文摘

,敏感的方法开发了监测癌胚抗原(CEA)金纳米粒子散布普鲁士blue@polyaniline核壳nanocubes (Au NPs / PB@PANI)。首先,灵巧的低温方法被用来准备制服PB@PANI核壳nanocubes PVP的协助下,在PB作为电子传递中介提供电化学信号,聚苯胺具有优良的导电性和理想的化学稳定性,不仅扮演PB的保护层,以防止腐蚀的基本的媒体,也有效地提高电子转移。重要的是,进一步加强的导电性和生物相容性PB@PANI和进一步提高电化学信号捕获大量的Ab2,非盟NPs表面掺杂PB@PANI形成非盟NPs / PB@PANI纳米复合材料。随后,得益于nanoprobes核壳结构的优点,又很快双金属nanoflower (AuPt NF)、CEA检测了夹层电化学免疫传感器,它提供了一个广泛的线性检测范围从1.0 pg·毫升−1100.0 ng·毫升−1和较低的检出限0.35 pg·毫升−1通过第一项(3σ)。此外,它显示一个满意的结果时,核壳结构nanoprobe-based免疫传感器应用于确定东航在现实人类的血清样本。

1。介绍

众所周知,癌胚抗原(CEA)是一种肿瘤标志物为结肠癌,乳腺癌,卵巢癌,和其他癌症,可以提供可靠的信息对肿瘤的早期诊断和治疗患者(1- - - - - -3]。因此,东航的高度敏感的决心是迫切需要的准确和高效的分析技术。免疫传感器基于antibody-antigen交互是最广泛使用的分析技术之一的定量检测生物标记物(4]。其中,电化学免疫传感器已经备受关注由于其高特异性的特点,灵敏度好,短时间内消费、低能耗和跟踪检测和更适合生物标志物的检测低浓度(5,6]。最近,大量的电化学免疫传感器构建了东航的定量。例如,王et al。Jozghorbani王等人,等人设计的三种label-free CEA免疫传感器检测范围为0.005,0.05和0.0429 ng·毫升−1分别为(7- - - - - -9]。尤其是大量的报道集中在夹层电化学免疫传感器CEA检测(10- - - - - -13),由于其独特的优势,如降低背景噪音,更高的灵敏度,和重要性,他们有更高的选择性分析物通过两个具体的反应,这是优于label-free同行(14- - - - - -16]。

普鲁士蓝(PB)具有面心立方晶格结构是受欢迎的作为一种电化学redox-active物种电化学生物传感器由于其高电化学/ electrocatalytic性能和较低的氧化还原电位(17,18]。不幸的是,PB的稳定性差和低导电率限制其进一步应用于生物传感器(19]。为了减少这些问题,一些导电材料可以满足上述要求。聚苯胺(PANI)的一个最理想的材料具有良好的化学稳定性、低成本、和良好的导电性不仅可以提供导电衬底也可以形成一个有效的涂料层等“核心”碳纳米管(碳纳米管)或PB (20.,21]。PB和聚苯胺(PB@PANI)可以扮演了一个重要的协同效应,提高electrocatalytic性能、导电性和稳定性(21]。此外,为了进一步提高PB@PANI的导电性和生物相容性,金纳米粒子的表面(Au NPs)介绍了通过n债券PB@PANI盟NPs和nh之间2从聚苯胺形成非盟NPs / PB@PANI纳米复合材料(15]。我们所知,非盟NPs / PB@PANI纳米复合材料的制备和应用在电化学免疫传感器没有被报道。因此,PB@PANI装满盟NPs (Au NPs / PB@PANI)将会是一个有前途的nanoprobe。

夹层电化学免疫传感器,实现信号放大和高灵敏度,它更重要的关键是有效地固定主抗体(Ab1)[22,23]。金和铂纳米粒子是最有前途的双金属材料的各种应用程序由于其优良的生物相容性、较高的比表面积,对减少H和上级electrocatalytic属性2O2(24- - - - - -26]。他们可以装饰在半胱氨酸(L-Cys)修饰电极表面提供一个可用的微环境加载大量的Ab1,从而大大提高免疫传感器的灵敏度。

这项工作是由电沉积的AuPt双金属nanoflower (AuPt NFs) GCE修改与L-Cys传感平台和非盟NPs / PB@PANI小说标签由一个灵巧的低温方法。AuPt NFs的存在不仅固定主要抗体,也加速了电子转移。此外,随着发达盟NPs / PB@PANI nanoprobes被用作示踪剂电化学信号的产生和放大第二抗体(Ab和很容易的被捕获2通过n键)。正如预期的那样,一个夹层电化学免疫传感器能够实现大信号放大是由连接Ab1-AuPt NFs / L-Cys Ab2非盟NPs / PB@PANI。

2。材料和方法

2.1。材料和化学物质

癌胚抗原(CEA)及其抗体,α胎蛋白(法新社),从Biocell购买生物技术。有限公司(郑州,中国)。氯金酸(HAuCl4h·42O)、氯铂酸(H2竞购66小时2O),牛血清白蛋白(BSA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、半胱氨酸(L-Cys),苯胺,过硫酸铵,等等都是购自阿拉丁试剂有限公司(上海,中国)。

2.2。设备

电化学测量是在气660 e电化学工作站(上海有限公司,中国)。纳米材料的形貌是通过扫描电子显微镜(SEM、地产- 7100 f、日本)和透射电子显微镜(TEM,杰姆- 6700 f,日本)。

2.3。合成PB Nanocubes

PB nanocubes合成根据以前的工作尽管轻微修改(27]。8.0更易·L−1Na4铁(CN)6.8H2啊,4.0毫升盐酸(37%)和2.0 g聚乙烯吡咯烷酮( 40000)被添加到去离子水(400毫升),搅拌30分钟,然后回流在60°C 6 h。之后,蓝色的产品去离子水清洗和干燥在100°C真空24 h。

2.4。PB@PANI制备核壳Nanocubes

PB@PANI核壳nanocubes合成与细微变化(参照以前的工作21]。简单地说,0.6 g·PB, 0.5 g聚乙烯吡咯烷酮( 40000)和100μL苯胺单体溶解在100毫升盐酸(1摩尔·L−1)与声波降解法1 h。然后,过硫酸铵溶液(1.6更易·L−1)添加一滴一滴地到上面的解决方案,在冰浴了18 h。最后,PANI-coated PB(核壳结构PB@PANI)被离心收集,用去离子水和乙醇洗净了好几次。

2.5。Ab的准备2非盟NPs / PB@PANI物

15毫克PB@PANI nanocubes被添加到集中盟NPs胶体溶液(5.0毫升,1.0 mg·毫升−1)和反应30分钟在颤抖。非盟NPs是表面组装PB@PANI形成非盟NPs / PB@PANI Au-NH化学键的纳米复合材料2(15]。其次是离心和用去离子水洗涤两次,所得沉淀redispersed在PBS溶液pH值(7.0)。随后,500μL CEA-Ab2(2.0 mg·毫升−1)被添加到非盟NPs / PB@PANI悬架(2毫升)和搅拌12小时在4°C。摆脱非特异性吸附,100年μL (1% BSA与获得的轭合物混合在4°C 6 h。最后,物是离心机和redispersed PBS (pH值7.0,10更易·L−1),然后储存在4°C。

2.6。免疫传感器的制造

对聚合物纳米复合材料薄膜沉积、抛光玻璃碳电极(GCE)第一次沉浸在0.5更易·L−1含半胱氨酸PBS (pH值7.0)和扫描在−0.0到1.7 V的潜在范围在50 mV / s 3周期。获得的电极在空气干燥,然后下降到0.2摩尔·L−1H2所以4和解决方案包含0.5更易·L−1HAuCl4和0.5更易·L−1H2竞购6和镀层chronoamperometric方法−0.2 V和Ag / AgCl 600年代在室温下。冲洗后,AuPt NFs / L-Cys GCE-modified电极是沉浸在初级抗体(CEA-Ab1一夜之间在4°C)的解决方案,和Ab1与修改后的电极。接下来,去除多余的结合位点,沉浸在了修饰电极1 wt % BSA溶液在室温下了40分钟。最后,得到电极清洗三次PBS和储存在4°C。计划1(一)显示设计的免疫传感器的示意图,计划1 (b)显示了Ab的准备过程2非盟NPs / PB@PANI物。
方案1
(一)施工过程的电化学免疫传感器。(b) immunoprobes的组装关系图。
2.7。电化学检测

准备的免疫传感器是解决方案的孵化东航与不同浓度抗原40分钟,然后继续在Ab孵化2非盟NPs在37°C / PB@PANI解决方案。随后,微分脉冲伏安法(第一项)和电化学阻抗谱(EIS)进行了PBS (pH值6.5)和5中更易·L−1[Fe (CN)6]3 - / 4,分别。

3所示。结果与讨论

3.1。纳米材料的表征

PB的SEM照片,PB@PANI,非盟NPs / PB@PANI显示在数字1(一)- - - - - -1 (c)。好了铅纳米复合材料是由立方体边长在300 - 320纳米(图的范围1(一)),它有一个粗糙的表面提供丰富的统一发展的成核点PANI壳(28]。很清楚地看到,PB的nanocubes完全覆盖的PANI壳,和聚苯胺的厚度后大约10 nm 18 h(图的反应时间1 (b))。当盟NPs与直径约15海里PB@PANI附着在表面,我们清楚地观察到非盟NPs表面均匀的球状形态被吸收PB@PANI核壳nanocubes(图1 (c)),也可以将CEA-Ab固定住2通过n债券。

(一)
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图1
(a) PB的扫描电镜图像,(b) PB@PANI, (c)盟NPs-PB@PANI (d)全球教育运动,(e) L-Cys / GCE, (f) AuPt NFc / L-Cys / GCE。

数据1 (d)和1 (e)显示电极的形貌。展示图1 (d),表面裸露的全球教育运动不平稳。通过电沉积,L-Cys电影表面沉积GCE(图1 (e)),这可能影响的大小和晶体结构AuPt双金属nanoflowers (AuPt NFs)根据先前的报道29日]。同时,提取l -半胱氨酸的存在有助于绑定AuPt NFs GCE表面。Quasi-spherical如花似玉AuPt NFs的直径约50纳米电镀后观察L-Cys / GCE(图1 (f))。

同时,非盟,Pt、C、N和S元素被发现的能量色散谱(EDS) AuPt NFs / L-Cys / GCE(图S1A)。EDS可以进一步证明非盟NPs / PB@PANI纳米复合材料是由非盟,Pt, K, N、C、O,和铁元素(如图印地)。

3.2。构建的免疫传感器的特性

简历和EIS利用测量监控逐步被装配过程的免疫传感器30.]。如图2(一个)的峰值电流L-Cys电影修改GCE电极由一步electropolymerization明显下降(曲线b)与裸GCE电极(曲线),表明L-Cys电影阻碍了电子转移。此外,修改AuPt NFs的电影L-Cys造成峰值电流的增加受益于良好的导电性的Ab后AuPt NFs(曲线c)。1在修饰电极上吸附曲线(d),阻断与BSA (e)曲线,和修改与Ag (f)曲线,进一步降低峰值电流被认为,由于《阻碍电子传递的影响。但是,修改后的峰电流显著增加电极结合Ab2非盟NPs / PB@PANI物(g)曲线,表明Ab2非盟NPs / PB@PANI物可以极大地增强电子转移。此外,电极的每个步骤修改EIS结果符合的简历。

(一)
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(b)
(b)
图2
CVs (a)和(b) (a)裸GCE EIS, (b) L-Cys / GCE, (C) AuPt NFs / L-Cys / GCE, (D)有所/ AuPt NFs / L-Cys / GCE, (E) BSA /有所AuPt NFs / L-Cys / GCE, (F) Ag / BSA /有所/ AuPt NFs / L-Cys / GCE, (G)物/ Ag / BSA /有所AuPt NFs / L-Cys / GCE (Fe (CN)6]3 - / 4。
3.3。优化实验条件

提高该免疫传感器的灵敏度和分析效率,实验条件进行了优化。如图3(一个),当孵化时间是20分钟,80分钟,第一反应逐渐增加40分钟后,然后到达了一个高原,因为与Ab抗原的结合1达到平衡大约40分钟。

(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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图3
培养时间的影响(a) (b) pH值,(c)沉积AuPt NFs,和(d)浓度盟NPs / PB@PANI峰值电流C 东航= 10.0 ng·毫升−1。从五重复测量误差代表标准差。

缓冲溶液的pH值有显著影响电化学生物传感器的稳定性和活动。从图可以看出3 (b)随着pH值的变化,第一反应的信号也发生了变化。在pH值的范围5.0 - -8.0,第一项值先增加,然后略有下降。非盟NPs / PB@PANI nanoprobes拥有最佳的活动和稳定在近中性或酸性环境由于有效的导电聚苯胺涂料层。因此,我们选择了PBS溶液pH值为6.5,适当的电解质。

同时,AuPt NFs的沉积时间对第一反应有显著影响。作为显示在图3 (c),AuPt NFs的沉积时间从200增加到1000年代,当前信号逐渐增加,然后到达了一个高原在600年代。因此,AuPt NFs的沉积时间被选为600年代的制备免疫传感器。

类似报道生物传感器、免疫传感器的性能高度受到盟NPs / PB@PANI的浓度的影响。如图3 (d),增加浓度从0.5 mg·毫升−12.0 mg·毫升−1,当前响应迅速增加,但当浓度高于2.0毫克·毫升−1,当前响应到达了一个高原。因此,2.0 mg·毫升−1成为本研究的最佳浓度。

3.4。东航的定量检测

在最佳实验条件下,东航是量化利用发达的免疫传感器。如图4,第一信号CEA浓度增加逐渐增加。电流强度之间有良好的线性关系和CEA浓度的对数-100年0.001 ng·毫升−1。回归方程是我P(μ)= 4.6652 + 0.7570x(R20.35 = 0.9981)和pg·毫升−1检测极限。相比与其他nanoprobe-based免疫传感器(31日- - - - - -37),准备免疫传感器的检测极限较低(表1)。优秀的原因分析设计了免疫传感器的性能可以概括如下:首先,聚苯胺,PB@PANI导电外壳的核壳结构,维护PB的结构稳定性,有效地提高了电子转移从PANI PB由于亲密的附着力。其次,大量的非盟NPs分布式PB@PANI表面提供了一个绑定的大比表面积抗体,增强CEA-Ab的固定2。此外,非盟NPs / PB@PANI nanoprobes独特结构和协同作用的贡献表现出良好的导电性和高稳定性,增加了信号分子传导效率,可以用作信号放大系统来提高检测的灵敏度。最后,AuPt NFs与多功能性被用作理想的遥感平台,不仅可以捕获更多的Ab1和提高电导率也一起构成双信号放大系统非盟NPs / PB@PANI nanoprobes。

(一)
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(b)
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图4
(a)的第一反应和免疫传感器与CEA浓度(孵化后从g: 0.001, 0.01, 0.1, 1.0, 10.0, 50.0,和100 ng·毫升−1)在0.1 M PBS (pH值6.5)。(b)免疫传感器的校准曲线。从五重复测量误差代表标准差。
表1
比较分析不同nanoprobes CEA免疫传感器的性能。
3.5。免疫传感器的特异性、稳定性和重现性

为了研究构造的特异性免疫传感器针对东航,100.0 ng·毫升−1四个干扰包括α胎蛋白(法新社),抗坏血酸(AA)、葡萄糖(Glu)和BSA加入东航(1.0 ng·毫升−1分别)解决方案。作为显示在图5,这些干扰了不负责任的影响到目标,表明该生物传感器提出了高特异性的具体识别CEA。


图5
东航的特异性免疫传感器。误差= SD (n= 5)。

免疫传感器的稳定性实验是由存储几个免疫传感器在4°C 30天,这是每5天(图进行CEA检测6(一))。30天后,第一项的值保留88.6%的最初反应。Ab的有效固定2非盟NPs / PB@PANI nanoprobe聚苯胺涂层的PB和有效保护了发达的免疫传感器有很高的稳定性。

(一)
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(b)
(b)
图6
稳定性(a)和(b) CEA免疫传感器的重现性。误差= SD (n= 5)。

为了进一步验证免疫传感器的重现性,六个免疫传感器在10.0 ng·mL孵化−1东航的第一项的决心。如图6 (b)测量后,RSD为3.1%,表明免疫传感器的重现性是可以接受的。

3.6。测定的血清样本

证明分析的可靠性和应用的潜力开发免疫传感器,十临床血清标本包含CEA进行了分析。显示在表2,两种方法之间的相对误差范围从−5.26%到6.94%,这些数据显示,发达国家临床血清免疫传感器有很好的实用性分析。

表2
东航与ELISA。

4所示。结论

总之,电化学免疫传感器基于金纳米粒子功能化PB@PANI核壳nanocubes作为CEA检测信号放大的策略是捏造的。免疫传感器的灵敏度高的原因是由于如下。首先,可以加上丰富的N-species PANI PB有效保护PB在媒体基本的结构退化。第二,非盟NPs / PB@PANI nanocubes含有丰富的电子介质提供了一个很大的第一信号。最后,AuPt NFs点缀在L-Cys / GCE电极增加比表面积和导电性,这不仅固定更多的抗体,也加速了电子转移。此外,免疫传感器显示特别设计的优点,避免了添加介质缓冲或分离介质的固定到电极上。幸运的是,策略可以很容易地扩展到非盟NPs / PB@PANI纳米复合材料的应用范围。

数据可用性

支持这项研究的数据来自之前报道的研究和数据集,已被引用。

信息披露

的预印本手稿曾发表(38]。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由以下项目:安徽省自然科学基金(1908085 mh272),研究安徽的大学自然科学基金研究项目(KJ2021A0842),本科在创新和创业培训项目(202010368027),国家自然科学基金(21645006)和2022年安徽省大学生创新与创业培训项目,药学院013。

补充材料

对于信号探测材料的表征,我们增加了能量色散谱(EDS)作为补充材料,提供的手稿。图S1。EDX光谱(A) AuPt NFs / L-Cys / GCE和(B)盟NPs / PB@PANI。(补充材料)