有限的样本大小(18,41,42]。最重要的是,没有先前的研究考虑了其他共存的内在通路中的基因多态性,可能扮演重要的角色在B[一]P-induced凋亡[8]。显然在目前研究主要正常的淋巴细胞,我们发现所有等位基因的三个小变体p53与更高的AC表型多态性有关,总体对交流的影响表型的影响CASP9Q221R多态性,但多态性之间的交互p53和CASP9只有边缘明显由于有限的研究力量。然而,我们的研究发现内在的淋巴细胞的凋亡途径可能与其他类型的组织,因为这种诱导细胞凋亡的淋巴细胞可能是可继承的(44]。因此这些结果,虽然初步,需要更大规模的研究证实。
之前发现的CASP10I522L多态性从一个大乳腺癌研究表明,变异LL基因型与边缘相关癌症的风险显著增加1.30倍结合体与野生型相比二世(21),这是符合结合体的概念会有助于减少AC。然而,外在途径的作用(或只CASP10)B[一]P-induced凋亡没有明显的在目前的研究中,需要进一步评估。
总之,本原理genotype-phenotype相关性的研究提供证据表明,潜在功能的核心基因多态性的凋亡途径可能参与调节凋亡反应暴露于致癌物,至少在主要淋巴细胞,虽然有组织特异性针对接触致癌物质。这样的修改主机carcinogen-induced AC在初级淋巴细胞可能导致癌症的个体易感性的差异。尽管这项研究可能由于小样本大小是有限的,多个测试,重复和缺乏交流测量为同一个人,结果,如果验证设计更严格和更大规模的研究,应该促进未来的研究的设计旨在识别亚种群在癌症和其他apoptosis-related疾病的风险。
确认
作者要感谢玛格丽特肺、凯瑟琳·帕特森,和Leanel相当协助招募受试者;生刘罗Wang,刘亚伟(音译,Yawei乔技术援助;克里斯蒂娜r . Dahlstrom总裁,他和许Kejin实验室协助;莫妮卡Domingue手稿准备;和克里斯汀·f·Wogan科学编辑。这项研究是由美国国立卫生研究院的资助支持部分。R01 ES11740 CA100264问:w和nos。e CA16672和U01 ES11047德克萨斯大学安德森癌症中心。