文摘
本研究的目的是开发一个专栏成像探测毛细管等电聚焦(icIEF)方法的分析特性的异构性小说人性化anti-EphA2抗体结合美登素衍生物。除了关注时间,样品成分进行优化:pH值范围内,百分比的载体两性电解质,共轭抗体浓度,和尿素的浓度。有4%获得了良好的电荷分离亚型载体两性电解质的大型(3 - 10)和狭窄的pH值范围(8 - 10.5)(1:1的比例),结合抗体浓度(0.3 - 1毫克/毫升)具有良好的线性(R2:0.9905),2 M尿素浓度、聚焦和12分钟。优化icIEF方法演示了一个好的interday重复性RSD值:< 1% (pI), < 8%(%峰面积),和7%(总峰面积)。优化icIEF是有用的作为一个分析表征工具来评估发现一批的带电同种型剖面研究maytansinoid-antibody共轭相比其赤裸裸的抗体。它表现出一个大π范围(7.5 - -9.0),而其裸体抗体显示狭窄π范围(8.9 - -9.0)。发现一批maytansinoid-antibody共轭,2%的收费相同亚型有ππ赤裸裸的抗体亚型。
1。介绍
单克隆抗体(mab)构成一个非常重要的治疗类,有超过100马伯经美国食品和药物管理局(FDA)治疗不同的疾病1]。将近一半的批准马伯抗癌(45%)。
裸体马伯用作抗肿瘤是最常见的类型。接合抗体与放射性同位素、化疗药物或毒素广泛调查,提高抗肿瘤抗体(效率2- - - - - -10]。抗体药物配合(adc)可以有选择地提供直接细胞毒性药物靶向癌细胞。
也会呈现出相当大的异质性造成各种抗体本身的蛋白质结构的修改。此外,连接数每个抗体药物分子降低ADC的同质性11,12]。这些可能的修改可能会导致原油和不同亚型的存在最终ADC的产品。因此,adc的完整描述应该执行包括电荷异质性,大小异质性和肽图(13- - - - - -16]。
马伯的主要质量属性或ADC表征测定的变异(17,18]。监控马伯的电荷变体或ADC给蛋白质稳定性的信息,产品批次的纯度,退化的途径,等等19]。
ADC的电荷异质性的特点是使用几种分析方法以及液相色谱(20.)、离子交换色谱法(IEC) (21- - - - - -23),毛细管电泳(CE) [24- - - - - -26],毛细管等电聚焦(cIEF) [27- - - - - -32),成像毛细管等电聚焦(icIEF) [33- - - - - -35]。
等电点聚焦(IEF)广泛用于蛋白质的分离是基于它们的等电点(π)。相比传统能源论坛凝胶合作,cIEF有几个优点。cIEF提供更高的分辨率、速度和定量分析(36,37]。
在cIEF、载体两性电解质溶液和样品用于填充毛细管。毛细管的两端放置到酸性和基本的解决方案中。当电场作用时,两性电解质的存在允许创建一个通过毛细管pH梯度。蛋白质通过毛细迁移,直到他们达到一个地区的pH值等于π,他们变得中性和停止迁移,导致一系列的狭窄的集中区域。在传统cIEF,分析物的focalisation是紧随其后的是后续动员集中样本区探测点的不同方法(压力、真空、和重力)。事实上,动员步骤大大影响分离效率和重现性的方法。同时,单点检测不能允许监控分离过程的进展。整个专栏检测(WCD),没有动员一步,允许同时检测沿整个长度的列和一个更好的选择。
本研究的目的是分离和确定小说的π同种型剖面人性化anti-EphA2抗体结合细胞毒性美登素衍生物。实现这一目标,整个专栏成像探测毛细管(icIEF)方法进行优化,应用于发现一批研究maytansinoid-antibody共轭。
2。材料和方法
2.1。材料
工具包ICE280化学测试套件ICE280电解溶液,甲基纤维素,1%,0.5%,和π标记(6.6,7.05,8.18,9.5,和10.10)从收敛购买生物科学。尿素是σ。Pharmalyte解决方案(3 - 10和8 - 10.5)来自通用电气医疗集团。
一个裸体单克隆抗体及其maytansinoid共轭进行了分析。发现一批抗体在硫化汞制定缓冲由组氨酸10毫米,甘氨酸130毫米,蔗糖5% (w / v)。
2.2。样品制备
蛋白质样品被稀释准备所需的最终浓度0.35%甲基纤维素、2% pharmalytes(3 - 10),和2% pharmalytes(8 - 10.5)(1: 1的比例)和尿素的所需的浓度。π标记(6.61,8.81,7.05,9.5)被添加到样本为π校准。
一个例子展示的制备抗体样本(8毫克/毫升)(200年第四卷μl和最终浓度1毫克/毫升)据报道在表1。每个测试样本然后由离心旋涡。离心后,样品被转移到一个玻璃autosampler瓶和离心去除泡沫之前放置在autosampler旋转木马进行分析。
2.3。icIEF装置
icIEF分析进行了使用一个iCE280仪器autosampler王子和毛细管盒从收敛生物科学。一个透明的毛细管柱(50毫米,100μm ID, 200μm OD)是嵌入玻璃盒,与它的内表面涂有一层氟碳电渗流量降到最低。水库对阴极(100毫米氢氧化钠和0.1%甲基纤维素)和阳极解决方案(80毫米H3阿宝4和0.1%甲基纤维素)附着在玻璃盒和中空纤维膜分离毛细管。蛋白集中时间在3000 V范围从7到15分钟,在280 nm和检测是实现CCD相机。
3所示。结果与讨论
3.1。icIEF方法的发展
maytansinoid-antibody描述电荷异质性,样本,在初步实验中,由ADC、0.35%甲基纤维素、4%的两性电解质溶液pH值的范围从3 - 10 (pharmalytes 3 - 10), 2 M尿素,2π标记(6.61和9.50)。
为了优化电荷的分离变异的maytansinoid-antibody icIEF方法,几个必须考虑和优化实验参数:样本pH值范围和百分比的载体两性电解质,ADC样品浓度、样品尿素浓度,和关注时间。表2总结了不同实验条件下的优化充电同种型分离研究icIEF ADC。
3.1.1。pH值范围的载体两性电解质
载体两性电解质溶液包含一个广泛的不同的π值两性离子化合物的混合物,可以产生一个毛细管pH梯度。沿着整个pH值与均匀吸光度范围在280海里,它们在不同的pH值范围:商用宽(3 - 10)和窄(8 - 10.5,5 - 8)。的初步条件,一些电荷亚型co-migrated标记9.50使用4%两性电解质溶液pH值范围宽(3 - 10)。因此,两性电解质溶液pH值与一个狭窄的范围从8到10.5 (pharmalytes 8 - 10.5)添加到pharmalyte解决方案(3 - 10)比1:1。由于两性电解质的狭窄的pH值范围内,不同电荷亚型的maytansinoid-antibody从标记9.5(图中分离了出来1)。从这个图中,我们可以看到研究maytansinoid-antibody有几个亚型π值的变化从7.5到9.0。
3.1.2。Maytansinoid-Antibody浓度
为了研究最终浓度样品费用的影响同种型分离,maytansinoid-antibody样本准备在不同的最终浓度:0.3,0.5,0.8,1,1.5毫克/毫升(图2)。
maytansinoid-antibody浓度的增加导致了π亚型的价值观转向更高的值。这种转变的π值的增加可能与添加剂随着maytansinoid-antibody浓度样本矩阵(组氨酸、甘氨酸和蔗糖)。这些添加剂会影响两性电解质的线性pH梯度,导致π值的变化(38]。这些添加剂也可能吸附在墙上的毛细管和抑制剩余电渗流量,导致π亚型的价值观的转变。
紫外吸光度是观察到的饱和maytansinoid-antibody浓度为1.5毫克/毫升。很好的线性证明亚型的测量样品浓度的范围(0.3 - 1毫克/毫升)(图3)。以下研究maytansinoid-antibody选择1毫克/毫升的浓度。
3.1.3。尿素浓度
cIEF,电荷可以极大地影响同种型分离蛋白质聚合和降水引起低蛋白溶解度达到或接近π和高蛋白质浓度的乐队。的几个测试添加剂已知蛋白质的溶解度增加,如非离子表面活性剂或尿素,尿素的存在有显著影响电荷同种型ADC的分离。尿素的样本矩阵的数量maytansinoid-antibody一直在不同浓度范围从0到3 M(图4)。
显然,尿素的存在提高了电荷maytansinoid-antibody的概要文件。尿素浓度为0或1 M,有蛋白质的峰值由于聚合到毛细管。然而,分离电荷对碘氧基苯甲醚剖面稳定/尿素浓度的2 M。因此,2 M尿素被选为最优浓度对于同种型分离maytansinoid-antibody收取以下实验。
尿素浓度会影响蛋白质的分离电荷亚型和明显的π值(38,39]。例如,特纳和Schiel尿素浓度的影响研究主要马伯的明显π电荷变体(38]。π的主要结果表明,明显马伯电荷变种被添加尿素显著影响,可能由于urea-mediated变性。为了澄清添加尿素的影响,π的值主要ADC负责变异对尿素浓度(图绘制5)。轻微下降的π值与尿素浓度增加说。
我们还应该注意到,尿素添加溶液的粘度增加毛细管电泳淌度和减少的组件。因此,关注时代需要优化选择的尿素浓度。
3.1.4。集中的时间
集中时间不一7至15分钟确定它是足够长的时间maytansinoid-antibody亚型高相对分子质量。maytansinoid-antibody的概要文件,如图6集中时间的函数,表明电荷亚型之间的分辨率提高了增加集中时间从7分钟到15分钟。然而,15分钟的集中时间太长;π的标记(9.5)从窗口消失的检测。因此,集中时间12分钟被选为最优条件的亚型分离。
3.1.5。两性电解质百分比
为了优化电荷的分离maytansinoid-antibody亚型,两性电解质的影响% 1:1的一个狭窄的pH值范围(8 - 10.5)和pH值范围宽(3 - 10)进行了研究:4%,6%和8%(图7)。如图7,增加了两性电解质之间的分辨率导致减少百分比maytansinoid-antibody亚型。这些结果表明,4%的两性电解质的分离是一个很好的选择maytansinoid-antibody亚型。
开发一种方法分离和π电荷测定亚型的maytansinoid-antibody icIEF,不同的实验条件进行了优化。
随着maytansinoid-antibody浓度样本矩阵从0.3到1.5毫克/毫升,π值的变异转向更高的观察值。此外,失去线性说时增加maytansinoid-antibody浓度为1.5毫克/毫升的紫外吸光度的饱和度。maytansinoid-antibody浓度是固定在1毫克/毫升。
6.61和9.50的π标记是适当的标记作为内部标准自π值的亚型的maytansinoid-antibody从7.5到9.0不等。
的范围狭窄(8 - 10.5)范围(3 - 10)pharmalytes导致电荷之间的分辨率的提高maytansinoid-antibody亚型。增加的百分比范围和窄范围pharmalytes(1: 1)的比例从4%到8%,分离电荷对碘氧基苯甲醚的质量下降。因此,4% pharmalytes已经选定,以确保最佳的分辨率。
尿素浓度样本矩阵的不同从0到3米。尿素的存在导致maytansinoid-antibody溶解度的增加(没有峰值对应的抗体聚集icIEF概要文件)和提高分辨率的亚型。尿素浓度有轻微影响电荷同种型π值。maytansinoid-antibody电荷的分离从2到8 m尿素亚型稳定。2 M尿素被选中来获取最佳的和可重复的同种型解决方案。
除了maytansinoid-antibody的示例矩阵中不同的添加剂,主要时间是一个关键的参数来获得一个可重复的和稳定的icIEF概要文件。增加集中时间从7到15分钟,该决议的亚型增加。丧失的标志π(9.5)被观察到15分钟。因此,12分钟3000 V是足够的时间来实现最优的分离电荷亚型。
3.2。Interday优化icIEF方法的可重复性
测试interday maytansinoid-antibody开发方法的可重复性,icIEF概要文件在连续三天内进行。统计结果,总结在表3,展示了一个好的interday可重复性。
3.3。发达icIEF方法的应用程序
发达icIEF方法应用于描述电荷异质性的研究发现批maytansinoid共轭(图8(一个))相比,其裸体抗体(图8 (b))。裸体抗体显示狭窄π范围(8.9 - -9.0),而研究maytansinoid共轭大π展出范围(7.5 - -9.0)。的非结合的抗体水平ADC配方在过程控制是一个至关重要的参数,因为它可以直接影响ADC的功效。从表4的百分比收取相应亚型裸体抗体代表亚型在ADC发现批量的2%。这些结果表明接合过程的成功一个赤裸的抗体maytansinoid导数。
(一)
(b)
这种异质性的ADC与细胞毒性药物的共价连接的自由胺组马伯的赖氨酸。单克隆抗体通常有40 -赖氨酸残基,和化学结合的结果在异构混合物组成的非结合的马伯,mab共轭变量随机组合在不同站点的细胞毒素抗体(40,41]。maytansinoid变异的电荷共轭胺组的数量不同赖氨酸共轭分子链接器,从而减少他们的π与增加的数量修改氨基酸组(酸性更强)。与研究结果在协议的变体IgG1-Fc和共轭IgG1-Fc由Boylon et al。42]。研究表明IgG1-Fc的化学结合不同的药物通过氨基酸赖氨酸改性马伯表面的静电特性,介绍了更多的复杂性。化学结合导致减少π共轭。
发达chromatofocusing适用于分析特征的异质性的研究单克隆抗体及其药物共轭基于变异的等电点不同的礼物。
4所示。结论
整个专栏成像探测毛细管等电聚焦(icIEF)是一种很有前途的技术检查治疗蛋白质的质量。在这项工作中,一个icIEF方法开发了监控的电荷异质性maytansinoid-monoclonal抗体。maytansinoid-monoclonal抗体的组成进行优化包括pH值和百分比的载体两性电解质,共轭抗体浓度、尿素浓度,和关注时间。在优化条件下,峰对应于电荷共轭的变异抗体分离良好的分辨率。方法结果显示一个好的interday重复性和线性浓度范围内0.3 - 1毫克/毫升。发达的方法应用于评估发现的质量批maytansinoid-monoclonal抗体(43]。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
作者仅负责内容和本文的写作。
确认
这项工作是支持的特斯尹大学。