文摘

Oprozomib,作为第二代口服生物利用率蛋白酶抑制剂(PI),正在接受治疗的临床评价血液学的恶性肿瘤。在复发难治性多发性骨髓瘤(RRMM)病人,oprozomib显示良好的功效作为单药或联合治疗。在这个实验中,我们的目的是验证一个敏感和快速测定方法oprozomib在大鼠血浆浓度ultraperformance液相色谱串联质谱(UPLC-MS / MS)。样本处理乙腈沉淀剂和被使用水梯度洗脱Acquity UPLC本·C18柱(2.1毫米×50毫米,1.7μ米)。使用选择性反应监测(SRM)方法,测量的离子转换完成m / z533.18⟶199.01 oprozomib和m / z493.03 112.03⟶tepotinib(内部标准),分别。同时,乙腈和0.1%的甲酸溶液作为流动相,和流量为0.3毫升/分钟。量化的下限(LLOQ)方法1.0 ng / mL,和线性关系很好-100年1.0 ng / mL。此外,四个浓度水平的精度确定的值为3.1 -7.3%,准确性是−14.9%到12.9%。此外,经济复苏的决心从85.1%到96.1%,和基体效应的值没有超过110.4%。优化UPLC-MS / MS方法也适用于大鼠的药代动力学研究单一口服后21 oprozomib毫克/公斤。

1。介绍

淋巴瘤,多发性骨髓瘤(MM)是最常见的血液系统恶性肿瘤,这是一个属于postgerminal淋巴肿瘤克隆浆细胞和b细胞谱系(1,2]。在目前的医疗水平,MM仍不能完全治愈,但随着现代医学的发展,蛋白酶抑制剂(PI),免疫调节药物、单克隆抗体(摩),干细胞移植治疗,和其他药物和治疗方法出现MM患者治疗和延长生存的一个新的希望3]。

π已经被证明是一个有效的、共同治疗MM (4]。Oprozomib(图1(一)),作为第二代口服生物利用率π,正在接受治疗的临床评价血液学的恶性肿瘤(5,6]。在复发难治性多发性骨髓瘤(RRMM)病人,oprozomib显示良好的功效作为单药或联合治疗。oprozomib以前的药动学和药效学特点研究实体瘤患者,在第一阶段研究表明口服生物利用度和显示蛋白酶体抑制[存在剂量依赖的相关性5,7,8]。

(一)
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(b)
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图1
质谱的oprozomib (a)和tepotinib(是),(b)在这项研究中。

在大多数情况下,使用oprozomib结合其他代理,包括第一代代理,当治疗MM / RRMM,药物之间的相互作用(ddi)必须被考虑9]。研究表明,基于生理药代动力学(PBPK)模型已经被用来促进设计和推断ddi [10]。尽管已经取得了好的进展在模拟oprozomib之间的交互和其他药物PBPK模型的基础上,在体外oprozomib新陈代谢的研究已经表明,它是不太可能受到coadministered细胞色素P450 (CYP) [11]。

为了探索药物动力学和ddi oprozomib在活的有机体内,有必要建立一个敏感定量检测方法在生物体液oprozomib后续临床研究提供依据。然而,直到现在,oprozomib生物分析法和决心的方法在生物液体还未确定。因此,在这个实验中,我们的目的是验证一个敏感和快速测定方法oprozomib在大鼠血浆浓度ultraperformance液相色谱串联质谱(UPLC-MS / MS)。新成立的UPLC-MS / MS技术也适合oprozomib药物动力学的老鼠。

2。实验

2.1。化学材料和试剂

的纯度oprozomib和tepotinib(作为内标,图1 (b))> 98.0%,由上海Chuangsai科技有限公司有限公司(上海,中国)。此外,羧甲基纤维素钠(CMC-Na)也是购自上海Chuangsai科技有限公司有限公司(上海,中国)。甲醇和乙腈由默克公司(达姆施塔特,德国)在这项研究是液相色谱(LC)等级。此外,甲酸的LC年级,这是由Anaqua化学品供应(ACS,美国)。实验中使用的超纯水制备Milli-Q净水系统(美国贝德福德微孔)。

2.2。动物实验

6雄性SD (SD)中老鼠(体重200±20 g)提供的实验动物中心温州医科大学第一附属医院(温州,中国),美联储在标准条件下的温度25 - 28°C,湿度50 - 60%和12 h光/ 12 h黑暗。所有的老鼠在一个标准的啮齿动物的饮食,这提供了水和食物,没有限制。规则下的护理和使用实验动物,综述了所有行为和操作在这个实验中,机构伦理委员会批准温州医科大学第一附属医院(浙江,中国)。

Oprozomib制备成悬挂CMC-Na 0.5%的解决方案和口服药物剂量的老鼠21毫克/公斤。在实验之前,六大鼠禁食12小时,他们被允许无限制地访问水。在不同时间点的0.3,0.7,1.0,1.5,2.0,3.0,4.0,6.0,8.0,12日,24日,48 h,约0.3毫升的血液样本被从尾静脉和放置在一个1.5毫升埃普多夫(EP)含有肝素管。然后,血样4000×迅速离心机 在4°C 10分钟获得等离子体样本。随后,等离子体处理存储在−80°C之前,进一步分析。样品制备后,血浆浓度的oprozomib老鼠被UPLC-MS / MS方法评估和检测。然后,oprozomib noncompartmental分析药代动力学参数的计算是通过DAS软件(药物和统计,版本3.0,上海中医药大学中国)。

2.3。电器仪表和分析条件

UPLC-MS / MS系统,再加上一个电喷雾电离(ESI)来源(米尔福德,妈,美国),是由水域Xevo TQ-S三重四极杆串联质谱仪和水域Acquity UPLC我班系统(米尔福德,妈,美国)。

在这项研究中,溶剂甲酸水溶液(0.1%)和溶剂B(乙腈)作为流动相,和oprozomib分离在Acquity UPLC本·C18音响precolumn(2.1×5毫米,1.7μ米)和C18柱(2.1毫米×50毫米,1.7μ米)。在线性梯度洗脱,10% B是0 - 0.5分钟之间的平衡,以及洗脱将0.30毫升/分钟的流量如下:0.5 - -1.0分钟(B, 10 - 90%), 1.0 - -1.4分钟(B, 90%), -1.5和1.4分钟(B, 90−10%)。在仪器分析,自动取样器的温度是10°C,和列温度40°C。分析时间为2.0分钟,注入体积为2.0μl

质谱监测进行了使用Xevo TQ-S三重四极杆串联质谱仪,会同Acquity UPLC系统进行分析,在正离子模式下检测oprozomib和。离子的选择性反应监测(SRM)模式的转换m / z533.18⟶199.01和m / z493.03⟶112.03 oprozomib,分别。碰撞能量和锥oprozomib 25 eV和20 V电压,和是15 eV和30 V。质谱的其他实验条件是:脱溶温度(600°C)、毛细管电压(2.0 kV),碰撞气体(0.15毫升/分钟),锥形天然气(200 L / h)和溶解气体(1000 L / h)。

2.4。标准的解决方案,校准曲线,和质量控制(QC)样本

质量控制(QC)制备的样品和校准曲线,oprozomib和储备解决方案在浓度为1.0 mg / mL被用作主要的解决方案。一系列的工作获得的解决方案与不同浓度梯度稀释的甲醇原料解决测试物质。随后,一个工作方案(5μL)被添加到空白的大鼠体内等离子(45μL),相当于10倍稀释工作的解决方案。标准曲线最终浓度范围为1.0 -100 ng / mL (1.0, 2.0, 5.0, 10、20、50、100 ng / mL)。类似于制备标准曲线,QC样品的最终浓度为1.0(定量下限,LLOQ), 2.0(低质量控制,LQC), 40(中等质量控制,MQC)和80年(高质量控制、认证机构)ng / mL。正在解决方案100 ng / mL的浓度与甲醇稀释股票获得的解决方案。在实验的开始,所有的原料和液体需要提前做好准备工作,储存在−80°C。

2.5。样品制备

在准备所有的样品,我们进行蛋白质沉淀方法和采用乙腈作为沉淀剂。首先,50μL(血浆样本,在1.5毫升EP离心管,就被掺入了10μ工作解决方案的L (100 ng / mL)和混合0.5分钟的漩涡。然后,共有450名μ添加L乙腈沉淀血浆蛋白质,和混合大力涡1.0分钟,紧随其后的是一个13000×10分钟离心转速在4°C。下一步是将100年μL的上层清液清洁自动注入瓶。最后,注入体积是2.0μL,色谱系统使用了定量分析。

2.6。方法验证

接着分析方法验证的FDA指南分析测试和验证过程,包括校准曲线的方法,稳定、基体效应,LLOQ,精度,精度完全进行(12]。

在这个实验中,为了检测方法的选择性,空白血浆样本由色谱法分析了六种不同的老鼠来评估是否存在内源性干扰分析物的保留时间和方法。

我们建立标准曲线根据最小二乘法原理和使用的权重因子浓度的倒数(1 /x)来衡量它的线性度。LLOQ是最低的分析物的浓度能够可靠地量化的标准曲线,与可接受的准确度和精密度。LLOQ,(相对误差、再保险、%)精度±20%,和精密(相对标准偏差RSD为,%)小于20%。

QC样品的精密度和准确度进行评估通过五个重复试验三个不同浓度水平连续三天。下三个浓度水平(五个样本让每个浓度)并行,回收率计算通过比较分析物的浓度比前后蛋白质沉淀。的反应率,提取血浆矩阵和分析物在纯的解决方案是计算基体效应相比,和基体效应也在五重复测量。

LQC (2.0 ng / mL)、MQC (40 ng / mL),和认证机构(80 ng / mL)被用于稳定性评估。具体评估内容分为以下四个部分(13,14]:一个是在室温下稳定3 h和−3周作为另一个80°C,第三是自动取样器的稳定在10°C 4 h,最后是三倍的完整的冻融−80°C到室温。

3所示。结果与讨论

3.1。方法设计和优化

在研究的开始,我们优化色谱条件,提高了检测灵敏度,建立一个简单的UPLC-MS / MS方法测定大鼠血浆中oprozomib。提出了图1、oprozomib质谱和显示。在质量转变的过程中,我们使用m / z199.01产品离子和量化方法m / z112.03离子定量方法。此外,实验使用0.1%甲酸、乙腈溶液中流动相,导致良好的分离效果和峰值形状。

在实验中,乙腈作为蛋白质沉淀剂,当我们等离子体处理。该方法简单,实验时间短。此外,我们还全面评估和分析了这种方法的可行性的oprozomib检测方面的准确性,精度和稳定性。全面,这是一个简单而有效的检测方法。

3.2。方法验证
3.2.1之上。选择性

如图2oprozomib的保留时间约为1.52和1.39分钟,分别。后比较空白的代表SRM色谱鼠混合血浆从6个不同的来源,空白血浆补充oprozomib LLOQ浓度水平,和实验等离子体样品,没有发现潜在的干扰物质。根据结果,该方法能够被用来决定的浓度oprozomib oprozomib因为它有很好的选择性,。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
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图2
代表色谱oprozomib和在大鼠血浆:(一)空白血浆;与标准溶液(b)空白血浆飙升LLOQ (1.0 ng / mL);(c)样品从大鼠口服后获得21 oprozomib毫克/公斤。
3.2.2。线性度和灵敏度

标准曲线的浓度范围是1.0 -100 ng / mL,以及峰值比率(之间的线性回归方程Y)和兼容的浓度(X)是Y= 0.00683×X+ 0.00259 (R2= 0.9993),线性关系好了方法检测的要求。方法的LLOQ 1.0 ng / mL,精度小于7.3%,准确度±5.3%。

3.2.3。精密度、准确度、复苏和基体效应

作为UPLC-MS / MS方法的一部分,精密度和准确度的评估是通过计算发现QC样品用不同浓度水平(n= 5)为1.0,2.0,40,80 ng / mL连续3天。表1表明UPLC-MS / MS方法建立了定量分析大鼠血浆的oprozomib高度精密,准确。

表1
oprozomib精密度和准确度的大鼠血浆(n= 5)。

在这项研究中,认证机构、MQC LQC被用来检测5个重复的复苏和基体效应。计算提取复苏的手段被用来比较血浆样本添加到QC前添加了等离子体浓度蛋白沉淀后提取。使用这种方法,提取复苏三个浓度水平的范围从85.1%到96.1%(表2)。基体效应计算了归一化法,并在实验中没有观察到基体效应影响等离子体(表中的分析物的决心2),表明这种方法是可靠和有效的。

表2
在大鼠血浆复苏和基体效应oprozomib (n= 5)。
3.2.4。稳定

oprozomib在老鼠的等离子体在不同条件下的稳定性被稳定性实验研究。在实验中,血浆样品加上oprozomib存储或处理的四个条件:至少3周−80°C,三完全冻结后解冻(−80°C) /(室温)周期,至少4 h在自动取样器(10°C),在室温下至少3 h。稳定性试验结果表明,在常规药物稳定实验如表所示3。

表3
稳定的结果oprozomib在等离子体在不同条件下(n= 5)。
3.3。动物研究

UPLC-MS / MS方法在本研究建立适用于测定大鼠血浆药物浓度的单剂量口服后21 oprozomib毫克/公斤。oprozomib在老鼠的平均血浆浓度时间曲线如图3。的主要药代动力学参数oprozomib noncompartmental模型进行了分析和总结,如表所示4。峰值时间(T马克斯)的药物在大鼠血浆半衰期约为1.1±0.3 h, (t1/2)是13.8±8.3 h。考虑到只有6老鼠用于我们的动物实验中,如果想确定的药物动力学曲线oprozomib更准确地说,我们需要扩大动物实验的数量并进行进一步的研究。


图3
平均血浆浓度时间曲线oprozomib在老鼠的单剂量口服oprozomib 21毫克/公斤(n= 6)。
表4
oprozomib在大鼠血浆的主要药代动力学参数的单剂量口服oprozomib 21个毫克/公斤(n= 6,平均数±标准差)。

4所示。结论

最重要的是,我们开发了一个简单而可靠的UPLC-MS / MS方法测量的浓度oprozomib首次在等离子体。这个方法被证明具有良好的重现性,精度高、精度和良好的线性和分析时间短的优点,样品制备简单,成本低。它显示值在老鼠oprozomib的药代动力学研究。

数据可用性

数据用于支持该研究可从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

夏和李丫南刘贡献同样这项工作。