胰岛素样生长因子通过激活Mitophagy我可以防止细胞老化

文摘

线粒体功能障碍是细胞老化的一个特点。Mitophagy线粒体质量控制是一个关键机制,消除了线粒体功能失调,导致细胞的生存。胰岛素样生长因子1 (igf - 1)促进平滑肌细胞(smc)的生存,但其潜在的对细胞老化的影响是未知的。我们发现igf - 1细胞衰老,减少预防DNA端粒缩短,线粒体膜电位增加,激活细胞色素C氧化酶,并降低线粒体DNA损伤长期培养主动脉SMC(岁),提出一种抗衰老的效果。igf - 1增加mitophagy老化细胞,这是与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p16的表达下降有关,p21和高浓度的Nrf2 Sirt3,监管者mitophagy和线粒体生物起源。SiRNA-induced抑制Nrf2或Sirt3阻塞IGF-1-induced upregulation mitophagy,表明所需的Nrf2 / Sirt3通路对mitophagy igf - 1的影响。PINK1 mitophagy主监管机构。PINK1沉默抑制mitophagy和抑制IGF-1-induced延缓衰老的影响在SMC岁符合mitophagy的重要作用igf - 1对细胞老化的影响。因此,igf - 1抑制细胞老化通过Nrf2 / Sirt3-dependent mitophagy激活。我们的数据表明,igf - 1的激活信号是一种新型的潜在策略来激活mitophagy和减缓细胞老化。

1。介绍

细胞老化是一个复杂的生物过程,包括细胞增殖的不可逆转的逮捕(细胞衰老)和线粒体功能障碍的发展(1,2]。Aging-induced改变在细胞水平上是主要驱动力导致组织整个机体的衰老和衰老(3]。线粒体在监管扮演重要角色的生物能学和代谢反应。Aging-induced线粒体损伤的血管平滑肌细胞(SMC)抑制SMC收缩性,有助于增加动脉硬化和aging-associated血管疾病的进展4]。克服损失线粒体功能,SMC,以及其他细胞,依靠刺激线粒体生物起源和激活mitophagy,严格监管机制清除线粒体功能失调。然而,线粒体生物起源的效率和mitophagy会随着年龄的增长而减少,导致线粒体功能失调的渐进积累并最终失去SMC功能和细胞死亡(5]。因此,激活mitophagy衰老细胞可以作为一个潜在的治疗方法减缓细胞老化,改善与年龄有关的疾病(5]。

胰岛素样生长因子1 (igf - 1)是一种内分泌和自分泌/旁分泌生长因子表达的几乎所有细胞包括血管SMC和主要影响细胞生长,分化和迁移6]。一些报告显示,igf - 1保护线粒体功能在体外和在活的有机体内(7- - - - - -9]。因此,癌症细胞生存能力依赖于igf - 1刺激线粒体生物起源和mitophagy [10]。在无脊椎动物(线虫和体内研究黑腹果蝇)表明,抑制胰岛素/ igf - 1信号通路增加长寿(11]。有相互矛盾的报道影响igf - 1受体的杂合性小鼠寿命(12,13),而且,结果是矛盾的人类14]。igf - 1在细胞老化的潜在影响是未知的。考虑IGF-1-induced线粒体生物起源的恢复,我们假设igf - 1可能减弱smc细胞老化。我们发现igf - 1恢复线粒体膜电位(MMP)和细胞色素C氧化酶活性通过核呼吸因子2 (Nrf2) / sirtuin-3 (Sirt3)轴在长期培养SMC,这线粒体保护与激活mitophagy有关。我们的报告显示的igf - 1治疗潜力刺激mitophagy,从而减缓细胞老化。

2。材料和方法

2.1。细胞

smc与平滑肌22分离小鼠αpromoter-driven igf - 1受体缺陷小鼠(IGF-1R-KO SMC)和控制(SMC)监狱[15]。老鼠aortae清洗外膜的脂肪组织,开了,碎成小块。的碎片aortae被放置在培养皿中DMEM / F12媒体(写明ATCC)和补充10%的边后卫,4更易/ Ll谷氨酰胺,100 U /毫升青霉素,100μ克/毫升链霉素。主动脉smc迁移和切碎的主动脉的发展使胰蛋白酶化和通道T75细胞培养瓶血压得到较好的控制。对SMC标记细胞身份证实了染色:calponin和平滑肌α肌动蛋白(αSMA)。超过90%的细胞双阳性calponin和αSMA (15]。

调查潜在的igf - 1对细胞老化的影响,我们进行了实验与培养短期(通过5个常任理事国)和长期(P20通道20日)SMC。P5和P20 smc在完整细胞培养媒体补充10%的边后卫,l谷氨酰胺和抗生素。因为完整的细胞培养基包含igf - 1,我们使用血清媒体的短期(12小时)和长期(24 - 72小时)与igf - 1细胞治疗。这些实验,细胞在DMEM培养补充与100 U /毫升青霉素、igf - 1管理12,24,72小时。

2.2。苷酶染色和活动

smc被播种密度的10⁴细胞/ 6-well细胞培养板。β牛乳糖(β加)染色进行使用衰老检测设备(微孔)根据制造商的指示。总之,smc固定在4%多聚甲醛和孵化染色混合在37°C。β-Gal-positive细胞被强烈的蓝色在细胞核中,他们计算手动一式三份图片。一般从三个图片是用来计算的百分比β-Gal-positive细胞。β使用一个哺乳动物牛乳糖活动检测β牛乳糖检测设备(热科学)根据制造商的指示。总之,50μL细胞被提取到一个微型板块,β牛乳糖检测试剂(50μL)被添加到好,混合孵化在37°C为30分钟,在405 nm和吸光度是阅读Cytation 5标(Bio-Tek)。

2.3。自噬和Mitophagy化验

自噬是量化使用一个自噬检测设备(Abcam)根据制造商的指示。配套措施自噬在活细胞中液泡使用染料的光谱特性类似于FITC选择性自噬空泡标签。自噬小体的数量是由一个手动计数量化FITC-positive点在5查看字段(每个字段包含10 - 15细胞)与手机号/场(DAPI)。平均每个细胞自噬小体数量数据所示。Mitophagy检测设备(Dojindo分子技术,日本)16)是用来量化mitophagy根据制造商的指示。简而言之,这个工具包由Mtphagy染料(试剂检测mitophagy)和Lyso染料(试剂检测溶酶体),当mitophagy诱导,受损的线粒体融合溶酶体和Mtphagy染料发出荧光。染料混合物细胞孵化和成像徕卡TCS SP8议员倒光谱共焦显微镜(Mtphagy染料,例:488海里/ Em: 650;Lyso染料,例:488 / Em: 594海里)。

2.4。免疫印迹分析

等量的原油细胞溶解产物或纯化的线粒体分数(20μg)是由sds - page分离和转移到PVDF膜(微孔)。的主要抗体LC3B(猫# L7543)β肌动蛋白(猫# A3854)来自σ和TOMM20(猫# ab56783), P16 (CDKN2A / p16INK4a分子,猫# ab54210), P21(猫# ab188224)和PINK1 Abcam(猫# ab23707)。Nrf2抗体来自罗福斯生物制剂(猫# nbp1 - 32822)。Sirt3抗体(猫# # 5490)是细胞信号。免疫印迹与ChemiDoc进行成像和微凝胶文档使用凝胶成像软件系统(Bio-Rad)。检测蛋白表达在线粒体,线粒体分数被隔离使用线粒体隔离设备(热费希尔)根据制造商的指示。TOMM20被用作线粒体标记。

2.5。核转染

转染使用GeneMute执行smc的siRNA试剂(SignGene实验室)根据制造商的指示。整除的10⁴细胞被镀上6-well板块在转染的前一天,融合增长到70%。然后,细胞转染和10μM PINK1 siRNA, Nrf2 siRNA, Sirt3核,或控制(炒)核(圣克鲁斯生物技术公司)+ 100μL GeneMute试剂6 h。48小时的潜伏期后,蛋白质含量测定,免疫印迹。

2.6。线粒体DNA损伤

线粒体DNA (mtDNA)损失量化使用鼠标rt - pcr线粒体DNA损伤分析工具包(底特律研发)根据制造商的指示。工具包量化损坏8.8 kb mtDNA测量序列的复制DNA QPCR后实时PCR分析。25μ12.5 l PCR扩增反应混合物中μl 2 xsybr预混料聚合、1.0μ每个引物(10 lμ0.25米),μ50 l xrox II参考染料,9.25μl (ddH₂啊,和1.0μl的DNA。实时PCR条件初始变性20年代在95°C,紧随其后的是35周期在95°C的变性3 s和退火/扩展30年代的58°C。postamplification融化曲线分析确认是否生成非特异性扩增。所有样品包括标准在复制放大。生成的标准曲线绘制标准Ct值与标准浓度,mtDNA水平样本从标准曲线计算。的R²对于每一个标准曲线是≥0.99。在每次运行,正面和负面的控制和标准曲线都包括在内。

2.7。线粒体膜电位(MMP)测定

MMP使用TMRE量化在活细胞线粒体膜电位测定工具包(Abcam)根据制造商的指示。总之,细胞被播种在96孔板(15×10³细胞/),与荧光染料染色四甲基罗丹明酯(TMRE) 30分钟,立即和荧光信号测量的标(激发/发射:549/575 nm)。

2.8。线粒体DNA拷贝数(mtDNA)

线粒体DNA拷贝数是决定使用鼠标线粒体DNA拷贝数检测设备(底特律研发)根据制造商的指示。总之,5 ng的参考和基因组DNA样本准备和与引物混合解决方案,QPCR掌握混合,ddH₂O 20μl体积。PCR条件如下:20年代95°C,变性;52°C 20年代,退火;72°C 45 s,扩展。之间的区别(∆∆Cq)∆Cq (mtDNA)和∆Cq(单一副本参考)计算。mtDNA拷贝数的目标样本计算参考样品mtDNA拷贝数×2∆∆Cq。

2.9。细胞色素C氧化酶试验

细胞色素C氧化酶活性测定细胞色素C氧化酶试验设备(Millipore-Sigma)按照制造商的指示。

2.10。统计数据

所有数值型数据表示为±SEM。统计分析与GraphPad Prism 7.0执行。除非另有规定,单向的非参数方差分析进行了测试以确定统计学意义。所有实验至少重复3次。差异被认为是重要的 。

3所示。结果

3.1。igf - 1逆转衰老表型的长期培养主动脉SMC

长期栽培的主要细胞促进细胞老化的多个特性,包括诱导细胞衰老和线粒体功能障碍。因此,长期培养的细胞老化的主要细胞被认为是一个模型(17]。调查潜在的igf - 1对细胞老化的影响,我们进行了实验与培养短期(通过5个常任理事国)和长期(P20通道20日)主动脉SMC隔离控制老鼠(Con SMC)和与igf - 1受体的小鼠缺乏(IGF-1R-KO SMC)。我们量化细胞衰老,线粒体功能障碍和DNA端粒长度的指数控制SMC P20和P5。senescence-associated的活动β牛乳糖(SA -β加)是调节相比,P20 P5细胞(图2.2倍1(一))。符合这些结果,我们发现明显更多的P20细胞阳性β加与P5细胞(P20: 38±4%, P5: 15±3%, SA -β加+细胞)(Suppl.Figure1)。

Senescence-associated线粒体功能障碍是细胞老化的标志(1),特点是减少氧化磷酸化,降低线粒体膜电位(MMP),并增加了线粒体DNA (mtDNA)损害18]。P20 SMC有2.5倍减少细胞色素C氧化酶的活性和降低MMP的3.2倍,表明线粒体功能异常(图1)。P20细胞显著减少放大8.8 k mtDNA序列相比P5细胞(图1 (d)),说明升高mtDNA损伤。端粒的保护帽在DNA链的末端。在体细胞端粒的长度随年龄和可能预测寿命(19]。P20 SMC显著减少了端粒长度与P5细胞(图1 (e))。

igf - 1治疗12小时诱导SA -没有显著的变化β加活动和β加在P5细胞染色。然而,igf - 1剂量依赖性(做ng / ml)减少了SA -β加活动和β加P20 Con细胞染色,这些影响中,并未观察到缺少igf - 1受体的P20们注入了smc(图1(一)和Suppl.Figure1通过一个igf - 1)表明降低igf - 1细胞衰老receptor-dependent机制。短期治疗与igf - 1剂量依赖性增加细胞色素C氧化酶活性和MMP的水平,防止P20 mtDNA损害细胞。我们使用最低有效剂量的igf - 1(即。整个研究,10 ng / ml)。igf - 1 (10 ng / ml)阻止端粒长度的减少在P20 SMC(图1 (e))。P5和P20 smc治疗与igf - 1 (10 ng / ml) 24 - 72小时(Suppl.Figure测试长期igf - 1的影响2)。长期治疗与igf - 1诱导SA -没有变化β加活动和在P5细胞端粒长度。然而,igf - 1显著降低SA -β加活动,预防减少P20细胞端粒长度在24和72小时的治疗(Suppl.Figure2)。总的来说,这些结果表明,igf - 1逆转细胞衰老表型。

3.2。igf - 1增加自噬和Mitophagy SMC

自噬是一种散装降解通路,移交冗余或受损的细胞器和蛋白质总量(20.],mitophagy通过自噬(线粒体功能失调的具体删除5]。减少自噬和mitophagy时代被广泛报道在多种系统(5,21,22),这表明自噬upregulation可能抵消老龄化。我们假设igf - 1的能力减少细胞老化是由增强的自噬。血清中含有重要的igf - 1水平(23),因此,我们培养细胞有/没有igf - 1在serum-starved媒体。由于血清饥饿是一个强大的自噬/ mitophagy诱导物(24,25),igf - 1的影响进行了测试与基底细胞自噬增强。这种方法增加自噬检测的灵敏度与“岁”实验细胞自噬/ mitophagy水平较低。

Microtubule-associated轻链蛋白3 (LC3)是一种行之有效的标记用于监控自噬通过测量转换LC3我更快的迁移形式LC3 II以后称为LC3 II /我比或LC3B转换26]。igf - 1 12小时治疗剂量依赖性增加LC3 II /我在年龄P20细胞比率,表明igf - 1调节自噬(图2)。量化本构P20细胞自噬小体,我们使用的染料选择性自噬空泡标签。igf - 1 (10 ng / ml)显著增加的数量自噬空泡(自噬小体)细胞(图2(a))。Bafilomycin A1 (Baf)是V-ATPase抑制剂,可以抑制autophagosome-lysosome融合和停止自噬小体营业额造成LC3 II积累(27]。Baf唤起在SMC和细胞自噬的有力upregulation cotreatment与igf - 1(12小时),和Baf诱导自噬小体额外增加(图2)。治疗与igf - 1 72小时也显著增加LC3 II /我在P20细胞比率,cotreatment LC3转换(Suppl.Figure Baf-induced额外的高度3)。Baf块自噬流量通过防止自噬小体消化。因此,观察到自噬空泡和LC3 II Baf-treated细胞是由于预防液泡消化的溶酶体。这些结果表明,igf - 1调节自噬空泡的数量通过刺激自噬小体的形成,而不是通过抑制自噬小体的退化。治疗Baf也增加了LC3 II /我比,和igf - 1诱导进一步增加Baf(图的存在2(c)和Suppl.Figure3)。这些数据表明,igf - 1促进自噬在P20细胞可能通过上调自噬小体的形成。

igf - 1增加了线粒体生物起源在癌症细胞系(10]。探讨igf - 1的影响在血管SMC线粒体丰富,我们量化线粒体质量和P20细胞(Suppl.Figure线粒体DNA的拷贝数4)。我们发现igf - 1增加线粒体质量和mtDNA P20 SMC的副本。mitophagy量化的潜在影响igf - 1,我们活细胞染色染料(Mtphagy染料)时受损的线粒体与溶酶体融合成了荧光(16]。染料信号相比大幅减少在P20 P5细胞(图3(b)),这表明抑制mitophagy与衰老表型有关收购P20细胞。igf - 1(12小时10 ng / ml)显著增加Mtphagy染料P20细胞信号:事实上,染料荧光IGF-1-treated P20细胞类似于未经处理的P5细胞中发现的。长期P20细胞暴露于igf - 1 (10 ng / ml 72小时)也显著增加(Suppl.Figure Mtphagy染料信号5)。我们评估igf - 1对LC3B转换的影响在P20细胞的线粒体分数LC3 II /我的量化比例。线粒体LC3B转换增加了igf - 1,我们观察到一个额外的增加LC3B转换时细胞cotreated igf - 1和Baf(图3(c))。

3.3。igf - 1表达下调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p16和p21

通过G的过渡₁阶段和进入细胞周期的s阶段需要激活的细胞周期蛋白/细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)复杂,由CDK抑制剂抑制激酶活性的,包括p16和p21 [28]。Upregulation p16和p21的主要机制逮捕细胞增殖和诱导细胞衰老29日]。p16和p21水平升高被发现在人类皮肤岁(30.)和衰老动物模型(31日),据报道数在体外衰老模型(32]。同样,年龄P20 SMC p21水平调节p16和P5相比细胞与细胞老化(图一致4)。P20 Con细胞治疗与igf - 1 CDK抑制剂水平降低:事实上,p16和P20表达水平IGF-1-treated P20细胞没有不同于参与P5细胞(图4)。igf - 1并没有改变在IGF-1R-KO SMC p16和p21水平,表明IGF-1-induced减少CDK抑制剂是通过igf - 1受体介导的信号通路介导的。

3.4。通过Nrf2 / igf - 1调节Mitophagy Sirt3途径

线粒体内稳态是由平衡mitophagy-dependent清除受损的线粒体和一代的线粒体功能通过刺激线粒体生物起源。核呼吸因子2 (Nrf2)和sirtuins蛋白参与协调mitophagy以及线粒体生物转化。Nrf2是一种转录因子,控制细胞周期进展以及线粒体生物起源(33]。重要的是,合成1,4-diphenyl-1 2 3-triazole化合物,最初设计为Nrf2活化剂,发现促进mitophagy [34]。Sirtuin-3 (Sirt3)是线粒体脱乙酰酶和线粒体生物起源和mitophagy[监管机构35与(老化),Sirt3表达下降36]。

我们假设igf - 1增加Nrf2和/或Sirt3水平,这种机制介导的igf - 1的抗衰老的效果。igf - 1剂量依赖性增加Nrf2和Sirt3 P20蛋白表达的细胞(图5(a))。展示参与IGF-1-induced Nrf2 / Sirt3轴的影响,表达Nrf2或Sirt3被使用特定核表达下调。Nrf2-specific siRNA降低Nrf2 59±7%蛋白质和小干扰rna表达下调Sirt3-specific Sirt3 77±10% ( 控制相比,炒核、Suppl.Figure6)。igf - 1的数量增加mitophagic液泡和线粒体LC3 II /我比例控制siRNA-transfected细胞(数字5(b)和5(c))。然而,增加IGF-1-induced mitophagic液泡和线粒体LC3 II /我比完全阻塞通过Nrf2或小干扰rna, Sirt3证明功能Nrf2 / Sirt3轴mitophagy IGF-1-induced需要激活。

3.5。抑制Mitophagy阻塞IGF-1-Induced抗衰老的效果

mitophagy期间,PTEN-induced假定的激酶1 (PINK1)表面积累线粒体功能失调的促进去除有毒线粒体的产品(37]。防止colocalization差别PINK1对这些线粒体和溶酶体,这表明抑制mitophagosome形成(38],siRNA-induced PINK1击倒也显著降低了LC3 II /我在心肌细胞比率[39]。总的来说,这些结果表明,PINK1沉默抑制mitophagy。我们执行PINK1沉默与PINK1-specific核(控制:炒siRNA)抑制mitophagy P20细胞。PINK1 siRNA P20 SMC PINK1蛋白质含量减少了控制(Suppl.Figure > 60%6)。PINK1沉默降低mitophagy 57±7%和60±6%控制的被量化评估mitophagic液泡和线粒体LC3 II /我比的测量,分别(图6)。igf - 1在控制细胞激活mitophagy;然而,这种效应被PINK1沉默(图完全废除6)。测试是否激活mitophagy介导IGF-1-induced抗衰老的效果,我们量化细胞衰老,线粒体功能障碍的指标(细胞色素C氧化酶活性,MMP和mtDNA损伤),和DNA端粒长度与PINK1沉默P20细胞。igf - 1显著降低SA -β加活动,增加MMP活性细胞色素C氧化酶,并增加P20细胞端粒DNA转染与控制核,和所有这些影响都完全被PINK1沉默(图7)表明IGF-1-induced取决于激活mitophagy抗衰老的效果。

4所示。讨论

在这里,我们报告,igf - 1逆转衰老表型的长期培养主动脉SMC。igf - 1细胞衰老,减少细胞色素C氧化酶活性升高,增加MMP的线粒体DNA损伤,减少和抑制DNA端粒的缩短。这些影响与调节自噬和mitophagy,减少CDK抑制剂p16的表达和p21, Nrf2和Sirt3调节水平。SiRNA-induced抑制Nrf2或Sirt3完全阻塞引起的激活mitophagy igf - 1表达,表明Nrf2 / Sirt3通路激活mitophagy所需。我们利用PINK1沉默阻止mitophagy激活衰老细胞。我们发现PINK1沉默废除IGF-1-induced激活mitophagy, igf - 1是无法逆转衰老与沉默PINK1老化细胞的表型。因此,我们的数据表明,igf - 1诱导一种抗衰老的效果通过激活mitophagy Nrf2 / Sirt3-dependent机制。重要的是,我们发现,与年龄相关的变化可以至少部分逆转细胞水平相对短期igf - 1治疗。我们的研究表明一个治疗的潜力igf - 1刺激mitophagy和减缓细胞老化。

在当前的报告中,我们探讨了使用长期培养的主要细胞,细胞老化的一个模型。SMC主要文化是一种混合物快速分裂的前兆,大部分分化SMC,以及分组人口passage-dependent衰老细胞。因此,igf - 1的主要细胞反应取决于通道数量和具体贡献每个细胞亚群的检测参数。这是一个固有的限制,当观察比较低和高的段落和使用原代细胞培养的限制。我们试图描述特定的P5和P20评估细胞成分的SA -的数量β加+细胞,观察细胞与活化mitophagy P5和P20文化与igf - 1。P20细胞含有大量的SA -β加+细胞与P5文化和igf - 1 SA -减少β(Suppl.Figure -Gal-positivity P20的细胞1)。大部分的P5细胞mitophagy活跃和P20文化几乎没有。重要的是,igf - 1明显增加mitophagy活跃的细胞在P20 SMC(图3)。我们的假设是,igf - 1诱导补充通过mitophagy-mediated P20细胞间隙的线粒体和抑制细胞衰老。这个假说是一致的文献数据表明prosurvival和促有丝分裂的igf - 1的影响6,40,41]。

细胞衰老是一种驱动力量组织老化(即、血管老化)和衰老整个有机体的3),只使用在体外模型允许测试特定角色复杂的细胞通路(如细胞衰老、自噬和线粒体功能)在衰老。此外,可用性的转基因小鼠证明使用小鼠初级细胞识别特定分子靶点连接细胞老化和组织整个机体的衰老和衰老。我们表明,小鼠P20 SMC收购了几个细胞老化的特征包括诱导细胞衰老,线粒体功能障碍,端粒缩短与细胞老化的数据报告对其他模型一致(17]。据我们所知,这是第一个建立一个报告在体外衰老与血管SMC模型。功能失调的smc血管老化的标志和aging-induced疾病如动脉粥样硬化和主动脉动脉瘤。因此,长期培养SMC可能有助于研究衰老和aging-associated疾病。

细胞衰老和线粒体功能障碍都是细胞老化的特征(1),和两个独立确定为重要的老化(司机42]。超表达p21 CDK抑制剂p16或诱导细胞衰老的43),高架p16和p21水平与年龄增长有关的(30.- - - - - -32),表明p21 p16和参与细胞senescence-induced衰老表型的发展。我们报告,igf - 1表达下调p16和p21水平,减少细胞衰老,逆转衰老表型收购P20细胞。这些结果符合CDK抑制剂的重要作用senescence-induced老化的发展。Nrf2水平下降的肝脏特异性击倒的igf - 1在小鼠主动脉内皮功能障碍与恶化有关,增加氧化应激和细胞凋亡,模仿血管衰老表型(44]。这份报告表明,igf - 1的激活信号可能上调Nrf2表达和诱导抗衰老的效果。激活Nrf2了促进mitophagy和支持在肝细胞线粒体的完整性(45),表明在mitophagy Nrf2激活的潜在作用。我们的小说发现igf - 1调节Nrf2和激活mitophagy血管smc岁,Nrf2击倒阻塞mitophagy激活引起的igf - 1,建立Nrf2作为一种重要的机械的igf - 1和mitophagy之间的联系。

Sirt3脱乙酰酶诱导mitophagy报道在癌症细胞(46),参与预防aging-associated变性造血干细胞(36]。虽然运动被证明能改善体内降低igf - 1和Sirt3老龄大鼠神经元细胞在久坐不动的47),igf - 1的潜在作用的监管,Sirt3表达式是未知的。在当前的报告中,我们发现igf - 1调节血管SMC, Sirt3 Sirt3水平的关键中介IGF-1-induced mitophagy激活。总的来说,我们的研究表明,igf - 1在SMC提拔一个抗衰老的效果通过两个主要机制:抑制细胞衰老的差别可能由对这些基因p16和p21和Nrf2 / Sirt3-dependent激活mitophagy(图8)。我们的数据表明,mitophagy激活是主要的机制导致igf - 1的抗衰老的效果,因为我们的演示特定抑制mitophagy (PINK1沉默)足以完全阻止igf - 1对细胞老化的影响。

未修理的DNA损伤促进细胞和血管老化(48),和特定的线粒体DNA损伤目前看主要机制调节衰老(49]。我们发现igf - 1抑制SMC岁mtDNA损伤。这些结果结合文献报告表明,igf - 1′影响mtDNA可能有助于延缓衰老的效果,为未来的调查显示未来的方向。

衰老和动脉粥样硬化基础生化途径相似,血管功能障碍和衰老是动脉粥样硬化的独立危险因素4]。据报道,诱导细胞衰老或中断血管SMC促进动脉粥样硬化和诱导的自噬信号功能斑块易损性的小鼠模型(50,51]。我们和其他人40,41,52)报道,igf - 1对antiatherosclerotic效应介导的小鼠(至少部分),igf - 1 receptor-dependent SMC信号(15]。目前报告的结果表明,igf - 1的能力减少血管SMC细胞衰老和激活自噬可能是一个新颖的机制(s)可能导致antiatherosclerotic igf - 1的影响。有趣的是,igf - 1在细胞老化的有益作用相反的报道,抑制igf - 1信号在无脊椎动物寿命增加11)和igf - 1受体在小鼠的寿命(杂合性的报告12,13]。

总之,igf - 1逆转衰老表型获得长期培养主动脉SMC。的IGF-1-induced延缓衰老的效果与CDK抑制剂p16和p21的表达减少,调节水平的Nrf2 Sirt3和mitophagy激活。IGF-1-induced激活mitophagy Nrf2 / Sirt3依赖。PINK1沉默抑制mitophagy和完全阻塞IGF-1-induced抗衰老的效果,表明igf - 1的抗衰老的效果依赖于mitophagy激活。我们的数据建立一个小说igf - 1的作用在促进自噬和mitophagy SMC。igf - 1的激活信号可以上调mitophagy新策略,从而减少细胞衰老,减缓细胞老化。

缩写

igf - 1:	胰岛素样生长因子I
SMC:	平滑肌细胞
MMP的:	线粒体膜电位
Nrf2:	核呼吸因子2
Sirt3:	Sirtuin-3线粒体NAD-dependent脱乙酰酶
核:	小干扰RNA
mtDNA:	线粒体DNA。

数据可用性

数据和材料相关工作可按照客户要求定制。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作得到了国家卫生研究院(NIH)国家心、肺、血液研究所(批准号。7 r01hl070241(下)和R21HL113705 1 r01hl142796 (s)),和美国心脏协会(补助金13 grnt17230069 (s))。作者感谢亚历山大Jurkevich博士和分子细胞学核心密苏里大学的帮助和共焦显微镜成像。

补充材料

补充材料包括6个动作与传说。增刊。图1显示了β加积极与igf - 1 P5和P20细胞治疗。它支持图1主要得出的结论。增刊。图2表明,长期治疗与igf - 1 senescence-associated活动减少β牛乳糖和逆转减少DNA端粒长度。这些数据是通过细胞igf - 1治疗24和72小时,他们补充结果生成短期暴露igf - 1(12小时)(主图1所示),5。图3显示了SMC治疗igf - 1在P20 SMC(72小时)调节自噬。这些数据补充数据短期治疗(12小时)如图2所示。增刊。图4显示了量化线粒体质量和线粒体DNA的拷贝数P20细胞igf - 1和得出结论,igf - 1增加线粒体质量和mtDNA P20 SMC的副本。增刊。图5显示72小时SMC治疗与igf - 1调节mitophagy一致结果如图3所示。增刊。图6证实成功Nrf2、Sirt3和使用molecule-specific siRNA PINK1沉默。(补充材料)

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