文摘

这项研究的主要目的是建立的抗炎、镇痛spectrum-effect关系珠兰柳杉林(灰色)Solms-Laub (CF),揭示的抗炎、镇痛作用的药效学基础CF。十批CF的指纹从各种来源建立了高效液相色谱法(HPLC)和评估的相似性,分层聚类分析(HCA)和主成分分析(PCA)。CF的抗炎、镇痛效果进行评估与xylene-induced小鼠耳肿胀和醋酸扭力测试,而抗炎和镇痛spectrum-effect CF的关系是由灰色关联度分析评估(GRA)和偏最小二乘回归(PLSR)分析有效地阐明CF的抗炎、镇痛物质基础。十批CF高效液相色谱指纹成立于这项工作成功确认共有13常见的山峰,指4组件,峰1是新绿酸,峰3绿原酸,5 cryptochlorogenic酸,峰值和峰值10 rosmarinic酸。HCA结果CF的10批样品展示集群分为3类,这是与主成分分析结果一致。spectrum-effect关系的同时,结果也表明,新绿酸,绿原酸,cryptochlorogenic酸,和rosmarinic酸的抗炎、镇痛物质CF。为了更好地理解CF的抗炎、镇痛物质基础,这个实验建立了抗炎、镇痛spectrum-effect CF的关系,可以为质量评价提供科学基础和进一步的研究以及CF草药的使用。

1。介绍

珠兰柳杉林(灰色)Solms-Laub (CF)是一种多年生草本植物,可以主要发现在中国的东部和南部地区。同时,它也是一个相对常见草药瑶族人民在中国。它具有分散风和寒冷的功效,激活血液循环,缓解疼痛,排毒,减少肿胀1,2]。同时,普遍采用临床治疗类风湿性关节炎,瘀伤,疼痛和肿胀以及慢性肠胃炎。目前,这种草药的研究主要集中在它的化学成分,但研究其抗炎和镇痛效应的物质基础还没有全面检查(3,4]。

炎症是将军,复杂的免疫系统的生理反应外部挑战或组织损伤。炎症反应的发生有助于伤口的愈合。然而,当炎症是过度或不可控,异常和长期的炎症反应将不可避免地导致各种疾病(5- - - - - -7]。疼痛是炎症的主要特征之一,是由国际疼痛研究协会为一种不愉快的感觉和情感体验,常与实际或潜在的组织损伤(8- - - - - -10]。同样,也有大量研究,揭示了一个明确的炎症和疼痛之间的联系。因此,研究炎症和疼痛的发病率已经不可避免地变得越来越普遍在世界范围内(11- - - - - -13]。

非甾体抗炎药布洛芬和对乙酰氨基酚等,已被证明具有满意的抗炎、镇痛效果,但也有自己的局限性,目前是最受欢迎的抗炎、镇痛药物(14,15]。他们最常见的缺陷之一是胃肠道损伤主要是由于药物本身的刺激可引起胃肠道损伤包括消化不良、恶心、呕吐、腹部剧烈疼痛(16,17]。因此,这绝对不是我们希望实现的目标。因此,有必要研究和开发新的高效低毒的抗炎、镇痛药物。同时,其作用的药理基础也应该阐明。

近年来,高效液相色谱法(HPLC),优秀的分离效率的优势,迅速分析速度,和优秀的检测灵敏度,已广泛用于中药的质量评价。这种技术允许快速定性和定量的分析组件的样品分析(18- - - - - -20.]。为了更精确地反映复杂的化学信息包含在中国传统医学(中医),指纹识别技术是利用中医系统地表征中药的化学成分的角度来看中医的整体化学物质基础,主要由高效液相色谱方法。通过结合指纹识别与药理作用相关的统计方法,中药的活性成分功能可以有效地筛选[21,22]。在目前的研究中,上述方法有机地结合起来,揭示了抗炎、镇痛的有力物质CF多维的方式。

基于早期筛查抗炎和镇痛功效,CF与最优的水提物的抗炎、镇痛效果被选为指纹调查,和CF水提取物的指纹图谱建立了使用高效液相色谱技术。CF水提物的指纹来自十个不同的起源相似度进行评估,层次聚类分析(HCA)和主成分分析(PCA);CF水提物的抗炎、镇痛活动进行了通过构造一个xylene-induced小鼠耳肿胀模型和醋酸扭在老鼠身上测试。灰色关联分析(GRA)和偏最小二乘回归分析(PLSR)是用来检查抗炎、镇痛spectrum-effect关系。这项研究提供了一个科学依据显示CF的抗炎、镇痛物质。

2。材料和方法

2.1。材料和试剂

如表所示1,十批CF药草来自不同地区的广西,中国,并验证了实验主义者朱伊琳的广西中医药大学,广西,中国。Rosmarinic酸(批号:RP190718)、绿原酸(批号:RP190505) cryptochlorogenic酸(批号:RP2101101)和新绿酸(批号:RP200416)购买从成都麦迪逊科技有限公司有限公司,纯度≥99.97%;甲醇,乙醇,冰醋酸是分析纯,超纯水(实验室自制),乙腈(色谱酒精,Fisher)和甲醇(色谱酒精,Tedia)。

2.2。动物

SPF-grade昆明繁殖老鼠(公里)由湖南屠杀Jingda实验动物有限公司有限公司实验动物生产许可证。SCXK(湘)2019 - 0004。实验协议是实验动物伦理审查委员会批准广西中医药大学是严格按照有关规定进行伦理审查批准。dw20201025 - 137。

2.3。制备标准溶液和样品溶液

绿原酸、新绿酸、cryptochlorogenic酸,rosmarinic酸准确称重和溶解在甲醇混合标准解决方案,包含219.2做准备μ282.8克/毫升的新绿酸,μ244克/毫升的绿原酸μ克/毫升cryptochlorogenic酸,和343.2μ克/毫升rosmarinic酸。

在指纹识别部分,2 g的CF粉重量精确;25.00毫升的水添加精确,放置在一个烧瓶,称重和回流1 h,然后再冷却,体重的重量。随后,CF方案测量是通过彻底动摇了混合,过滤,然后将滤液通过0.22μ米微孔膜。

CF草本植物在抗炎、镇痛实验,利用他们切成1厘米的块,重500克,加入蒸馏水(固液比1:10),和浸泡30分钟。他们然后在回流提取两次每次1.5小时,透过医疗纱布、组合和集中到一个输液,使用后用蒸馏水稀释到相应的浓度。

2.4。色谱条件

列(UltimateXB-C8, 4.6×250毫米,和5μ米)是利用甲醇(A): 0.1%乙酸水溶液和(B)作为流动相梯度洗脱:0∼5分钟,5%∼9%(一个);5∼13分钟,9%∼11%(一个);13∼17分钟,11%∼20%(一个);17日∼27分钟,20% - -23%(一个);27-41 min, 23% (-25%);41-47 min, 25% (-36%);47-54 min, 36% (-43%);54 - 80分钟,43% - -65%(一个);检测波长295 nm;体积流率0.8毫升/分钟; column temperature 30°C; and injection 10 μl

2.5。验证的方法

样品溶液的CF (S1)准确地准备按照样品制备方法在“2.3”指纹识别。接下来,样本注入六次根据色谱条件在“2.4”和精度检查。同样,CF (S1)解决方案的稳定性研究了样品制备和色谱条件在“2.3”和“2.4”在0 h, 2 h, 4 h, 8 h、12 h和24小时。随后,CF (S1)解决方案的六个复制注射,和CF的再现性(S1)解决方案进行了研究。

2.6。建立和评价指纹

样品制备过程中所描述的“2.3”实施十批CF准备样品,和“2.4”中描述的色谱条件应用于确定并获取相关的资料。“中药色谱指纹图谱评价体系(2012年版)”是用来分析十批CF的高效液相色谱指纹样本。同时,叠加光谱和常见模式的10批CF样本获得使用S1模式作为参考模式,和生成的控制模式R是用作参考。一般相似的评价。最后,HCA和主成分分析应用到每个源的指纹档案23]。

2.7。抗炎试验

120年昆明小鼠,在18到22岁的克重,被随机分配到12组(n= 10,包括5个男性和女性)。随后,十CF水提物组各种来源(7.28 g / kg),积极组织(地塞米松0.006克/公斤)、模型组(蒸馏水)单独设置,和每个小组管理20毫升/公斤毒品七天每天一次。老鼠的右耳是统一处理20μL(二甲苯上届政府后45分钟,而左耳不及时治疗。经过30分钟的炎症,老鼠被处决,圆头戴式耳机和一个直径6毫米射孔器穿孔在相同的双耳,重的一部分,和体重的差异之间的左和右耳机是利用肿胀的程度。肿胀程度和肿胀抑制率计算根据以下公式,分别为(24]:

肿胀抑制率(%)=(模型组耳swelling-administration组耳肿胀)/模型组耳肿胀×100%。

2.8。止痛剂测试

120年昆明小鼠,在18到22岁的克重,被随机分配到12组(n= 10,包括5个男性和女性)。与下列每组成立:模型组(蒸馏水),积极组(0.05 g / kg杜鹃),和水提物组(7.28 g / kg)的十各种来源的CF。每组管理20毫升/公斤的毒品七天每天一次。同时,0.6%的醋酸溶液(10毫升/公斤)是上届政府后腹腔内1小时服用。老鼠扭转时间在15分钟内计算,止痛剂抑制率是决定使用以下公式(25]。

止痛剂抑制率(%)=(扭力乘以模型group-torsion管理集团)/打滚时间的模型组×100%。

2.9。评价抗炎镇痛Spectrum-Effect关系

2.9.1。灰色关联分析(GRA)

灰色关联分析是一种研究方法,艾滋病在决策过程中通过检查数据相关性的大小(父序列之间的关联度和子序列)和测量数据之间的关联程度的相关性。抑制小鼠耳肿胀和小鼠扭的抑制率作为父序列,和常见的指纹峰的峰面积的10批CF作为子序列。与此同时,相应的数据记录处理Y(k),习(k)。原始数据处理,根据公式计算(2)成功地获得之间的差异的绝对值Y (k)和习(k),分别。相关系数通常是用来表示2比较序列之间的关联程度,即它可以达到用绝对值计算不同系列的数据到公式(3),歧视系数ρ(0∼1)被选为0.5。关联度(r)是两个相关性之间的关联程度,并计算相关系数带入公式(4)计算各共有峰之间的关联程度和CF的抗炎、镇痛作用26]。关联度大于0.6时,它表明,色谱峰所代表的化学成分与药理相关指数;关联度大于0.8时,它表明,色谱峰所代表的化学成分与药理指标有很大的相关性;关联度大于0.9时,它表明,色谱峰所代表的化学成分与药理是非常相关的指数:

2.9.2。偏最小二乘回归(PLSR)分析

PLSR是一种统计方法,结合线性回归分析、典型相关分析和主成分分析。通过建立回归方程和回归系数和VIP值比较,常见的山峰功效的贡献相结合可以准确的反映。的趋势可以确定每一个共有峰对疗效的影响从积极和消极的回归系数值,在一个积极的价值意味着共同的峰值与疗效呈正相关,一个负值意味着它是疗效呈负相关。变量重要性PLSR投影(VIP)的一个重要指标反映了自变量对因变量的解释能力,值越大,越强自变量对因变量的解释能力。人们普遍认为当VIP > 1时,自变量在解释因变量显著的重要性。每个共有峰的峰面积的指纹被利用为自变量X。CF的抑制率水提物对小鼠耳肿胀以及抑制小鼠的镇痛率利用作为因变量Y。同时,抗炎、镇痛的PLSR spectrum-effect CF关系成功执行使用SIMCA 14.1软件(27]。

3所示。结果

3.1。方法验证的高效液相色谱指纹图谱

峰值10 (rosmarinic酸),选为参考峰评估高效液相色谱指纹图谱方法,具有良好的稳定性和一个适当的峰面积。结果表明,方法具有较好的精度,稳定性和重复性和CF指纹是可以接受的,因为标准偏差的相对保留时间和相对峰面积的其他12峰值小于3%。数据1和2显示十批的高效液相色谱指纹和参考色谱CF样本。13峰,分离是指定为常见的山峰。四个山峰在指纹识别,峰1是新绿酸,峰3绿原酸,高峰5 cryptochlorogenic酸,和峰值rosmarinic酸(图103)。最终,峰值10 (rosmarinic酸)被选为参考峰(年代),为每一个共有峰的相对保留时间在十批CF样本计算小于0.64% (n= 10),表明样本之间的重现性是令人满意的;表中给出的结果2。然而,RSD的相对峰面积范围从23.13%到50.65% (n= 10)与大波动,表明样品的coconstituents CF的内容来自不同来源的差异很大。相关结果显示在表中3。

3.2。指纹的相似性分析

整体相似度评估参考指纹(R)(表4)。之间的相似的指纹档案起源和参考指纹(R)大于0.900,这表明CF的制备方法是稳定的,起源之间的偏差很小。因此,它能够满足指纹识别研究的要求。

3.3。统计分析的指纹

3.3.1。层序聚类分析(HCA)

利用SPSS26.0软件,峰地区13个常见的山峰在十批CF样本作为变量,和群际连锁聚类方法选择,其次是集群的平方欧氏距离的度量。结果呈现在图4。分类距离10时,十批CF样品可以分为三类。其中,样本S1, S3, S5, S7、和S9聚集成类1和样品S2, S4,和S6聚集到二班,而其余样本聚集成类3。聚类结果反映,有某些差异10批CF样本,表明环境因素在不同起源的差异可能主要影响因素的质量差异。

3.3.2。主成分分析(PCA)

利用主成分分析法(PCA)的特征值和方差贡献率测定SPSS26.0软件使用高峰地区13个常见的山峰从十批CF样本的变量。结果显示在表中5。使用特征值> 1为准绳,得到了三个主成分的累积方差贡献83.40%,代表的大部分信息的样本。因此,十批CF样本评估使用前三个主要组件作为指标。根据表6因子载荷矩阵,描述了常见,常见的山峰1,2,3,5,6,7有明显积极的载荷在第1主成分中,而山峰4和9主成分2中有明显的积极的载荷。从图5,它可以观察到,十批CF样本可以分为3类。其中,样本S1, S3, S5, S7、和S9聚集成类1和样品S2, S4, S6聚集到二班,而样本S8和S10聚集到3班,这与聚类分析的结果是相一致的。

3.4。抗炎试验的结果

与模型组相比,每个来源的耳肿胀水提物组显著降低,差异具有统计学意义( ),和抗炎抑制率大于35%。其中,抗炎抑制率高于S2, S3, S6,每个来源水提物组的抑制率小于正集团(地塞米松)。因此,这表明CF的水提物组能降低小鼠耳肿胀,具有一定抑制作用xylene-induced炎症。然而,他们的抗炎效应相对较弱的比积极的团体,见下表7和图6。

3.5。镇痛试验的结果

与模型组相比,扭转的数量显著降低( )在CF水提物组十个不同来源,及其镇痛抑制率都大于37%,水提物组抑制率的S2, S3, S6大于48%。与其他来源相比,止痛剂抑制率较低在S8和S10,分别为37.53%和38.08%。与积极的组织(罗通定)相比,CF的止痛剂抑制率水提物组低于积极的群体,除了S6的CF水提物组。同时,实验结果还表明,十批CF水提物组能够有效减少小鼠醋酸段痛的影响,如表所示8和图7。

3.6。灰色关联分析(GRA)之间的CF指纹及其抗炎、镇痛的活动

常见的贡献的山峰CF水提物对小鼠耳肿胀的影响可以观察到从表9色谱法的顺序:12 > 3 > 10 > 7 > 11 > 5 > 1 > 4 > 6 > 2 > 8 > 9 > 13,和所有的相关峰除了13峰值大于0.6。常见的贡献的山峰CF水提物对小鼠的影响扭转可以观察到表10色谱法的顺序:10 > 4 > 3 > 9 > 11 > 8 > 12 > 7 > 1 > 5 > 6 > 2 > 13,和所有的相关峰除了13峰值大于0.6。结果表明,CF的抗炎、镇痛作用是多种化合物的共同作用的结果。化合物由常见的山峰,除了13日峰值是CF的抗炎、镇痛作用密切相关。

3.7。偏最小二乘回归(PLSR)分析

3.7.1。之间的PLSR CF指纹和其抗炎活性

利用每个共有峰的峰面积的指纹作为独立变量X和CF的抑制率水提物对小鼠耳肿胀的因变量Y的PLSR分析其抗炎spectrum-effect关系进行使用SIMCA 14.1软件,和获得的回归方程Yx1 + 0.1108 x2 = 0.1259 + 0.1321 x3−0.0112 x4 x6 0.1277 + 0.1060 + 0.1273 x5 + x7−0.0909×8 + 0.0599 * 9 + 0.0470 x10 + 0.0274 x11 + 0.0664 x12−0.011 * 13。模型参数的值R2X、R2Y和Q2是0.515,0.704,和0.595,分别。在图8山峰4 8和13是负相关的抗炎效应,而其他的山峰与抗炎效应呈正相关。在图9山峰的VIP值1、2、3、5、6和7是大于1,表明这些山峰对小鼠的抗炎效果有显著的影响,其中峰值1被确认为新绿酸,峰2绿原酸,和峰5 cryptochlorogenic酸,CF水提物的抗炎能力显著增强其内容时增加。

3.7.2章。PLSR CF指纹和其镇痛活性

通过使用每个共有峰的峰面积的指纹作为自变量X和CF的止痛剂抑制率水提物对小鼠作为因变量Y,从PLSR获得回归方程分析镇痛spectrum-effect利用SIMCA 14.1软件的关系可以表示为Yx1 + 0.1104 x2 = 0.1629 + 0.1654 x3−0.0885 x4 x6 0.175 + 0.0985 + 0.1538 x5 + x7−0.0437×8 + 0.1758 * 9 + 0.0715 x10−0.0657 x11 x12 + 0.1123 * 13 + 0.1001。模型参数的值R2X、R2Y和Q2是0.761,0.987,和0.940,分别。提出了图10山峰8和11镇痛效果,呈低度负相关,而其他的山峰与镇痛效果呈正相关。在图11,山峰的VIP值1,2,3,5,6,7都大于1,表明这些山峰有更显著的影响小鼠的镇痛疗效,其中峰值1被确认为新绿酸,峰2绿原酸,和峰5 cryptochlorogenic酸,CF水提物的止痛能力也显著增强其内容时增加。

4所示。讨论

在指纹部分,各列,波长,流速,温度,和移动阶段检查和色谱条件能够最全面描述信息的CF样本选择为了产生丰富的化学信息的高效液相色谱指纹图谱(28]。十批CF的共同山峰被确定在同一时间。总共有四个组件识别,峰1是新绿酸,峰3绿原酸,最高5 cryptochlorogenic酸,和最高10 rosmarinic酸。相似度分析的结果提出的指纹档案十批CF与参考资料相比,相似度计算结果高于0.928,表明之间的化学成分有差异内容CF水提取物,这可能是由于不同的起源,季节,气候、收获时间,增长条件下,样本之间和成熟。CA和主成分分析的结果表明,所有CF的10批样品与S1分为三类,S3, S5, S7、和S9类别,S8和S10类别,和S2, S4, S6一类。因此,这清楚地表明,该方法可以用于CF样品的质量评价。

抗炎spectrum-effect关系的研究,深刻的结果提出了共同的山峰的相关性有助于抗炎效应被列为12 > 3 > 10 > 7 > 11 > 5 > 1 > 4 > 6 > 2 > 8 > 9 > 13日峰13除外,所有的山峰都大于0.6的相关性。PLSR还提出,山峰4 8和13是负相关的抗炎效应,而其他的山峰与抗炎效应呈正相关。VIP值被评为5 > 3 > 7 > 1 > 2 > 6 > 8 > 9 > 12 > 13 > 11 > 10 > 4,而贵宾的高峰值1,2,3,5,6,7都大于1。

镇痛spectrum-effect关系的研究中,在草地的结果提出相关的常见的山峰,有助于镇痛的订单10 > 4 > 3 > 9 > 11 > 8 > 12 > 7 > 1 > 5 > 6 > 2 > 13,和所有的相关峰值大于0.5。PLSR还提出,山峰8 - 11与镇痛负相关,和其他的山峰与镇痛呈正相关。的VIP值峰值被列为7 > 3 > 5 > 1 > 2 > 6 > 8 > 9 > 4 > 10 > 13 > 12 > 11,其中VIP的高峰值1,2,3,5,6,7都大于1。

通过上述两种分析方法结合,CF的抗炎、镇痛作用可能是几个组件的共同作用的结果。峰1、2、3、5、6和7的基础可能是CF的抗炎、镇痛物质。其中,峰1是新绿酸,2是绿原酸,峰值和峰值5是cryptochlorogenic酸。所有这些已报告拥有满意的抗炎、镇痛活动相关文献[29日- - - - - -31日]。此外,这项数据处理的结果表明,峰值的VIP价值10 (rosmarinic酸)不大于1,但是文献表明rosmarinic酸是一个活跃的抗炎、镇痛成分药草和也的质量控制指标之一Sarcandrae草CF家族的植物(32,33]。因此,rosmarinic酸也应该CF抗炎、镇痛的物质。最后,所确定的其他色谱峰不成功,今后需要进一步深入研究。

5。结论

CF是一种广泛使用的药用植物受雇于姚明在中国的民族。它已经成功地用于临床治疗一些炎性疾病,示威的草药的强有力的抗炎、镇痛效果。在这项研究中,来自不同来源的十批CF的指纹被建立,共有13个常见的山峰被选择,其中4组件被确定。相似度分析的结果显示,每个来源的指纹档案之间的相似性和参考资料(R)大于0.900。因此,这表明CF的制备方法是稳定,起源之间的偏差相对较小,这是符合指纹识别研究的要求。同时,CF的抗炎、镇痛活动也全面评估与二甲苯耳肿胀试验和醋酸扭试验,结果呈现,CF拥有满意的抗炎、镇痛的活动。CF的抗炎、镇痛spectrum-effect关系建立了GRA和PLSR相结合,即表明新绿酸,绿原酸,cryptochlorogenic酸,和rosmarinic酸可能是抗炎、镇痛CF的有力物质。因此,本研究作为基础和提供了一个科学依据CF质量标准的建立以及他们的进一步开发和利用。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究的项目是由广西中医药大学“Guipai Xinglin年轻人才”培训项目(2022 c032),广西高等教育学校成千上万的中青年骨干教师培养计划项目,广西一流的中医学科(Gui教科书研究[2018]12号),协同创新中心的壮族和姚明医学(Gui教科书研究(2013)20号),广西壮族和姚医学重点实验室(Gui Ke霁子(2014)32号),广西英航Gui学者研究项目创新理论和药理中药的有效性(J13162),广西壮族医学重点学科(Gui教科书研究(2013)16号),国家重点研发项目(2019 yfc1712304),国家中医药管理局高级中医药重点学科(壮族药房)建设项目(中医教学信(2022)226号),和广西中药多学科跨学科创新团队项目(GZKJ2309)。