文摘

一个简单的和敏感的战略使用cyclodextrin-modified胶束电动色谱与二极管阵列检测器同时分离和测定的开发和应用九组件Sanyetangzhiqing (SYTZQ)降糖和降血脂药的代理。几个重要的参数影响分离性能使用单变量方法进行评估和优化。在最优条件下,九个组件的基线分离,包括四类黄酮(hyperoside、异槲皮苷、quercetin-3 -O-glucuronoside和黄芪甙),4个酚酸(绿原酸、rosmarinic酸、salvianolic酸B,和lithospermic酸),和一个monoterpenoids(芍药苷),是实现在不到16分钟。校准曲线的相关系数超过0.9996的所有分析物。盘中、interday精度范围从0.4%到4.8%和1.7%到5.0%,分别。复苏的不同分析物从95.3%降至105%。验证结果以及应用分析SYTZQ样本演示了该方法的适用性,从而提供了一个有效工具SYTZQ的质量控制。此外,短时间内消耗的优点,能耗低,效率高,低成本,这种方法的确定和质量评价奠定了基础在中药多组分化合物。

1。介绍

近年来,糖尿病的发病率,代谢性疾病,其主要特征是血糖水平的增加,是逐年增加1]。由于精确的优势疗效、安全、稳定、中药(中药)准备已引起广泛的关注2- - - - - -4]。为了降低患者的血糖水平,院士张勃利提出了Sanyetangzhiqing中药复合制剂(SYTZQ)组成桑叶(桑属阿尔巴l .)Crataegi叶(山楂Bge.var。主要N.E.Br。或Grataegus pinnatifida知母。),荷叶(莲属椰子Gaertn),鼠尾草Miltiorrhizae基数等根茎(丹参),知母和Paeoniae基数Rubra(芍药属ladiflora棺罩。或芍药属veitchiiLynch) [5]。相关的药理实验表明广泛的复合制剂的药理作用,包括antihyperlipidemia antihyperglycemia,抗氧化应激(6- - - - - -8]。作为糖尿病的专利新药,SYTZQ已进入二期临床试验;临床前研究表明显著降低血糖和血脂水平异常KK-AY模型小鼠遗传II型糖尿病(9- - - - - -11]。然而,由于不同的四个字符,五个口味,和渠道分布,中医总是扮演君主,部长助理,在准备和指导角色兼容性,机制还不清楚,药效物质是复杂的。因此,迫在眉睫的是阐明SYTZQ的机制和药效学物质基础,建立完善的质量评价和分析方法。

内容确定SYTZQ组件质量评价是一个重要的依据。迄今为止,定性和定量分析方法在SYTZQ各种组件,如salvianolic B酸,绿原酸、芍药苷,已建立,主要包括液相色谱(LC)和LC串联质谱(MS),根据其质量和定量指纹设计理念建造(12- - - - - -14]。然而,很少有相关报道在SYTZQ多组分的同时测定。鉴于此,有必要建立一个准确、高效的多组分技术提高分析质量的决心。

毛细管电泳(CE)是一个小型化分离技术提出了几个优点:减少了试剂的使用,特别是有机溶剂,减少环境污染和成本,最低消费的样品,分离效率高,通用性高对背景电解质的组成(知母),因此可以适应不同性质的化合物(15]。作为一种常见的检测方法,通常是用于中药的研究和相关复合制剂。运作模式中,胶束电动色谱(MEKC)是最受欢迎的和灵活的方式,结合色谱法的原理和优点和CE,这意味着它进一步扩展了范围的电泳分离中性化合物(16- - - - - -19]。

然而,在MEKC,疏水或阳离子溶质往往是完全纳入胶束或强烈与胶束,因此不能简单的分离胶束溶液(20.]。cyclodextrin-modified MEKC方法使用环糊精(CD)加上一个离子胶束的解决方案和解决了这个问题通过建立两个伪稳态阶段的电解液。使用CD MEKC可以提高高度疏水溶质的分离,和精心调制系统的选择性提供了一个很好的解决甚至要求很高的分析物(21),在复杂系统的分析中医方面显示了很大的优势。cyclodextrin-modified混合胶束电动毛细管色谱方法开发的同时分离和测定三石杉碱甲生物碱,也就是说,石杉碱甲,石杉碱甲B, C石杉碱甲在Huperzia serrata [22]。这样,繁琐的样品制备是避免和满意的决议。通过使用这种方法,五个具有类似结构也分开在大黄蒽醌类在很短的时间内(23]。

这里,我们关注一个简单的和敏感的发展CD-MEKC方法确定潜在的抗糖尿病的组件的内容SYTZQ其质量评价研究提供依据。考虑中药成分的复杂性,MEKC模式一直雇佣和十二烷基硫酸钠(SDS)与羟丙基-β环糊精(HP -βcd)作为伪稳态阶段。一些典型的pH值等参数的影响和运行缓冲液的浓度,浓度的三种添加剂(SDS、HP -βcd,和ACN),分离电压检测和优化。最后,发达MEKC-DAD方法验证和应用在SYTZQ九组件的决心,使它成为多组分中药及其复方制剂质量评价系统。据我们所知,这是第一个报道研究使用cyclodextrin-modified MEKC-DAD SYTZQ的分析也是一个方法能够同时定量分析大多数类型的组件。

2。实验

2.1。化学药品和试剂

标准化合物,芍药苷、绿原酸rosmarinic酸、异槲皮苷,quercetin-3 hyperosideO-glucuronoside salvianolic酸B、lithospermic酸和黄芪甙(纯度> 98%),从成都Desite购买生物科技有限公司(成都,中国)。分析年级十二烷基硫酸钠(SDS)和羟丙基-β-cyclodextrinthe (HP -βcd)采购从Solarbio生物技术有限公司有限公司(中国,北京)。磷酸二氢钠(不2阿宝4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、氢氧化钠(氢氧化钠)和磷酸(H3阿宝4)(85%)由Kemiou化学试剂有限公司,有限公司(天津)。HPLC-grade甲醇和乙腈(ACN)获得热费希尔科学(美国马)。超纯水被Milli-Q净化学术水净化系统(微孔、马、美国)。

5批SYTZQ(平板电脑)都来自中药研究所,天津中医药大学研究员Yanxu Chang和审阅。

2.2。装置

所有CE实验进行一个安捷伦公元7100年系统配备了二极管阵列检测器(Waldbronn,德国)。安捷伦ChemStation软件被用来控制仪器和分析结果数据。电泳缓冲的pH值调整了Mettler-Lido FE20酸度计(上海,中国)。样本涡使用xw - 80设备(上海,中国)。超声波清洗机(kq - 250 e、昆山、中国)和两个余额(BP121S、缝匠肌、德国,AX205梅特勒-托利多,瑞士)也使用。

2.3。这个程序

样品分析在一个裸露的熔融石英毛细管柱(瑞风、河北、中国)的总长度60厘米(有效长度52厘米)×50μm身份证新的毛细管预处理顺序由第一次冲洗1 m氢氧化钠(30分钟),0.1 m氢氧化钠(30分钟),和去离子水(30分钟)935 mbar。每一天,在开始实验之前,毛细管冲洗先后在930 mbar 1 M氢氧化钠,0.1 M氢氧化钠,和去离子水10分钟,分别,然后条件与背景电解质(知母)10分钟。

随后,样本水动力地注射50 mbar 5 s。进行了分离与知母(30毫米包含40毫米SDS磷酸盐缓冲剂,7.5毫米惠普-βACN cd,和10%,pH值7.0)。电泳分离是−20 kV,和温度控制在22°C。之间运行时,列0.1氢氧化钠得脸都红了,去离子水,分别和知母3分钟。每天结束时,毛细管被先后为0.1 M氢氧化钠和去离子水在930 mbar 10分钟。

2.4。准备的标准和质量控制样品

芍药苷和salvianolic酸B分别重为5.0毫克,分别用甲醇溶解最终浓度为5.0 mg / mL股票的解决方案。绿原酸的标准股票的解决方案,rosmarinic酸、异槲皮苷,quercetin-3 hyperosideO -glucuronoside、lithospermic酸和黄芪甙准备甲醇最终浓度为2.0毫克/毫升。最终,一系列浓度的线性标准解决方案以50%甲醇。

SYTZQ样本与去除涂层被磨成粉末,通过一个80 -孔筛。然后,粉末是准确称重200毫克至10毫升瓶和稀释50%甲醇体积。超声提取的混合物进行45分钟在360 W。冷却后,解决方案是需要补偿对失重50%甲醇。随后,提取液离心机在14000 r / min 10分钟,然后储存在4°C,供以后使用。

3所示。结果与讨论

3.1。优化成分知母

用胶束作为伪稳态阶段,分析物由微分分区之间的胶束相,水相MEKC [21]。由于表面活性剂的特点,离子化合物和可以通过MEKC分离中性化合物,尤其适用于复杂化合物的分析从中药中提取(24]。因此,在这篇文章中,CE的MEKC模式被选中在SYTZQ检测和分离的组件。获得最佳的分析结果,有几个因素,极大地影响了分离进行了研究。

3.1.1。pH值的选择

PH值,一个关键因素影响化合物的电泳淌度,首先调查了从6.5到7.5不等与磷酸盐缓冲剂的解决方案包含40毫米SDS 30毫米,7.5毫米惠普-βACN cd,和10%。见图1(一),预计减少迁移时间和增加观察pH值在研究范围内,由于电渗流量增加(EOF)。不幸的是,迁移时间的缩短影响化合物的决议。结果表明,该决议山峰之间最佳pH值7.0。pH值低于7.0时,该决议rosmarinic酸与hyperoside (pH值6.5)或quercetin-3 -O-glucuronoside salvianolic酸B (pH值6.75)较差。然而,当pH值超过高于7.0,增强EOF引起迁移时间的减少,以及解决。集体、磷酸盐缓冲pH值7.0进一步用来产生更好的结果。

(一)
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(b)
(b)
(c)
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(d)
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(e)
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(f)
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图1
每个参数对9个化合物的迁移时间的影响:(a)缓冲pH值,(b)磷酸浓度、SDS浓度(c), (d)惠普-βcd浓度,(e) ACN内容,(f)分离电压。
3.1.2。缓冲浓度的选择

缓冲区在不同浓度的影响(20 - 40毫米)被调查。一般来说,更高的缓冲浓度提供了一个更好的缓冲能力,进而影响分离的行为包括决议,迁移时间,和峰的形状,还可以提高测定重现性(25]。如图1 (b),迁移时间与浓度增加缓冲。这可能是由于EOF和离子强度之间的比例26],通常扩展迁移时间和提高分析物的分离与相似的电泳迁移率(27]。当浓度达到30毫米,分辨率和检测灵敏度下降,因为强大的焦耳加热和峰值变形发生。最后,选择30 mM由于对称峰形状和高分辨率。

3.1.3。SDS浓度的选择

MEKC, SDS常常被添加到运行缓冲提供胶束伪稳态阶段,和SDS和水相之间的分析物的分布有明显的影响分辨率和迁移时间。所以,SDS浓度对分析物的分离是至关重要的。摘要SDS浓度设置为30,35岁,40岁,45岁和50毫米。发现该决议增加从30到40毫米SDS浓度增加,然后下降50毫米(图1 (c))。绿原酸之间无法得到基线分离,rosmarinic酸,hyperoside,异槲皮苷在SDS浓度30或35毫米。浓度的SDS 40毫米时,基线分离和良好的实现了所有九个分析物的峰形状。然而,分辨率下降当SDS浓度进一步增加到超过40毫米。这可能是因为SDS浓度高会导致胶束之间的强相互作用和分析物28],它减少了分离效率。考虑到分辨率和峰的形状,40毫米被选为最优为SDS浓度。

3.1.4。惠普——的选择βcd浓度

CD可以选择性地形成包含复合物与各种分子由于其独特的空腔结构,这就增加了流动性的不同分析物和提高分辨率在电泳(29日,30.]。实际上,CD和分析物之间的分子间的相互作用也是一个全面效应,和二次叠加可以通过胶束的形式实现伪稳态阶段。因此,CD和胶束的协同作用将发挥重要影响分辨率和浓缩。此外,据报道,惠普-βcd可能增加包含原始腔结构因为羟丙基集团(31日]。鉴于上述情况,惠普——的影响βcd是检查通过改变浓度从2.5到12.5毫米40毫米SDS和10% ACN 30毫米磷酸盐缓冲剂。结果显示,当CD浓度是2.5毫米,大部分化合物的峰重叠。当浓度增加到7.5毫米,决议是满意的,所有分析物的峰形状是可以接受的。在10毫米的浓度,决议再次下降。这可能是由于环糊精浓度的增加导致的变化与SDS胶束的交互。峰的形状,迁移时间,决议考虑,7.5毫米惠普-βcd被选为后续实验。

3.1.5。ACN的选择内容

脂溶的组件不能简单有效地溶解在缓冲溶液;改善不溶性物质的溶解度和确保解决方案的同质性,有机修饰词是经常使用的32]。ACN的功能不同浓度(5%,7.5%,10%,12.5%,和15%)决议调查。按照图中所示的结果1 (e)、迁移时间和分辨率的分析物ACN内容的增加而增加。含量5%和7.5%的时候,可怜的决议伴随着物质干扰被观察到。ACN的含量增加到15%时,基线分离的分析物。这可能与减少EOF和SDS胶束的变化。高ACN内容导致贫穷的峰形状和迁移时间延长9组件,和基线ACN含量超过10%时也变得更糟。最终,10%被选为优化ACN内容。

3.1.6。分离电压的选择

分离电压对迁移时间有直接影响,分辨率,系统电流、电压和峰值形状,所以从20到25 kV测试在过去的阶段。低电压(20 kV)导致了扩展迁移时间,而分辨率没有明显改善。nonsurprisingly,高电压(25 kV)分离,尽管迁移时间减少,焦耳加热和当前值增加。因此,选择22 kV的分离效率,迁移时间和当前值。

因此,根据上述优化条件如下:40毫米惠普- SDS和7.5毫米βcd包含在知母(30毫米磷酸盐缓冲剂,pH值7.0),10% ACN添加有机改性剂,分离电压是固定在22千伏。

3.2。方法验证

发达的性能MEKC-DAD 9活性成分测定方法在最佳条件下SYTZQ估计。校准曲线的相关系数都大于0.9996。LOD决定在信噪比(信噪比)的3是1.2 - -3.5μg / mL,确定定量限10的信噪比是3.7 - -11.7μ克/毫升(定量限。在三个不同的浓度上升水平,盘中的rsd为精度和interday精度范围从0.4到4.8%和1.7%到5.0%,分别。复苏实验也进行了结果是95.3 - -104%。24小时稳定的结果表明,所有化合物都是96.1 - -105%的剩余价值,和RSD值是1.0 - -4.9%。(列在表的所有数据1和2)表示,该方法提供了良好的表演而言,线性,LOD、定量限、精度、稳定性、和恢复的同时分析九SYTZQ组件。

表1
校准曲线,线性范围、LOD、定量限,复苏的九个化合物。
表2
盘中精度,interday精度、准确性和稳定性的九个化合物。

相比之下,一些定性和定量的方法分析SYTZQ报道近年来进行了综述,主要包括高效液相色谱法和UPLC方法(表3)。其中,与高效液相色谱法相比,UPLC需要更少的时间来实现同时量化SYTZQ中几个化合物(12- - - - - -14]。然而,大消费的有机溶剂和高运营成本LC技术的重大挑战。我们都知道,是一种有效的,绿色,和稳定的分析技术和MEKC模式可以适应各种基质的样品分析,它只需要跟踪有机溶剂来满足多个组件的快速测定。方法开发了本可以实现同时测定9个化合物具有良好的分辨率(R≥1.5)在15分钟内,它甚至超过了UPLC法中使用的分离效率(12)(在所有出版的最佳解决方法)。同时,9个化合物的准确量化,异槲皮苷,quercetin-3 -O-glucuronoside、lithospermic酸和黄芪甙首次量化。除此之外,没有要求复杂的样品预处理和流动相主要由有机溶剂,这是符合绿色和生态发展的概念。因此,与其他方法相比,该方法在本研究显示明显的优势开发的量化数字组件,分析时间和消费的有机溶剂。

表3
比较的分析方法与分析报告。
3.3。应用程序在SYTZQ九组件的决心

建立方法成功申请的决心九组件(芍药苷、salvianolic酸B,绿原酸,rosmarinic酸,hyperoside,异槲皮苷,quercetin-3 -O-glucuronoside, SYTZQ lithospermic酸和黄芪甙)。通过比较迁移时间和强化标准样品的解决方案,目标峰在示例解决方案被确定。重复的样本和参考溶液混合图所示2,定量结果如图3。值得注意的是目标的内容组件SYTZQ不同批次的不同,尤其是芍药苷和salvianolic酸B,根据统计分析显示显著差异。这可能是因为原药材的质量是不同的,生产时间跨度大。


图2
毛细管electropherogram九混合标准(蓝色)和SYTZQ(红色):芍药苷(1),(2)绿原酸,(3)rosmarinic酸,(4)hyperoside,异槲皮苷(5),(6)quercetin-3 -O-glucuronoside (7) salvianolic酸B、lithospermic酸(8)和(9)黄芪甙。

图3
五批SYTZQ 9个化合物的内容。注:不同字母表示显著差异( )。

4所示。结论

一个简单、快速、敏感cyclodextrin-modified胶束电动毛细管电泳法分离和测定9个组件SYTZQ成立,和多组分质量评价体系成立于这项研究。优化和验证方法,分离时间短(16分),更高的灵敏度和重现性优化的条件下获得的。与此同时,分析异槲皮苷,quercetin-3 -O-glucuronoside、lithospermic酸和黄芪甙在SYTZQ使用CE首次被量化。较常见的中药质量分析方法及其复合制剂,目前MEKC-DAD方法大大减少了有机溶剂的消耗和提高分析物的决议,这被认为是一个安全、快速、准确,和绿色分析技术。

数据可用性

所有生成的数据在研究可从相应的作者。

信息披露

王姗姗和鲁伊·周co-first作者。的预印本手稿曾发表(33]。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

王姗姗和鲁伊·周贡献了同样的工作。

确认

这项研究是由中国国家自然科学基金(81830112),福建科技项目(2020 r1008001),天津市教育委员会和科学研究项目(2019 kj078)。