文摘
伊维菌素是一种大环内酯广泛用于兽医的广谱抗寄生物的属性。它已经被证明是有效和安全的。本研究的目的是开发一个高性能液相色谱法与二极管阵列检测器对伊维菌素筛选动物消耗饲料和水。此外,目标是量化伊维菌素水平高于0.5毫克/公斤的在水中固体矩阵和0.1毫克/公斤。Doramectin用作过程标准。样本提取用固相萃取硅和C-18列。该方法涉及使用高效液相色谱法(HPLC)与一个二极管阵列检测器(爸爸)。结果解释使用校准曲线与伊维菌素标准建立在多个浓度(0.5、1、2、5和12.5毫克/公斤)。使用方差分析的统计评价数据。线性回归分析显示的数据是非常重要的( ),截距值没有显著不同于零,和相关系数值(> 0.999)表示出色的线性度。进一步的实验表明,该方法研究土壤矩阵时也很有用。土壤是干一样的饲料和分析;恢复意识到在飙升的样品一样。方法很简单,廉价的、精确和可重复的;它需要非常少量的样本。
1。介绍
伊维菌素是一种大环内酯广泛用于兽医的广谱抗寄生物的属性。伊维菌素是自然产生的酵母链霉菌属avermitilis,它包含两种化合物的混合物:22日23-dihydroavermectinβ1 (C48H74年O14B123-dihydroavermectin)和22日β1 b (C47H72年O14B1 b)。伊维菌素B1使至少80%的混合物,而不超过20%是由伊维菌素B1 b。它是活跃的节肢动物和线虫(1,2),导致其瘫痪和随后的死亡通过阻止氯通道(3]。像所有avermectins,伊维菌素是高度脂溶的4]。
伊维菌素是口头授权,局部,肠外(皮下)政府(1,2,5]。欧洲药物管理局已批准伊维菌素为多个物种:牛、猪、绵羊、山羊、马、驯鹿,老鼠,老鼠,狗,猫,灵长类动物,和人类。伊维菌素是出售单独或结合其他杀寄生虫药化合物(6,7]。在农场动物,剂量可以根据不同给药途径和范围从200µg每公斤体重的牛、羊,羊300µ克每千克体重在猪6,8]。
据估计,在80年和98%的药物排泄粪便,而不被代谢,从而达到环境完好无损。
最大残余限制(MRLs)已经建立了对所有哺乳动物食物种类、除了供人类食用动物生产牛奶。标记残渣是22日23-dihydroavermectin B1a。MRLs限制在所有物种的有针对性的组织如下:30µ肾脏和100 g / kgµ克/公斤的脂肪和肝脏(8,9]。意大利国家参考饲料动物的监测和控制中心(CReAA-Centro di Referenza重回/ la Sorveglianza e il Controllo degli Alimenti每gli Animali)建立了检测极限小于1毫克/公斤的饲料。
虽然在哺乳动物(伊维菌素具有广泛的安全裕度1,2),它已被证明在许多无脊椎动物物种是有毒的。台面等人报道可能的生态后果在水生生态系统10]。Johnson-Arbor引发了环境问题(伊维菌素残留11]。因此,一个精确的系统监控有机基质的伊维菌素水平会因此至关重要。
不同的方法对伊维菌素检测报告由几个作者。Asbakk等人使用与荧光检测高效液相色谱法(HPLC)检测粪便中伊维菌素从驯鹿12]。伊格莱西亚斯等人同样的方法用于土壤和牲畜粪便(13]。液体chromatography-tandem质谱(LC-MS-MS)在几项研究也被证明有用的等离子体等多个矩阵,牛奶、肝脏和全血(14- - - - - -20.]。液体chromatography-electrospray电离质谱/质谱(LC-ESI-MS / MS)也被用来探测大环内酯在鱼类肌肉(14]。
本研究旨在开发一种高效液相色谱法与二极管阵列检测器(爸爸)筛查伊维菌素在动物饲料和水消费。此外,我们想量化伊维菌素水平高于0.5毫克/公斤在水中固体矩阵和0.1毫克/公斤。我们使用doramectin过程标准(13]。
2。材料和方法
2.1。仪器
仪器用于实验包括超声波水浴(Mod SONICA扫描系统。5300 ep,片,米兰,意大利),均质器类型Grindomix (RETSH Grindomix Mod.GM200,佛得角科学、汗、德国),瓶瓶(Janke Kunkel国防部,HS501数字IKA Labortechnik, Staufen,德国),离心机(埃普多夫国防部5804 R,默克公司,达姆施塔特,德国),真空泵(Mod。纽伯格KNF Laboport N820 FT.18,米兰,意大利),在50°C±5°C水浴氮当前设备(Buchi Mod。b - 461水浴,双子座实验室可持续发展的设备,阿,荷兰),涡流(IKA一Munishaker, IKA Labortechnik, Staufen,德国),和尺度(梅特勒-托利多Mod。XPE12025,哥伦布,哦,美国;缝匠肌Mod.ME235P、缝匠肌、哥廷根,德国)。两个尺度上的使用,有10毫克敏感性和0.01毫克的敏感性。
高性能液相色谱系统包括脱气装置,泵,autosampler,二极管阵列检测器和软件安捷伦ChemStation启A.10.02 (1757)。这是配备了色谱precolumn(逆阶段Supelguard C-18 2厘米,内部直径:4.6毫米,和粒子平均直径:5µm, Supelco Bellefonte, PA,美国)和色谱柱(逆阶段Supelcosil C-18 25厘米,内部直径:4.6毫米,和粒子平均直径:5µ美国宾夕法尼亚州m, Supelco, Bellefonte)。
小设备的塑料适配器的工作由水库、50毫升聚丙烯管压力上限(EuroClone波斯公司意大利米兰),50毫升塑料水库、歧管系统适合于固相萃取(SPE)(美国Supelco Bellefonte, PA)、吸量管(10 - 1000µL)(美国WI Gilson米德尔顿),500毫克/毫升SPE C-18一样列(Supelco Supelco代码:57064年,Bellefonte, PA,美国),和500毫克/毫升SPE硅LC-Si列(Supelco Supelco代码:505374年,Bellefonte, PA,美国)。一次性材料是0.45μm过滤器(Incofar、深紫色、意大利),内直径6毫升水库和13毫米(地层、Phenomenex托兰斯、钙、美国),熔块(美国Phenomenex托兰斯,CA), 10毫升塑料注射器(射线SpA, Osimo、意大利),和250毫升塑料离心瓶与螺旋盖(耐尔根,罗切斯特,纽约,美国)。
玻璃器皿使用由10毫升尖底分级试管,10毫升u-bottom试管,10 mL-20毫升琥珀试管螺钉帽,A类或B玻璃吸量管,巴斯德玻璃吸量管,分级缸,类一个烧瓶,琥珀瓶。
2.2。化学药品和试剂
所有试剂纯度分析。超滤液和去离子的水使用的水。
从卡洛Erba试剂甲醇进行分析(DASIT集团公司。,Milan, Italy) was used for the extraction, while Aluminium oxide 90 (neutral alumina) from Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) was used for the preliminary chromatography phase. The following solvents were used for SPE column activation and elution as well as components of the HPLC mobile phase: methanol for HPLC from Carlo Erba Reagents (DASIT Group S.p.A., Milan, Italy), acetonitrile for HPLC from Carlo Erba Reagents (DASIT Group S.p.A., Milan, Italy), and dichloromethane for analysis from Carlo Erba Reagents (DASIT Group S.p.A., Milan, Italy). Ivermectin with declared purity from Dr Ehrenstorfer (LGC Labor GmbH Augsburg, Germany) and doramectin with declared purity from Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) were used, respectively, for the fortified specimen and as an internal standard.
对于每一个新实验,为稀释溶剂的混合物制成的乙腈(56%)、甲醇(37%)和水(7%)(v / v)和激活中性氧化铝(100 g的中性氧化铝滋润与6毫升的去离子水)在使用前就做好了准备。
溶剂用于高效液相色谱系统和解决方案都是根据0.2过滤μm过滤器。
2.3。准备的标准和质量控制样品
所有标准和控制使用前就做好了准备。伊维菌素原液,doramectin之一是准备在10毫升瓶,考虑到纯净,在1000年的浓度µ克/毫升。高效液相色谱法的解决方案是由甲醇和存储在冰箱里琥珀色管不超过12个月(21]。
一个中间的解决方案是为每个化合物10µg / mL,从股票的解决方案。10毫升瓶,股票的解决方案是添加到混合溶剂(乙腈(56%)、甲醇(37%)和水(7%))的浓度1:100。
从中间解决方案,伊维菌素与溶剂混合稀释获得五个工作解决方案为0.1,0.2,0.4,1,2.5µg / mL校准点。另一个解决方案(0.05工作µ通过添加50 g / mL)了µL中间解决方案的伊维菌素和doramectin 9.95毫升溶剂混合物。
为每个分析会话,一个空白的控制和强化样本为0.1 mg / L建立了水样。在一个10毫升瓶部分充满了去离子水,100µ10 L(中间解决方案µg / mL添加,体积,和稀释的比例1:2稀释混合。
为每个会话分析,建立一个空白的控制和强化控制固体样品(饲料或土壤)。消极的控制(空白)由10 g的ivermectin-free样本(饲料或土壤)。强化样品(0.5毫克/公斤)是由10 g的ivermectin-free样本(饲料或土壤),500µ10 L中间解决方案µg / mL添加了至少10分钟。
所有样品(控制和测试)受到相同的提取、纯化和分析过程。
2.4。实验设计
固体样品和甲醇提取,纯化使用固相萃取(SPE)技术。使用稀释后高效液相色谱纯化提取进行了分析。
2.4.1。提取和纯化的样品
水样本稀释的比例1:2稀释溶液,和500年µL中间解决方案的内部标准(doramectin)添加10µg / mL;在一个琥珀瓶1.5毫升转移。
土壤样本在45°C加热器干之前处理。至少2/3的总固体样品(饲料或土壤)分解获得均匀粉末。使用规模的敏感性为0.01 g, 10克的样品被转移到一个锥形瓶。50毫升的甲醇和500µL中间解决方案的内部标准(doramectin) 10µg / mL被添加到样本,烧瓶封顶。烧瓶被放置在与超声波水浴20分钟,然后动摇在瓶一小时700振荡/分钟。40毫升的上层清液是放置在塑料试管压帽和离心5分钟每分钟3000转。熔块放入每6毫升水库,然后添加了5 g的激活中性氧化铝,和另一个熔块是放在顶层。50毫升水库被固定在适当的适配器。15毫升离心液上层清液添加到50毫升水库。第一个5毫升是丢弃,剩下的体积在玻璃管收集。
激活,SPE硅列插入到廖,每个样本加上一个空白和强化控制。我们经过5毫升的乙腈为高效液相色谱在列由重力,然后使用真空干为1分钟。5毫升的二氯甲烷对高效液相色谱法是淋溶和干1分钟后应用真空。
空调,SPE C-18列插入第二个歧管,每个样本加上一个空白和强化控制。5毫升的二氯甲烷扩散通过应用真空和干1分钟;5毫升的水/乙腈混合物(50:50 v / v)扩散,和列一直湿。
10毫升注射器被应用到SPE C-18列使用适当的适配器。同时,5毫升的水/乙腈混合物(50:50 v / v)和2毫升的每个样本在每个注射器使用校准类一个吸管。液体被允许渗透,使列湿。列然后用1毫升的水/乙腈混合物(50:50 v / v)留给渗出液的重力为15秒,然后用真空干燥。列的墙壁被添加洗2毫升的水/乙腈混合物(50:50 v / v)和让它流真空泵的使用。最后,列干了1分钟,保持真空。
SPE C-18列插入条件SPE硅列与适当的适配器。5毫升的二氯甲烷/乙腈混合物(9:1 v / v)添加到SPE C-18列和渗透,保持真空1分钟;另一个5毫升的混合物受到相同的过程。SPE C-18列被丢弃,伊维菌素是筛选了从硅SPE柱5毫升的乙腈为高效液相色谱重力,不让它去干。进一步2毫升的乙腈为添加了高效液相色谱和筛选了通过应用真空。洗出液收集在一个锥形管和干在氮气流50°C±5°C。2毫升的然后洗出液稀释溶剂混合物和涡1分钟,和样本根据0.45点过滤器过滤。大约1.5毫升是放置在琥珀瓶。
2.4.2。的高效液相色谱分析
反相液相色谱法。解决方案的流动相由含有乙腈(56%)、甲醇(37%)和水(7%)在一个权力平等主义的过程。的固定相包括C-18 precolumn C-18列,分别,Supelguard反相色谱柱C-18(长2厘米,内直径4.6毫米,5µ平均粒径)和C-18 Supelcosil反相色谱柱(25厘米,内直径4.6毫米,5µ平均粒径)。
高效液相色谱法分析都是在室温下进行的(20°C)。在注入样品之前,系统平衡上述条件下30分钟。流被设定为1.2毫升/分钟,波长为245 nm。一卷100µL是每个样本运行注入。
伊维菌素的标准(0.05µg / mL),内部标准(0.05µg / mL),空白(图1(图),强化控制2)进行了分析。随后,所有样本和标准注射重复运行每三个样品。
分析被Accredia连续监控,意大利认证机构,认证实验室的质量实践和整合的结果。
3所示。结果与讨论
我们可以看到在图3,校准线毫微克注入轴和轴上的峰下的面积。校准曲线和仪器灵敏度是可以接受的(1)确定的相关性(r2)大于或等于0.99。(2)峰值相对于1圣校准曲线的点是可以量化的。
伊维菌素的浓度出现在示例计算基于光度响应从色谱获得报告,可以看到在图4。对于积极的最大浓度的样品,样品被稀释留在范围。
伊维菌素的浓度在示例所示的计算方程(1),一个是伊维菌素的注射量(ng),样品的重量(克),和2是结果从简化计算获得: 。
伊维菌素的浓度添加到强化样本计算插值校准线。
定性确认伊维菌素的存在,co-chromatography进行以确保怀疑样品中的分析物确实是一个正在调查中。色谱法是由注射50µL已知的样本一起提取50µL的伊维菌素的工作解决方案之一。选择工作的解决方案,它对应于相同的ng分析物与样品中。完美的标准和样本证实了协会的重叠峰时具有良好的形状,没有分裂或任何变形对称,可能表明存在的干扰物质,而不是一个分析物。峰下的面积等于之和的一半标准和样品的一半因为50µL(每100年注射而不是一个完整的注入µl .样品的光谱峰值也与频谱在中间浓度相比,评估重叠因子(匹配因素),也不得小于900/1000。
3.1。精密度和准确度
定量验证方法验证了根据附件III欧盟规定的2017/625。浓度的测量不确定性表达,需验证(0.5毫克/公斤的检测极限),使用β错误(假阴性)结果小于或等于5%(统计确定性1−β= 95%)。
3.1.1。特异性、检测和量化
特异性评估将整个测试方法应用于固体和液体样品的20个空白样品。所有样品都显示在分析物色谱峰保留时间。
检验检测能力,20个空白样品提取和相对20强化值为0.5毫克/公斤治疗和注射2分析会议。在强化样本,伊维菌素的色谱峰保留时间是强调,而空白样品没有显示任何伊维菌素色谱峰的保留时间。因此,5%的最大可容忍的误差是尊重。检测极限(LOD)被设定为0.25毫克/公斤和测试实验。
量化的极限(定量限)是建立在0.5毫克/公斤。通过测试实验验证在强化饲料在量化的限制在六个独立的副本。
3.1.2。精度
精度通过三级评估方法的回收率范围内。精度评估通过计算标准差和变异系数(%)进行6复制测试的每个浓度水平。
线性度是评价理解方法的应用领域(0.5 -10毫克/公斤)。在校准期间,r2伊维菌素的获得是0.9999。特异性评估将整个测试方法应用于6空白样品。测试进行了验证成为可能缺乏一个仪器响应的保留时间。
3.1.3。不确定性
不确定性是表示为最大扩展相对不确定性。表达的不确定性,实际的自由度(v),使用Welch-Satterthwaite公式计算,计算覆盖率(k),和95%的置信水平(p)被认为是。这些参数在表中做了总结1。
从上面的不确定性,我们计算结果的不确定性(C)使用以下方程:
3.2。方法验证
验证该方法用于筛选和确认。
筛选验证、选择性、专一性和量化限制被20个独立验证分析空白饲料样品和空白饲料样品飙升的20个独立分析量化限制浓度保持在0.5毫克/公斤。相同的是饮用水:20个独立分析空白水样和20个独立的分析量化空白水样飙升的极限浓度保持在0.5毫克/公斤。该方法也适用于这个矩阵。
方法的适用性进行了研究饲料矩阵,和浓度范围从量化的限制,0.5毫克/公斤,10毫克/公斤,考虑药用饲料中伊维菌素的含量。进一步的实验表明,该方法研究土壤矩阵时也很有用。事实上,当土壤干和分析以同样的方式作为饲料,足够的恢复率在上升。
线性度是评价覆盖整个范围的应用程序的方法。每个校准曲线(图3),选择五个浓度水平(0.5、1、2、5和12.5毫克/公斤)和各个层面上复制三次。校准曲线用最小二乘法回归分析得到。使用方差分析的方法研究获得的数据集。精化表明,线性回归是非常重要的( ),截距值没有显著不同于零,和相关系数值(> 0.999)表示出色的线性度。
选择性和特异性进行评估通过分析六个样本不同的饲料和通过分析物质的确认没有类似于伊维菌素的保留时间。
检出限是固定和验证定量限的一半价值通过分析六个饲料样品在0.25毫克/公斤。
量化限制是固定和验证在0.5毫克/公斤一半的最小量化CReAA推荐的浓度水平。其他验证方法涉及信用证在不同矩阵已达到低敏感性通过使用不同的探测器,例如,被Morbidelli女士等人在等离子体达到0.5 - -20.0 ng / mL范围(17),歌顿等人在干血滴看到1 ng / mL的浓度(16),Duthal等人谁能检测范围0.5 e -60磅的牛奶中20.]。Asbakk等人,伊格莱西亚斯等人用荧光检测器灵敏度达到−5点2000 ng / g和1 - 2000 ng / g,分别为(12,13]。
确定真实性,精度、恢复和可重复性,空白的饲料样品因为没有认证的参考资料可供使用伊维菌素。详细:空白饲料样本飙升,萃取过程的开始之前,与伊维菌素三种不同浓度水平,和6独立副本进行每个水平飙升。
坚固性和再现性进行评估使用持续的数据。强度验证了通过比较处理质量控制样品由不同运营商不同环境条件下和在不同时间和不同批次的材料标准和实验室。分析方法被发现粗糙,质量控制结果计划操作条件下是稳定的。再现性CV %,计算从40进行质量控制的数据,是8.40%。
4所示。结论
本文提供的高效液相色谱方法允许伊维菌素含量的检测和量化不同的矩阵通过创建一个校准曲线和使用doramectin作为过程标准。这种验证方法很简单,廉价,精确和可重复的,它需要非常少量的样本。
它可以很容易地用来检测固体和液体中伊维菌素矩阵监控和环境的目的。事实上,这种方法可以参考生态毒性研究环境污染物的控制方法基于伊维菌素。进一步的研究可能会使用相同的分析扩展适用于其他大环内酯或类似分子相同的矩阵。
缩写
| 简历: | 变异系数 |
| 爸爸: | 二极管阵列检测器 |
| 应急服务国际公司: | 电喷雾电离 |
| 高效液相色谱法: | 高效液相色谱法 |
| LC: | 液相色谱法 |
| LOD: | 检测极限 |
| 定量限: | 量化的限制 |
| MRLs: | 最大残余的限制 |
| 女士: | 质谱分析 |
| RT: | 保留时间 |
| SPE: | 固相萃取。 |
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者感谢史Zooprofilattico Sperimentale德拉伦巴蒂大区e戴尔'Emilia大区的布鲁诺Ubertini布雷西亚的技术支持和富有成效的合作。这个项目是通过当地的研究基金资助(FIL)在2021年由帕尔玛大学提供的。