经济Spectrofluorometric生物分析法的Empagliflozin老鼠的等离子体

文摘

一个简单、经济、绿色、敏感分析方法empagliflozin生物测定大鼠的血浆受雇成功由于empagliflozin原生荧光行为。增强的液-液萃取,用乙醚(迪),被成功用于改善提取empagliflozin从大鼠的血浆logP基于其高价值为1.8,提高了药物从等离子体有机层的迁移。的相对荧光强度empagliflozin记录在激发后发射(299.4 nm) 226.5海里。线性的方法验证满意结果(500 - 5000 ng / mL),真实、精确,基体效应,提取复苏。矩阵的效果介于15.63%和23.10%之间LQC和认证机构样本,分别。提取回收率介于54.61%至62.54% LQC和认证机构样本,分别。偏差值真实−10.62,+ 14.95之间范围,而%相对标准偏差值精度介于5.39%和9.33%之间。方法已成功应用于大鼠的血浆样本,包括六个老鼠,和药物浓度测定等离子体后1小时(估计Cmax基于文学)口服后empagliflozin浓度为10毫克/公斤,订单. .发达的spectrofluorimetric方法在目前的工作将在进一步的药代动力学研究的有益的使用,包括老鼠的等离子体和生物液体。此外,适当的修改,描述小说也可能采用提取empagliflozin人血浆样品和未来的临床研究。 Moreover, development of new simple cost-effective methods is necessary to give the researchers a set of “varieties” that they can use according to the laboratory limitations, especially in the developing countries in addition of being a greener method due to the lower consumption of toxic solvents and lower waste production.

1。介绍

2型糖尿病与主要在世界范围内的主导地位日益严重的并发症,尽管不同的治疗策略。此外,发病率和死亡率的最重要的原因是由于2型糖尿病患者心血管疾病(1,2]。钠葡萄糖联系运输车2抑制剂(SGLT2i)前沿类药物2型糖尿病管理提出了一个原始胰岛素依赖机制改进的血糖水平3,4]。Empagliflozin(外汇)的一个非常具体的SGLT2i引发糖尿。它提高了作为一个抗糖尿病的血糖水平与长期承诺降低糖化血红蛋白结果,更好的控制体重,显著改善微血管的结果(5]。此外,外汇基金改善内皮功能障碍,减少血管损伤和心脏衰竭的进展,抑制动脉粥样化形成与未来考虑作为一个多功能药物(6,7]。外汇基金,作为单一疗法或附加其他antihyperglycaemic药物疗法,是良好的耐受性和口服后迅速吸收8]。

许多色谱方法对紫外线和质量检测报告外汇基金的试验药物剂型和生物液体单独或结合linagliptin,二甲双胍和/或其他抗糖尿病药9- - - - - -26]。然而,他们缺乏的简单、快速、有效的方法由于需要昂贵复杂的仪器和耗时的几部分的分析方法。此外,伏安法方法报道外汇基金的分析和生物分析法在药物剂型和人类尿液(27]。光度法和最优化方法被报道为外汇基金第一作者(28),但这些方法没有已知的高灵敏度spectrofluorometric分析的输出。当前研究的目的是提供一个新的绿色生物分析方法测定的外汇在老鼠的等离子体完整详细的验证根据FDA指南描述作为高成本的替代方法在文献中可能降低成本的优势。

荧光是最常见的和有用的在分析化学类型的光致发光。Spectrofluorometric技术表现出极高的灵敏度,可以应用于非常广泛的检测分析物在环境和生物样品,尤其是本地的药物不需要预处理的荧光衍生化或修改。其检测能力约一个数量级大于分子的吸收光谱,和它的选择性明显大于其他光谱方法。因此,为分析不同分析物的荧光光谱测定法已经应用在复杂的矩阵(29日- - - - - -31日]。此外,发展中国家(包括埃及),荧光光谱测定法在生物分析法的应用仍然是受欢迎的由于简单,常见仪器的可用性,低成本,无需昂贵的基础设施,不适用在QC实验室有限的基金。

虽然两个spectrofluorometric分析方法描述了外汇基金(32,33),其中一个是基于外汇衍生化测定人血浆(前32),而其他同步方法没有考虑其应用生物体液和/或老鼠的血浆样品(33]。定义当前的研究作为外汇基金的“第一次”spectrofluorometric方法生物分析法在老鼠的等离子体基于本国的荧光。在目前的调查,一个简单的spectrofluorometric方法描述的准确和精确测定外汇基金(图1在老鼠的等离子体。FDA指南(34)申请整个方法开发和分析验证,包括选择性、线性、纯真,interday盘中精度,稀释的完整性,提取复苏,基体效应和稳定性研究。本研究将为制药行业和研究人员感兴趣的在QC工作区域的药物分析和生物分析法。

2。材料和方法

日本岛津公司荧光谱仪,RF - 6000模型R928光电倍增管,3 d测量函数,用1厘米石英比色皿(日本京都),控制从PC使用实验室解决方案射频软件Windows (Rev.B.04.01,日本岛津公司),是使用。样品电池的温度同时测量了在室温下不受控制。外汇基金注册含有99.7%和老鼠的等离子体是“谢天谢地”提供的礼物药物研发中心(CDRD,埃及的英国大学)。分析纯甲醇从西格玛奥德里奇(德国)购买。

标准储备溶液外汇基金(1毫克/毫升)制备甲醇;然后,标准和质量控制(QC)工作方案与不同浓度甲醇(100、200、400、500、600、800年和1000年µg / mL)。10μL准备工作的每一个解决方案是使用1990年飙升μL空白血浆准备校准和QC样品最终浓度为500 (LQC), 1000年,2000年,2500年(MQC), 3000年、4000年和5000年(认证机构)ng / mL(研究线性、纯真和精度)。

2.1。关于和实际样品准备

两毫升老鼠的等离子体是液-液萃取使用6毫升的乙醚(和整个方法是重复与另一个6毫升结束时),涡流1分钟,30分钟的离心6000 rpm (2817×g),和冻结。然后,上层有机迪层分离,使用真空蒸发浓缩器在50°C 20分钟至干燥。外汇基金提取样本然后重组2毫升的甲醇,涡流,然后转移到试管。相对荧光强度EFN-extracted样品记录λ发射(299.4海里)λ激励在226.5海里。生物样本不断保持在−20°C到使用,校准和QC样品刚做好每一天。

2.2。关于动物的研究

六Sprague-Dawley老鼠收到外汇基金(10毫克/公斤,订单。)溶解在盐水和十二烷基硫酸钠为表面活性剂。它值得提到使用十二烷基硫酸钠是必要的,因为高亲脂性的性质empagliflozin以确保其有效地溶解。一个小时之后(估计Cmax基于文学在大鼠口服后(14]),收集血液样本retroorbital丛和抗凝治疗(肝素在最后一个1 U /毫升的浓度和EDTA的最终浓度1毫克/毫升)。等离子体(2毫升)被离心分离在1000 rpm (78×g) 10分钟,然后用于外汇基金的评估水平按照样品制备。外汇基金剂量计算基于报道剂量和人类与充分考虑动物的剂量转换表面积物种之间的差异(35]。本研究通过埃及的英国大学的伦理委员会(代码:ex - 2008, 2020年12月9日)批准。提到伦理委员会认可ENREC(埃及网络研究伦理委员会),http://www.enrec.org/directory。最后,提取血浆样本冷冻直到使用和存储。

2.3。关于生物分析方法验证和稳定性研究

生物分析方法验证实现符合FDA的指导方针。方法的选择性是评估通过比较提取的外汇发射光谱与空白血浆500 ng / mL。六个不同批次的空白老鼠的等离子体(从6个不同的老鼠)捐赠来自CDRD-BUE检查干涉测量的选择性。使用校准用标准线性检测样品500 - 5000 ng / mL的范围内。使用的相对荧光强度与浓度预测校正曲线和回归方程。外汇使用对应的回归方程计算浓度检查方法的真实性。方法的真实的亲密表示测量值的实际,估计采收率(R%)。检查精度显示多个样品测量的亲密表现出相同的浓度,QC样品化验三次(n= 3)在同一天盘中评估精度,而interday精度评估在连续三天(n= 3)。盘中和interday百分比相对标准偏差(%相对标准偏差)计算。此外,矩阵的影响在响应计算是相对荧光强度的比值出现从记录的光谱postpreparation EFN-spiked样本的相应的解决方案。提取复苏率的评估记录光谱的相对荧光强度出现外汇基金样本postpreparation飙升的样品。

评估小但故意变化可能发生在常规分析通过评估的方法进行了鲁棒性。鲁棒性是在500 ng / mL检查通过轻微的变化λ激励在226海里,然后%相对标准偏差计算。稀释完整实验老鼠的等离子体方法进行的5倍和10倍稀释高浓度样品(10μg / mL),计算相应的浓度。使用高的浓度高于量化的上限。比较样本的百分比变化应在±15%。LQC稳定性和认证机构估计基于4种不同的生物离开试管中的样本3 h后在室温下或让他们3 h(板凳短期稳定)或分析后三个完整周期(每个周期两周)冻结和解冻。最后,稳定的长期稳定性研究两周后通过检查样品在冷冻−80°C。四个按FDA指南采用稳定性进行了研究。

3所示。结果与讨论

首先,致力于生物分析法最近批准的抗糖尿病药提供了有价值的信息的行为药物在生物体液血浆样品或其他生物组织如脑组织和/或尿液样本。更多的应用程序可以使用这些信息(比如logP和增强提取)和优秀成果,甚至再利用抗糖尿病药的其他用途的BBB穿越或其他有价值的行为在生物体液(36]。拟议中的spectrofluorometric方法有效地应用于外汇基金在老鼠的等离子体的决心。达到最高的灵敏度和最好的峰的形状,不同的参数。在3 d扫描波长表示,发射光谱是通过扫描发射单色器在不同λ在一个特定的发射λ激发。最终,外汇基金的荧光强度是最好的记录λ发射(299.4海里)λ激励为226.5 nm,如图2。扫描速度、数据区间,激发和发射带宽是600海里/分钟,0.2,分别和15海里。此外,在几个测试稀释溶剂,甲醇显示最大的相对荧光强度(33]。

样品制备完成足够的恢复和增强了基体效应。学习外汇极性和XlogP3-AA (= 2)37),蛋白质沉淀和等离子体提取液液萃取进行了评估。然而,蛋白质沉淀没有实现预期的复苏。蛋白质沉淀报告缺陷(38),如长时间蒸发和干燥阶段,剩余的样品中杂质的安静的存在,以及进一步需要清理,在这项研究中是不可避免的。虽然与当前spectrofluorometric实施初步调查方法,蛋白质沉淀使用乙腈等离子体体积(4倍)显示不准确的决定。许多非线性结果甚至干扰空白血浆样本发现这可能是由于外汇基金logP价值高。此外,使用高氯酸作为沉淀剂也未能显示令人满意的结果。

液液萃取成功申请外汇等离子体提取实现最好的灵敏度,真实,和恢复。这是评估不同的溶剂如乙酸乙酯,迪、己烷和后添加不同的pH值范围内的缓冲区。磷酸盐缓冲剂(pH值0.2米,3 - 10),醋酸缓冲(pH值0.2米,3 - 5)和硼酸缓冲(0.2米,pH值8 - 10)解决方案使用了不同的提取溶剂提到试验提高提取过程。最后,量化的下限(LLOQ)被确定使用提供最干净的迪提取和恢复最高,而其他溶剂显示低效率提取外汇基金(使用spectrofluorometric方法),而没有注意到不同的缓冲区。用乙酸乙酯和正己烷的基体效应为25%和28%,分别,都是高于平均收到迪矩阵效应(19.4%)。此外,乙酸乙酯和正己烷显示经济复苏低于50%,所以他们被排除在提取参数,尤其是发现无显著差异(2 - 4%)添加不同的缓冲区(磷酸或醋酸或硼酸)。因此,液液萃取,使用迪,被成功用于增强提取外汇从大鼠的血浆logP基于其高价值为1.8,提高了药物从等离子体有机层的迁移。

外汇基金的相对荧光强度记录λ发射(299.4海里)λ激励在226.5海里。Spectrofluorometric生物分析法提供了主要优势在所有的色谱方法的文献,包括简单和缺乏需要准备的固定和移动阶段耗时和昂贵的。此外,开发新的简单而有效的方法是必要的,给研究者一组“品种”,他们可以根据实验室使用的局限性,特别是在发展中国家除了绿色的方法由于有毒溶剂的低消耗和低生产浪费。

发达的spectrofluorimetric方法在目前的工作将在进一步的药代动力学研究的有益的使用,包括老鼠的等离子体和生物液体。此外,适当的修改,小说描述的外汇基金的提取可以采用人血浆样品和未来的临床研究。发达试验验证有效地根据FDA指南(29日]。良好的线性和结果所示连续增加荧光强度(图3)减去空白血浆的空白值计算的相对荧光强度并按以下发现。回归方程计算,发现RFI = 4.0517浓缩的。+ 3884,= 0.9928,r= 0.9964,RFI的相对荧光强度,回归系数,r是相关系数(图4)。LLOQ被发现500 ng / mL实验。

方法验证了令人满意的结果封闭线性范围(500 - 5000 ng / mL),真实、精确,基体效应,提取复苏。真实的相对偏差值(相对差异超过100%恢复)−10.62,+ 11.70之间范围LQC, MQC−7.4, + 5.69, 11.11和14.95认证样品。相对标准偏差百分比(% R.S.D.)值的精度QC样品interday重复性介于5.83%和9.33%之间,而盘中介于5.39%和6.85%之间的可重复性。提取回收率介于54.61%至62.54% LQC和认证机构样本,分别提取的低价值的复苏可能是由于报道的绑定扩阔至高血浆蛋白。稀释完整显示令人满意的复苏的5倍或10倍稀释样本偏差低于5%,和所有稳定性样品回收率超过85%,所有这些研究结果均符合FDA的指导方针。

的影响反应是评估矩阵,矩阵效果是一致的,介于15.63%和23.10%之间LQC和认证机构样本,分别。鲁棒性分析在500 ng / mL稍微有些变化λ励磁226海里,% RSD为显示无显著差异。%的低价值RSD为揭示了有效的可靠性、一致性和采用方法的鲁棒性。该方法成功地应用于生物样品,包括六个老鼠,和等离子外汇浓度确定一个小时(估计Cmax基于文献[14)在外汇管理局(10毫克/公斤,订单)。美国南达科他州均值和生物样品的浓度分别是625.39 ng / mL, 262.48(图5)。计算平均浓度在生物样本被发现在发达的校准曲线描述潜在的调查。

4所示。结论

简单的验证和健壮spectrofluorometric方法被证明是适用于外汇基金使用一步法测定大鼠的血浆液液萃取。发达成本效益分析方法在目前的披露工作精度好,真实,和线性,这将在进一步使用有益的药代动力学和临床前研究。Spectrofluorometric生物分析法提供了主要优势在所有的色谱方法的文献,包括简单和缺乏需要准备的固定和移动阶段耗时和昂贵的。此外,开发新的简单和具有成本效益的方法是必要的,给研究者一组“品种”根据实验室使用局限性特别是发展中国家除了绿色的方法由于有毒溶剂的低消耗和低生产浪费。

数据可用性

数据(包括数据)用于支持本研究的结果包括在本文中。

附加分

empagliflozin样品可从CDRD研究中心。

伦理批准

输送量大临床试验协议批准(伦理委员会,代码:ex - 2008, 2020年12月9日)。提到伦理委员会认可ENREC(埃及网络研究伦理委员会),http://www.enrec.org/directory。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

作者同样导致了目前的分析工作。所有作者已阅读及同意文章的发布版本。

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