文摘

特拉肠杆菌科(CRE)感染对公众健康构成威胁,KPC和NDM是主要关注的"。快速诊断测试是非常可取的医疗点(POC)和紧急实验室有限的资源。这里,我们开发了一种多路复用侧流试验基于不对称PCR和条形码捕获探针的同时检测KPC-2和ndm - 1。生物素化的条形码捕获探针对应KPC-2和ndm - 1基因设计并投到上两种不同的硝化纤维膜传感区域与链霉亲和素反应后准备一个多路复用横向流地带。Streptavidin-coated金纳米粒子(SA-AuNPs)被用作信号记者。针对目标"基因,biotin-labelled ssDNA图书馆是由不对称PCR、债券通过生物素SA-AuNPs和杂交的条形码捕获探针通过互补序列,从而缩小SA-AuNPs和条形码捕获探针在检测区形成可见的红线。信号强度是成正比的数量抗性基因测试。带传感器显示检测极限KPC-2 0.03点和0.07点ndm - 1基因,分别可以准确区分KPC-2 CRE菌株和ndm - 1的基因。临床分离株的基因分型,我们带表现出良好的一致性和实时荧光定量PCR和基因测序。由于其简单、成本效益和快速分析通过肉眼,多路复用地带承诺KPC-2和ndm - 1的辅助诊断工具生产商在常规临床实验室。

1。介绍

特拉引起的感染的数量肠杆菌科(CRE)菌株增加了近年来(1,2]。"主要是分为“漫步者”类一个,B,D(3,4]。在CRE物种,肺炎克雷伯菌" (KPC)和新Delhi-metallo -β内酰胺酶(NDM)构成重大威胁,是最流行的肺炎克雷伯菌和大肠杆菌分别在中国(5),导致惊人的感染率的增加在过去的一年(6]。传染病引起的CRE已成为迫切关心的医疗机构,因为他们是与死亡率和发病率高(7,8]。此外,易感细菌容易成为耐碳青霉烯通过之间的质粒的转移肠杆菌科(9,10]。因此,迫切需要快速诊断的CRE感染。

"检测,涉及表型筛查和基因型检测的主要方法用于CRE感染的临床诊断。表型测试包括Carba NP测试(11),碳青霉烯失活方法(12霍奇),修改测试(13),"抑制剂增强测试(14],色彩中筛选[15),和飞行质谱(16]。这些表型筛选方法具有良好的特异性和低成本,但往往遭受低敏感性和缓慢周转时间(17,18]。基因型测定主要包括荧光定量聚合酶链反应(19),酶免疫层析法技术(20.- - - - - -23),和基因组测序24]。基于抗体的检测试纸方法快速、操作简单,但需要昂贵的抗体。基因分型方法显著提高检测效率和精度高和敏感性25,26];然而,严格要求昂贵的仪器和实验条件限制他们在偏远地区的现场检测和应用程序。

最近,横向流测试(融通)技术应用于核酸快速检测(27- - - - - -29日]。由于其简单、快速周转、低成本、用户友好性,融通已经成为使用最广泛的快速检测(POCT)方法快速诊断系统(30.,31日]。值得注意的是,融通的进一步利用的同时检测多个分析物从一个样本,通常被称为多路检测,[引起了相当大的关注21,22,32]。多路复用测试减少样本数量,分析时间和成本。由于这些优势,融通被广泛用于检测药物滥用的33],核酸[34)、蛋白质(35)和细菌(36- - - - - -38]。

在这项研究中,我们提出一个多路复用分析使用一个不对称PCR技术检测KPC和NDM基因和barcode-capture probe-based侧流试验片。一种不对称pcr技术来获得充足的生物素化的单链DNA KPC和NDM (biotin-ssDNA)的产品。Biotin-ssDNA与streptavidin-coated金纳米粒子反应(SA-AuNPs)共轭垫形成AuNP-SA-biotin-ssDNA (AuNP-ssDNA)复杂。AuNP-ssDNA条形码捕获探针杂交时样品流经测试线;因此,AuNPs由于测试区域的带传感器产生一条红线。肉眼的视觉信号可以理解和量化GIC-H1便携式分析仪。输入的多路复用地带KPC-2和ndm - 1基因有很大的应用潜力在基础微生物学实验室。

2。材料和方法

2.1。材料和试剂

2.1.1。菌株

菌株获得的微生物实验室贵州省人民医院(贵阳,中国),表中列出S1。提供的菌株是五个主要的详细信息" (KPC - NDM -, VIM -,和IMP-type OXA-48)在图S1。

2.1.2。建设pUC57质粒

重组质粒KPC和NDM命名pUC57 / KPC和pUC57 / NDM(图S2),分别和DNA片段的序列如表所示S2补充材料。KPC-2和ndm - 1的基因测试,这两个质粒(pUC57 / kpc和pUC57 / ndm)是人工合成的,而不是孤立的细菌,包括部分KPC-2和ndm - 1序列(Tsingke生物技术有限公司,北京,中国)。合成的质粒并没有包含任何其他beta-lactamase基因。的浓度pUC57 / kpc和pUC57 / ndm首次由质粒NanoDrop分光光度法。

2.1.3。试剂

PCR大师混合试验装备和DL500 DNA标记从豆类购买生物有限公司(中国大连)。GoldView-I核酸染色、链霉亲和素、peg - 20000和氯化钠从Solarbio科技有限公司(中国,北京)。三-(羟甲基)氨基甲烷(三)HAuCl₄h·3₂O, Tween-20从Sangon购买生物技术有限公司(上海,中国)。MagIso DNA / RNA隔离设备是来自西安天龙科技有限公司(中国西安)。样品垫、共轭垫、吸水纸、PVC踢脚板得到从杰易生物科技有限公司(上海,中国)。UniSart CN 140硝化纤维膜获得微孔(美国Billerica的)。合成寡核苷酸从Tsingke获得生物技术有限公司(中国,北京)。

2.1.4。仪器

主要使用的仪器包括VITEK®2紧凑BioMerieux (Mariere、法国),从力量MALDI生物型公司(德国卡尔斯鲁厄),全自动核酸提取仪从天龙技术(中国西安),Biometra TAdvanced 96 sg PCR从德国耶拿分析仪器公司(德国耶拿),和HM3035 XYZ平台分发器从上海Kinbio科技有限公司(上海,中国)。使用GIC-H1便携式胶体金分析器(苏州Hemai精密仪器有限公司,苏州、中国)。

2.2。方法

2.2.1。引物设计

KPC (NC_016846.1)和NDM (CP091986.1)基因选择从基因库(https://www.ncbi.nlm)。多对引物设计使用底漆总理6.0(美国总理Biosoft,旧金山,CA)和低聚糖6软件(DBA益生元,Inc .,科罗拉多斯普林斯,有限公司,美国);正向和反向引物对KPC-2和ndm - 1详细的表S2。

2.2.2。菌种和DNA提取

菌株在哥伦比亚血琼脂平板培养和总DNA提取使用MagIso DNA / RNA隔离设备根据制造商的指示。提取被储存在−在使用前20°C。

2.2.3。建立不对称PCR系统

不对称PCR的菌株携带KPC-2和ndm - 1基因产生了相应的单链DNA biotin-labelled目标(biotin-ssDNA)。在标准PCR条件下,不同浓度的正向和反向引物。不对称PCR过程如下:95°C predenaturation 3分钟;40周期、变性、退火和延伸(95°C, 30年代;55°C, 30年代;和72°C, 20多岁);最后72°C和扩展为5分钟。PCR产品在120 V 2.0%琼脂凝胶电泳处理30分钟,染色,使用凝胶成像仪成像。获得最好的实验条件不对称PCR、退火温度梯度的优化从50到60°C。期待反向引物的浓度比例是1:10,1:20日1:40岁,1:60岁,1:80年,和1:100。 The number of asymmetric PCR cycles was 25, 30, 35, 40, 45, and 50. Finally, the reaction system (20 μ包含10 L体积)μL 2×PCR反应混合液(20毫米Tris-HCl 100毫米氯化钾3毫米MgCl₂,500年μ0.1 U / M核苷酸,聚合酶μL, ddH₂O)和2μL模板(质粒和菌株的DNA提取)稀释引物KPC-2和ndm - 1 (0.6μ米和1μL为每个基因),biotin-labelled反向引物KPC-2和ndm - 1 (20μM和0.6μL为每个基因),4.8μL ddH₂O。

2.2.4。金纳米粒子的制备和修改

制备中使用的玻璃器皿都彻底清洗在王水(三个部分盐酸和HNO一部分₃)、重蒸馏的水冲洗和烘干的之前使用。金纳米粒子(AuNPs)准备使用柠檬酸盐还原方法。简单地说,HAuCl 100毫升的0.01%₄重蒸馏的水里煮,与4毫升1%的柠檬酸三钠的混合搅拌。当色彩变成了酒红色,加热源被撤回,胶体溶液搅拌15分钟。利用TEM胶体金溶液被拍到。修改之前,AuNP溶液的pH值调整到8.0,0.1 mol / L的K₂有限公司₃。接下来,1毫升AuNP的解决方案是混合着20μL链霉亲和素溶液(0.1毫克/毫升)。混合物动摇了1 h,其次是增加0.1% BSA作为一个拦截器。混合物在室温下孵化了30分钟。解决方案是离心机删除非结合的链霉亲和素在10000 rpm 20分钟在4°C。颗粒重组在20毫升的适当的存储缓冲区(BSA PBS的1%,1%,0.25%蔗糖、1% Tween-20,和0.05%的南₃)。SA-AuNPs终于储存在4°C为进一步使用。AuNP和SA-AuNP解决方案的吸收光谱进行扫描λ300 - 750 nm紫外线分光光度计。

2.2.5。制备Streptavidin-Biotin-DNA探测器配合

捕获探针测试线路1和2 (T1,T2)设计固定AuNP配合相应KPC-2 ndm - 1,分别。三种类型的捕获探针(Cp)准备:streptavidin-biotinylated Cp1轭合物T1 (KPC-2), streptavidin-biotinylated Cp2轭合物T2 (ndm - 1), streptavidin-biotinylated Cp3配合控制线。链霉亲和素溶解在10毫米(磷酸盐(PBS), pH值7.4)最终浓度为0.1毫克/毫升。接下来,8μL链霉亲和素(0.1毫克/毫升)和1μL Cp (50μ8米)的比例:1是在室温下孵化1 h提供稳定的绑定。示例解决方案是过滤(30 kDa, Amicon超,默克密理博,伯灵顿,妈,美国)在6000 rpm将免费30分钟Cp,共轭streptavidin-biotin-Cp留在过滤器由于大型分子链霉亲和素的大小,从过滤膜和resuspended删除了。Streptavidin-biotinylated-Cp轭合物被分配到三个区域的硝化纤维膜准备两个测试线和控制线。

2.2.6款。KPC和NDM基因的检测

来自不同菌株的DNA提取,包含有或没有KPC和NDM基因,受到了不对称PCR系统。两种类型的质粒DNA包含KPC-2或ndm - 1基因,作为标准,进行了测试。ddH₂作为一个空白的控制。接下来,10μL不对称PCR扩增和90的产品μL 0.01 mol / L PBS稀释剂混合在一个埃普多夫管。最后,横向流地带被放置在15分钟的混合物。相应的强度测量使用GIC-H1便携式分析仪,扫描测试和控制线路和阅读反射光的强度。

2.2.7。"检测临床菌株

来验证我们的方法,我们使用23的临床分离株肠杆菌科评估KPC和NDM基因;这些菌株被KPC或NDM或正面或负面。我们使用我们的地带和测序方法,我们比较的方法之间的结果。meropenem磁盘phenylboronic酸(PBA)和EDTA也被用于检测双重"生产商(丝氨酸和金属-β内酰胺酶分别)[11,13]。

3所示。结果与讨论

3.1。原理的多路传感KPC和NDM基因

核酸侧流试验的工作原理如图1。在这项研究中,一个集成的多路复用分析基于不对称PCR技术和条码侧流试验是用来检测基因CRE菌株。首先,KPC-2和NDM - 1基因的引物设计参照基因库KPC和NDM基因数据。反应与streptavidin-coated AuNPs,反向引物KPC-2和ndm - 1的基因与生物素分子在他们量身定做结束。在放大目标特拉的不对称PCR基因,图书馆的不对称PCR (biotin-ssDNA)生产的产品。Biotin-ssDNA1生成的KPC-2, biotin-ssDNA2与ndm - 1的基因。同现的KPC-2 ndm - 1,不对称PCR产品包括biotin-ssDNA1和biotin-ssDNA2(图1(a))。三种类型的biotin-DNA条形码Cps设计:biotin-Cp1补充的部分序列biotin-ssDNA1 (KPC-2) biotin-Cp2补充的部分序列biotin-ssDNA2 (ndm - 1)的反向引物序列和biotin-Cp3互补KPC-2和ndm - 1。这些biotin-capture探针与链霉亲和素的反应形成streptavidin-biotin-Cp复杂(条形码1、2和3),这是分发到不同的区域的硝化纤维膜的捕获探针测试和控制线路;T1,T分别2对应KPC-2 ndm - 1。AuNP-SA轭合物被雇佣为记者和加载到共轭垫。视觉检测的样品反应的解决方案是使用strip-sensing执行系统由四个部分组成:一个样品垫、共轭垫,硝化纤维膜,吸收垫(图1(b))。KPC-2和/或ndm - 1的存在导致biotin-ssDNA产品的一代。一个示例解决方案包含biotin-ssDNA产品被应用于样品垫。迁移的解决方案是通过毛细管作用,通过共轭垫,水化AuNP-SA共轭。Biotin-ssDNA与AuNP-SA反应生成AuNP-SA-biotin-ssDNA复合物(AuNPs-SA-biotin-ssDNA),继续沿着地带迁移。因为ssDNA产品互补的条码固定测试线,上面的复合物被抓获在测试区ssDNA和条形码的杂交探针。的积累AuNPs在测试区1和2是红色波段的视觉特征。过剩biotin-labelled反向引物反应与AuNPs-SA轭合物形成AuNPs-SA-biotin-R引物,继续迁移,被抓获的控制区域与条形码3杂交,从而产生第三个红带(图1(c))。在缺乏KPC-2 ndm - 1,没有观察到红乐队在测试区由于ssDNA生产的失败。KPC-2 biotin-modified反向引物和ndm - 1基因是多余的,和一个红色的乐队总是形成的控制区域,确认带生物传感器的正常运转(图1(d))。图1(e)显示了试剂的解释和探针用于加沙地带和不对称PCR系统。KPC-2的积极成果,ndm - 1, KPC-2 ndm - 1,和无效的测试结果都是解释在图1(f)。

3.2。表征金纳米粒子的准备和修改

胶体金溶液由柠檬酸很明显减少红(图2(a))。金纳米粒子的分散直径30 - 50 nM,经透射电子显微镜(TEM图2(b))。一个典型的吸收峰λ520纳米胶体金溶液中可观察到使用紫外分光光度计(管一个和频谱一个,图2(c))。这些发现表明,胶体金是成功的准备。修改后,streptavidin-coated胶体金溶液保持红色(管c),相应的在520 nm保持不变(光谱吸收峰c)。在添加10%氯化钠胶体金溶液中,灰色的颜色从勃艮第(管b)。然而,添加氯化钠的色彩变化产生影响(管d),和吸光度的山峰λ使用紫外分光光度计520海里被检测到。这发生,因为外链霉亲和素阻止胶体金在高盐溶液聚合,暗示成功修改与链霉亲和素胶体金。

3.3。多路传输带的可行性传感KPC-2和ndm - 1

我们调查的可行性方法通过使用两种类型的质粒含有KPC-2 (pUC57 / kpc)和ndm - 1 (pUC57 / ndm)序列(100点)作为目标。KPC-2和ndm - 1基因的存在导致了两个红色测试线(图3),这表明biotin-ssDNA库成功连接AuNPs-SA到条形码KPC-2探针和ndm - 1。KPC-2或ndm - 1的存在导致了一个红色的测试线在测试区。这些结果表明,只有一个类型的biotin-ssDNA生成响应KPC-2或ndm - 1,这蹩脚AuNPs-SA测试线。只有控制线出现在缺乏KPC-2和ndm - 1。因此,建立准确、快速检测方法有一个健壮的能力"基因型。

3.4。不对称PCR反应体系的优化

3.4.1。优化的不对称PCR退火温度

退火温度是一个重要的实验参数不对称PCR分析性能的影响。最大的生产目标biotin-ssDNA和最小的生产的副产品在55°C实现KPC-2基因晚上10点(图4(一))。同时,测试线KPC-2(585.33,数据显示最高的信号4 (c)和4 (d))。ndm - 1基因在10点,biotin-ssDNA产品ndm - 1的数量在55°C略高于其他温度(图4 (b))。biotin-ssDNA产品地带,一个相对更强的信号435.33获得55°C(数字4 (c)和4 (d))。因此,55°C被选为最佳退火温度放大KPC-2和ndm - 1。

3.4.2。优化的比反向引物

期待比反向引物(F / R比值)biotin-ssDNA生产的一个重要因素。准备的目标biotin-ssDNA,有限的正向引物将被耗尽,多余的反向引物将放大dsDNA不对称PCR的早期阶段产生大量ssDNA扩增子。晚上10点的目标基因KPC-2 ndm - 1,我们观察到一个小差异凝胶电泳带的不对称PCR在不同引物比率(数字5(一个)和5 (b))。然而,信号图5 (c)在染色出现不同,相应的信号强度图5 (d)说明1:20F/R比优化基于KPC-2的高信号强度和ndm - 1(分别为544.67和515.33)。因此,一个F/R20比1:被选为后续分析。

3.4.3。优化的周期数

在不对称PCR循环影响biotin-ssDNA的生产数量是一个重要的因素,因此需要优化。与循环数的增加,生产的biotin-ssDNA KPC-2(10点)增加,倾向于峰值(图35周期6(一))。加沙地带后达到最高强度(533.33)35周期(数字6 (c)和6 (d))。DNA琼脂糖凝胶电泳的乐队表明biotin-ssDNA ndm - 1(10点)增加产品周期的数量从25到40增加和减少之后(图6 (b))。地带,ndm - 1的最大信号(505.33)发生在40周期(数字6 (c)和6 (d)),这是与琼脂糖凝胶电泳分析一致。考虑不对称PCR系统的兼容性KPC-2 ndm - 1,最好的实验条件选择40周期。

3.5。敏感性分析

调查带传感器的敏感性,建立标准曲线KPC-2和ndm - 1的浓度pUC57 / kpc和pUC57 / ndm质粒被设定在10倍稀释。在优化的实验条件下,pUC57 / kpc和pUC57 / ndm被添加到不对称PCR系统,和获得biotin-ssDNA产品应用于试验片。带信号增强了目标KPC-2和ndm - 1的浓度增加,和剥离强度KPC-2和ndm - 1浓度的对数成正比(从0.1到100点,数据7(一)和7 (b))。由此产生的校准曲线我= 2746.32 + 201.82的日志₁₀C KPC-2和我= 2700.61 + 199.03的日志₁₀C ndm - 1(嵌入的数据7(一)和7 (b))。根据空白加三倍的原则标准,检测极限是KPC-2降至0.03点和0.07点ndm - 1。红乐队在测试区清晰可见即使在0.1点的KPC-2和NDM - 1,这表明多路地带可用于同时视觉检测KPC和NDM基因没有任何专门的仪器。因此,该多路显示了POCT检测KPC-2大有前途,NDM-1-the CRE的主要标记。

3.6。特异性分析

带传感器的特异性是评估通过添加一组菌株不对称PCR系统。两个临床菌株携带"和8个标准菌株携带没有选择"测试试验特异性(表1)。不对称PCR产品抽样在横向流,10分钟后观察结果。结果表明在特拉KPC-2的存在k .肺炎在特拉和ndm - 1大肠杆菌,8个标准菌株包括k .肺炎和大肠杆菌显示负面结果,空白的控制(ddH的类似₂啊,图8(一个))。荧光PCR、敏感的检测方法"基因(39),进行上述菌株,表明基因的pcr KPC和NDM 100%与多路复用地带(数据一致8 (d)和8 (e))。此外,KPC的表型和NDM酶进行分析通过评估两个特从临床分离菌株的药敏样本。Imipenem-resistantk .肺炎和大肠杆菌添加硼酸后变得敏感,EDTA溶液,分别(图8 (b))。磁化率的变化表明,k .肺炎e产生KPC酶的活性,抑制了硼酸,和大肠杆菌产生了NDM酶,被EDTA的活动。输入"的侧流试验进一步证实了KPC酶的存在k .肺炎和NDM酶大肠杆菌(图8 (c))。两个临床CRE菌株的表型KPC和NDM符合酶基因型的测试使用荧光PCR和剥离测试。总之,这多路地带可以准确地检测CRE菌株含有KPC和NDM基因和没有特异性的反应与其他标准菌株用于试验。

3.7。验证测试KPC和NDM地带的基因在临床样本

23日的临床样品检测,我们发现12k .肺炎与KPC-positive基因,1大肠下水道与KPC-positive基因,2k .肺炎与NDM-positive基因,2大肠杆菌与NDM-positive基因,1大肠oxytocaNDM-positive基因,和5肠杆菌属没有carbapenemase-resistant基因(表1)。使用多路复用"基因的识别(图S3)与测序结果(表是相一致的S3和S4)。我们进行了表型测试发现的细菌耐药性和一致的结果与地带和测序分析。与少量的临床样本测试,没有观察到假阳性或假阴性结果。加沙地带正确识别所有18隔离carbapenemase-positive (KPC和NDM敏感性:100%)。中使用的传感探头检测也没有可交叉反应的(特异性:100%)。结果证实,带传感器显示巨大的潜力在CRE基因在临床样本的输入。

4所示。结论

多路横向流地带开发的同步和视觉检测KPC和NDM基因CRE菌株使用不对称PCR,条形码捕获探针,streptavidin-coated金纳米粒子。不对称PCR使众多的生产biotin-ssDNAs灵敏度高。DNA条形码设计为捕获探针测试和控制线路使多路检测锅"基因检测系统。该方法具有分析时间短和特异性高于传统药敏测试方法。相比其他可用的侧流免疫测定(40],我们的多路复用成功检测到两个主要的" CRE菌株。核酸probe-based方法的优点容易制备、高灵敏度由于放大的集成策略,和更低的成本比锁定横向流检测试纸检测(20.- - - - - -22]。这种方法的另一个优点是,测试条可以存储在室温下长时间(3]。虽然带方便用户友好的,它受限于依赖普通PCR仪器和检测KPC-2和ndm - 1的能力。进一步的工作需要采用等温扩增方法和设计的捕获探针传感更多种类的"基因,包括KPC,小鬼,VIM, NDM, OXA-48。总体而言,发达侧流试验展品高敏感性和特异性,为POCT在资源有限的设置,提供一个有前途的方法,最终使CRE传输和在医院暴发。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果可在本文的补充材料。

的利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突在这个工作。

作者的贡献

Wei Lai和徐Yongjie同样导致了这项工作。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81860380和81860380)和格兰特的贵州省科技(qkhjc-ZK qkhjc-ZK (2021) 492 (2021) 474)。

补充材料

简洁描述为每个补充图和表。表S1包括控制和临床分离菌株用于这项研究。表S2包括扩增引物序列和捕获探针用于这项研究。表S3包括临床菌株携带KPC-2基因测序结果。表S4包括测序结果为临床菌株携带ndm - 1的基因。图S1包括控制和临床分离菌株的测试结果列在表S1使用Carba-5地带。图S2包括信息的质粒pUC57携带blaKPC基因或blaNDM基因。图S3包括23日KPC-2和ndm - 1测试的结果肠杆菌科样品使用我们的地带。(补充材料)