整合研究定性和定量表征的主要成分与UHPLC Shuanghuanglian注入/ Q-Orbitrap-MS和UPLC-PDA

文摘

作为临床有效的中药注射液(TCMI) Shuanghuanglian注入(SHLI)广泛用于治疗上呼吸道感染和肺炎。然而,缺乏质量分析是一个限制,仍有待改进SHLI的临床应用。在这项研究中,利用超高性能的液相色谱串联Q-Exactive Orbitrap高分辨率质谱(UHPLC / Q-Orbitrap-MS), 31化学成分(8有机酸、11类黄酮、5环烯醚萜苷,四个信息,和三个木酚素)在SHLI特征,其中22个组件也被明确地确定参考化合物。网络药理学的简短的预测结果表明,22个目标组件可能有抗炎、抗菌、抗病毒和免疫调节活动。使用多波长切换方法,量化了22个目标组件超高效液相色谱与光电二极管阵列检测器(UPLC-PDA)后,方法学验证。基于建立的成功方法,22个组件的总含量在20批SHLIs有效地确定了10.25和11.28毫克/毫升之间略有差异,在总固体SHLI占38.7%。本研究进行了可靠的化学识别和提供了一个快速和有效的质量分析方法,这导致了SHLI深入调查和应用。

1。介绍

中药(TCM)亚洲已广泛运用于临床实践,逐渐吸引了更多的关注在西方国家因其可靠的疗效[1]。作为一个重要的创新中药的现代化,中药注射剂(TCMIs)快速出现的优势,有针对性的药物输送,生物利用度高,等等(2]。基于上述看法,TCMIs发挥关键作用的治疗心血管和脑血管疾病、呼吸系统疾病,肿瘤(3- - - - - -6]。复杂的化学成分,直接静脉注射的特点限制TCMIs的临床应用,其质量和化学成分的研究吸引了众多研究人员和监管机构的注意。

作为一种重要的TCMI准备金银花japonicae,连翘,黄芩通过现代科技,SHLI通常用于治疗上呼吸道感染、肺炎,发烧7- - - - - -9]。准备工作包括黄酮类化合物,酚酸、酚苷,和其他成分,具有明显的抗菌、抗病毒和immune-enhancement活动证明了现代药理研究[10- - - - - -14]。定性和定量分析的准备工作有报道。基于UPLC / Qtof女士^EUNIFI信息平台,170组件特征在口服液,44岁的进一步由参考化合物(10]。王等人同时量化22活性化合物SHL准备(包括胶囊、颗粒和口服液)由HPLC-DAD [15]。到目前为止,研究的SHL注入主要集中在SHL喷粉(SHLPI)。太阳等人明确或初步确认125种化合物的SHLPI HPLC-ESI-IT-TOF-MS [16]。李等人开发了高效液相色谱法同时分析黄芩苷和其他14个化合物来评估质量的一致性SHLPI [17]。相比之下,有关报道SHLI相对有限。绿原酸、黄芩苷只有内容,pillyrin在当前部门规定标准;因此,全面质量控制研究SHLI更为紧迫。

确保为公众用药安全,国家医疗产品管理局启动了安全2009年TCMIs重新评估。其中,澄清的化学成分和质量评价方法的改进是关键问题。指数的选择组件的前提问题。网络药理学是基于高通量组学数据分析和网络数据库检索已成为中药研究领域的一个流行工具。作为一个兼容的方法来预测复杂和中医的整体机制,网络药理学在分析活性成分有独特的优势,说明分子机制(18]。网络药理学可以建造一座桥之间的关系来研究定性和定量分析,这有助于确定该指数的化合物。这个策略,现在我们主要集中在SHLI次生代谢物进行定性和定量描述与网络药理学的援助。

在这项研究中,31化学成分(8有机酸、11类黄酮、5环烯醚萜苷,四个信息,和三个木酚素)在SHLI UHPLC / Q-Orbitrap-MS的特征。22个化合物被参考化合物有抗炎、抗菌、抗病毒、策略和小菜吧活动的网络药理学,伴随着SHLI函数。通过化学成分的差异的内容考虑在内,比例稀释法来量化22目标组件通过UPLC-PDA 20批SHLIs多波长切换方法。此外,不同批次之间的lot-to-lot一致性评估。简而言之,SHLI建立方法完善质量控制,为SHLI的临床应用提供了科学依据。

2。材料和方法

2.1。试剂和材料

LC-grade甲醇和乙腈买来费舍尔科学(公平的草坪,新泽西,美国)。甲酸和二甲亚砜(DMSO)收购了从上海阿拉丁生化科技有限公司有限公司(中国上海)和大茂化学试剂厂(天津),分别。实验中使用的水被Milli-Q纯化水净化系统(美国微孔,Billerica的)。20批SHLIs(20毫升/每注射液)在2018年和2019年生产提供日文称为Fusen药业有限公司的企业河南有限公司(河南、中国)作为S1-S20和编号。

绿原酸(Cha, > 96.80%),咖啡酸(Caa, > 99.70%),黄岑素(并,> 91.70%),forsythoside(失落,> 97.20%),pillyrin(公益诉讼,> 95.10%)、黄芩甙元(呗,> 97.90%),oroxindin(奥罗,> 98.00%),和汉黄芩素(赢了,> 97.00%)获得国家食品和药物控制机构(中国,北京)。Secoxyloganin(赛格,> 98.00%)购买从成都德克斯特生物技术有限公司有限公司(四川,中国)。新绿酸(Nea)、forsythoside E(敌人),cryptochlorogenic酸(Cra) secologanic酸(海),isoforsythiaside (Iso), hyperoside(忧郁)luteolin-7 -O- - - - - -β-D-glucoside(耳),isochlorogenic酸B (IaB), isochlorogenic酸(IaA), isochlorogenic酸C (IaC) chrysin-7 -O- - - - - -β-D-glucuronide (Chg)、木蝴蝶素a - 7 -O- - - - - -β-D-glucuronide(组织)、黄芩苷(Bac),和木蝴蝶素(OrA)纯度98%以上是来自上海原液生物技术有限公司(上海,中国)。

2.2。准备的参考和示例解决方案

23参考化合物分别准确称重和溶解在甲醇水溶液为股票的解决方案除了Bac DMSO溶液溶解。除了Bac,每只股票的解决方案是准确测量,然后放置在一个25毫升容量瓶稀释和10%甲醇水溶液(/),它是用来准备一个股票溶液混合32.77的最终浓度μ100.0 g / mL Nea,μ38.96 g / mL敌人,μ37.73 g / mL Cha,μ6.048 g / mL Cra,μ32.00 g / mL创新艺人经纪公司,μ18.00 g / mL,μ74.66 g / mL赛格,μ6.636 g / mL Iso,μ11.60 g / mL忧郁,μ77.40 g / mL并,μ16.72 g / mL,失落μ6.000 g / mL IaB,μ16.83 g / mL IaA,μ27.81 g / mL IaC,μ22.04 g / mL公益诉讼,μ56.00 g / mL Chg,μ4.624 g / mL Org,μ10.12 g / mL奥罗,μ0.9744 g / mL呗,μ0.8260 g / mL赢了,μ分别g / mL奥拉。为了绘制校准曲线,6个不同浓度的工作标准的解决方案通过连续稀释以10%甲醇水溶液混合股票的解决方案。同样,个股解决Bac浓度为0.12毫克/毫升和一系列工作的解决方案。

SHLI稀释25倍和10%甲醇水溶液UHPLC-MS / MS分析和定量分析的化合物Bac除外。Bac量化,SHLI与10%甲醇水溶液稀释250倍。所有的解决方案都是储存在4°C到分析。

2.3。UHPLC-MS / MS定性分析条件

定性分析是进行热科学最终3000仪器(热费希尔科学、圣何塞、钙、美国)加上一个问Exactive Orbitrap女士配备加热电喷雾电离(HESI)来源。使用一个ACQUITY UPLC^®高速钢T3列(2.1×100毫米,1.8μ米,水域,米尔福德,妈,美国),这个分离进行了流动相组成的0.1%甲酸水溶液(/)(A)和乙腈(B)在梯度洗脱50°C。优化的梯度洗脱进行如下:0−7分钟,3−13% B;7−18分钟,13 B−27%;18−20分钟,27% - -48% B;20−21分钟,48−90% B;和21−24分钟,90% b .流量和注入量0.3毫升/分钟和2μ分别L。应用和dd-MS女士²(TopN)模式在正面和负面两种离子模式,样本的范围进行了分析米/z150−2000 Da在全扫描的分辨率为70000的半最大值宽度女士和女士在17500年的半最大值宽度²模式。最优条件如下:女士鞘气体流量(N₂),35 Arb;辅助气体流量(N₂),10 Arb;喷涂电压、3.5 kV;辅助气体加热器温度,350°C;和毛细管温度、350°C。所有的数据获取和处理的Xcalibur™4.1软件(热费希尔科学)。

2.4。为定量分析UPLC-PDA条件

一个ACQUITY UPLC我班系统(水),配有一个二进制溶剂经理,一个autosampler, PDA检测器,用于执行定量分析。多波长切换方法采用PDA探测器,和时机波长切换采用如下:0.00 - -5.00分钟,327海里;5.00 - -5.60分钟,280海里;5.60 - -6.12分钟,325海里;6.12 - -8.50分钟,240海里;8.50 - -9.50分钟,235海里;9.50 - -9.80分钟,240海里;9.80 - -10.00分钟,250海里;10.00 - -14.00分钟,327海里;14.00 - -14.50分钟,254海里; 14.50–17.65 min, 276 nm; and 17.65–25.00, 270 nm. Other liquid chromatography parameters were the same as in the qualitative analysis described above.

2.5。网络药理学分析

二维目标化合物的化学结构实现了从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[19]。基于反向药效基因匹配策略,SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)被用于预测潜在的分子靶点20.]。相关通路的关键目标是获得的基因和基因组的京都百科全书(KEGG)通路富集分析通过大卫6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)[21]。KEGG数据库(https://www.kegg.jp/)可以识别潜在的活动与候选人通路有关。“汤块的交互性和可视化网络−TCMI−−−−−信号通路目标化合物药理活动”由起源9.6软件。

2.6。定量分析的方法验证

本研究验证的定量分析建立线性、检测极限(LOD),定量限度(定量限),精密(内部和interday)、稳定性、可重复性和恢复测试。校准曲线的拟合得到的峰面积(y分析物的浓度和相应的(x)一式两份。基于LOD和参考解决方案,确定定量限在3和10的信噪比,分别。内部和interday精度计算分析六个重复注射一天,连续三天,分别。样品溶液,藏在autosampler 10°C,被复制分析注射在0、2、4、6、8、10和12 h,分别。验证的可重复性是建在六个不同的样本一式两份。恢复测试估计通过分析六个示例解决方案,准备通过增加相应数量的标准解决方案到精确测量0.5毫升注射。

2.7。数据分析

热图、箱线图进行了平行坐标图,条形图使用起源2019软件(OriginLab有限公司,北安普顿,妈,美国)。

3所示。结果与讨论

3.1。表征的化学成分在SHLI UHPLC / Q-Orbitrap-MS

描述SHLI中的化学成分,UHPLC / Q-Orbitrap-MS方法建立了。总离子色谱图SHLI在积极和消极离子模式如图1(一)和1 (b),分别。通过比较参考化合物和特征碎片女士模式,总共31组件被确定或暂时的特征,包括八个有机酸,十一个黄酮类化合物,5环烯醚萜苷,四个信息,三个木酚素。其中,22个组件与参考化合物无疑是验证。所有的化合物都总结在表的信息1。

赛格(11)峰值和Bac(峰值23)被选为两个例子来描述这些化合物的片段的行为。环烯醚萜苷的代表,赛格表明quasimolecular离子m / z403.12305 [M−H]⁻在负离子模式下。特征碎片离子m / z223.05956 [M H−−相关)⁻,m / z165.05382 [M H−−相关−CH₂首席运营官)⁻,m / z121.02790 [M H−−相关−CH₂COO-CO₂]⁻,m / z95.04853 [M H−−相关−CH₂COO-CO₂- c₂H₂]⁻是由葡萄糖的连续亏损,CH₂首席运营官、公司₂C₂H₂,基本上符合环烯醚萜苷的质谱碎片法则(16]。Bac不仅是最高的类黄酮含量黄芩,但也在SHLI的主要活性成分之一。Bac,负离子频谱的二聚体quasimolecular离子m / z891.16333 [2 m−H]⁻被观察到。与此同时,由于高能碰撞,quasimolecular离子m / z445.07593 [M−H]⁻失去了葡萄糖醛酸残生成特征碎片离子m / z269.04449 [M H−−GlcAr]⁻(丰度最高的10]。如数据所示S1和S2提出分化途径的凹陷和Bac在负模式描述,分别。

UPLC-PDA色谱中,我们遇到了一个值得注意的现象,没有任何的保留时间。11个色谱峰是符合凸耳,而其紫外吸收曲线基本上是一致的(没有失落。12),如图2。结合质分析的结果(耳高峰16日,t_R= 12.50分钟;失落,峰值17异构体(FAi),t_R= 12.52分钟),不。11峰值显示在图2(一个)FAi的重叠和吊耳。因此,FAi和吊耳不应被视为一个索引组件的质量控制SHLI后续研究。

3.2。选择索引组件与网络药理学的策略

很难评估使用单组分中药制剂的质量评价模型客观地、准确地与中医现代化的发展。基于网络药理学、中药质量控制的研究从化学成分之间的相互作用和疾病,然后构造“化学composition-target-disease网络”获得核心化学成分指数的化合物。

针对明确的22个化合物鉴定的参考化合物定性分析与质网络药理学的研究策略是模仿简要预测潜在的活动,它提供了一个基础的选择指数组件SHLI的质量控制。22个目标化合物的化学结构,实现从PubChem数据库,被上传到SwissTargetPrediction准确预测生物活性分子的目标人类作为一个有限的物种。大卫的援助和KEGG通路数据库、相关通路是丰富和分析通过选择条件”人类物种”,分别。

最终,238年SHLI 22对应目标活性成分筛选后消除重复。通过KEGG通路富集分析,共有93个途径获得(< 0.01),在消除不相关的途径,只有39相关通路被包含在分析(表中所示的完整的信息S1和S2)。值得注意的是,KEGG通路富集结果显示抗炎的密切联系,抗菌、抗病毒和免疫调节活动。例如,雌激素信号通路,肿瘤坏死因子信号通路,t细胞受体信号通路,和B细胞受体信号通路密切相关的抗炎和免疫反应性的活动。与此同时,抗菌和抗病毒活性可以显式地解读从甲型流感、肺结核等信号通路24,25]。所有的预测都高度一致的功效SHLI清理热量和排毒,表明本研究的科学性和合理性。综合网络见图3。

3.3。UPLC-PDA色谱条件的优化

优化色谱条件为方法学验证铺平了道路。旨在更好的测试化合物的分离和敏感性,色谱柱,包括ACQUITY高速钢T3列(2.1×100毫米,1.8μ米),本·C18柱(2.1×50毫米,1.7μ米),本·C18柱(2.1×100毫米,1.7μ米),流动相乙腈水含有甲酸和甲醇−−水含有甲酸),梯度洗脱程序,列温度(30°C, 40°C,和50°C),和检测波长系统优化。最终,实现最优分离一个高速钢T3列在50°C和流动相组成的0.1%甲酸水溶液−乙腈。考虑到不同的最大吸收波长在SHLI不同类别的化合物,采用多波长切换方法和定量色谱条件一节中介绍。

在色谱,Bac的反应是如此之高,以至于它掩盖了其他组件,这是不利于准确的量化跟踪组件。我们遇到了另一个挑战是如何实现组件的同时测定SHLI内容的差异。比例稀释法是最好是用来解决上述问题。SHLI稀释25倍和10%甲醇水溶液的方法验证和定量分析21个化合物,包括Nea,敌人,Cha Cra,创新艺人经纪公司,海,赛格,Iso,忧郁,并,,失落IaB, IaA, IaC,公益诉讼,Chg,组织,奥罗,巴姨,赢了,奥拉。与此同时,SHLI稀释250倍对Bac 10%甲醇水溶液。

3.4。方法验证UPLC-PDA SHLI的22个化合物的定量分析

同时定量分析的有利的验证结果SHLI展示在表中22个化合物2。线性关系(r> 0.999)的测试组件对应的浓度范围内是令人满意的。所有分析物和整体LOD和定量限值小于0.1736和0.5208µ分别g / mL。此外,内部的rsd为interday精度,稳定(图4),和可重复性被证明是低于3.5%。最后,范围从95.06%到109.3%得到平均的复苏,这表明方法有精度与相对标准偏差低于2.9%。上述所有项目证明了量化方法可以可靠地铺平道路的同时测定22 SHLI中目标化合物。

由于TCMIs复杂的化学成分,注射用多组分应尽可能多的化合物进行定量分析和定义良好的结构。比之前报道的分析方法(表3),既定的方法在我们的研究中表现出的优势分析时间短,高分辨率,和更多的测试化合物提供了一个更好的选择对于评估SHLI的质量。

3.5。视觉模式的定量分析结果22 SHLIs不同批次的组件

Plot-to-plot一致性评估质量控制的基本要求,以确保药物的安全使用。通过UPLC-PDA多波长切换方法加上比例稀释法,验证了系统的方法论,22个目标组件成功量化20批SHLIs。如表所示S3测试组件的总含量范围从10.25到11.28毫克/毫升与相对标准偏差低于2.9%,这表明没有显著差异的和有针对性的从不同批次的SHLIs组件。然而,不同的目标组件的标准偏差范围是1.7 - -24.1%。除了Bac含量高,其他组件的rsd为大于3.0%,展现在不同的批次,每个组件的内容在一定程度上。

为了揭示每个目标组件的内容变化SHLI更直观,22个化合物的标准化的内容从20批次被用来绘制热图,反映了波动的22个化合物在不同批次相同的相似性水平颜色梯度,如图5(一个)。22中测试组件,Nea的色彩深度,敌人,Cra,大海,赛格,Iso,失落和较大的波动,表明这些化合物不同高度的内容在不同的批次。同时,箱线图如图5 (b),用来反映色散的测量结果集中在20批SHLIs次生代谢物。Bac明显表现出更高的盒子与别人相比,表明Bac存在于更高的内容。和上面的内容结果表明,Bac占59.36 - -65.31% 20批次中的所有分析物。

化合物的百分比与定义的结构的总固体不应少于60% TCMIs由多组分(31日]。因此,我们想计算22个目标化合物的总量的比例的总固体SHLI。不同批次的SHLIs涌入蒸发皿,冻干确定总固体。计算公式(1)是表示如下:

PCT是目标化合物的质量百分比总固体;米_t是22个目标化合物的总含量每注射液(20毫升);和米_年代是每安瓿SHLI的总固体(20毫升)。如表所示S4和图5 (c),研究结果显示,22日目标组件的内容占了总数的38.7%固体SHLIs 20批次的生产在2018年和2019年。

4所示。结论

在这项研究中,一个准确和可靠的质量控制方法SHLI成立。31个化合物SHLI被UHPLC / Q-Orbitrap-MS明确或初步确认。基于定性分析,UPLC-PDA多波长切换方法加上比例稀释法建立了22个代表化合物的定量分析在20批次SHLIs,已被证明具有抗炎、抗菌、抗病毒和免疫调节活动。结果展示,它是可靠和适用于质量控制SHLI铺平了道路,SHLI临床的进一步应用。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关这篇文章的出版。

作者的贡献

创雪前朱的贡献同样这项工作。

确认

这项工作是财务支持的科技项目天津(没有。20 zyjdjc00070)。

补充材料

表S1。所有的目标对应于22日指数在SHLI化合物。表S2。KEGG通路富集分析结果的目标(< 0.01)。表S3。22个候选化合物的量化结果SHLI 20批次(n= 2)。表S4。测试组件的百分比在SHLI总固体含量。图S1。拟议的分化途径的赛格-模式。图S2。拟议的分化途径的Bac -模式。(补充材料)

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