定量小猎犬狗血浆的Apremilast UPLC-MS-MS及其药代动力学研究中的应用

文摘

敏感和选择性超高效液相chromatography-tandem质谱(UPLC-MS-MS)方法测定apremilast的小猎犬狗等离子体已成功开发和验证在当前的研究中。氯吡格雷是受雇为内部标准(是)和液液萃取tert-butylmethyl醚用于样品制备。色谱分离实现了UPLC本·盾RP18列(50毫米×2.1毫米,1.7μ米)甲酸铵水5毫米和5毫米甲酸铵甲醇为流动相,梯度洗脱。标定块的线性范围2 - 3000 ng / mL的apremilast小猎犬狗等离子体。意味着复苏apremilast小猎犬狗血浆从87.4%到97.4%不等。intrarun和interrun精度小于6%和9%,分别与精度在92.4%和101.1%之间。该方法也被成功地应用于apremilast的药物动力学研究。t1/2Z均值为5.41 h·天30毫克⁻¹口服后对小猎犬的狗。AUC0-t线性从3.51增加到1802.13经过政府的单一剂量。

1。介绍

牛皮癣和银屑病关节炎(PsA),普遍在世界范围内大约有2 - 3%的人口1,2),是一种慢性炎症疾病过程由生产过剩的炎症介质释放先天和适应性免疫细胞(3,4]。磷酸二酯酶4 (PDE4)是免疫细胞的酶主要原理和调节这些细胞分裂素的生产,如白介素- 17 (IL), IL-23,和肿瘤坏死因子(TNF)、以及抗炎介质如IL - 10。Apremilast口服PDE4抑制剂最近FDA批准作为PsA的一线治疗药物控制器一般的在美国和印度市场在印度5]。

通常表示apremilast apremilast平板电脑,销售等各种剂量摧毁mg, 20毫克,30毫克(5]。Apremilast广泛代谢的两种代谢途径:CYP-mediated氧化代谢(主要由CYP3A4酶)和后续glucuronidation或non-CYP-mediated水解。只有3%和7%的接种剂量不变的尿液和粪便排出,分别为(6,7]。此外,正如CYP3A4酶的底物,apremilast可能与CYP3A4酶诱导物,一个可靠的验证试验是必要的治疗监测,避免任何可能的药代动力学(PK)交互。

几种方法是测定apremilast及其代谢产物在生物体液样本,包括差示扫描量热法(8)、x射线粉末衍射法(9),傅里叶转换红外光谱(10),高效液相色谱法(11,12),或液相色谱结合质谱分析(质/ MS) (6,13,14]。最近决心apremilast及其代谢产物在生物体液的超高效液体chromatography-tandem质谱(UPLC-MS-MS)进行,这是用来评估的准确性apremilast测定血清,血浆、血液样本的老鼠和药代动力学apremilast口服后(15,16]。报道,C_马克斯值后333 ng / ml apremilast推荐20毫克剂量的口服17),需要开发一个高的敏感方法校准范围治疗监测。

因此,本研究的目的是开发和验证一个UPLC-MS-MS方法测定血浆中apremilast的高校准范围。它被应用于研究apremilast口服后的药代动力学在三个不同剂量小猎犬狗。

2。实验

2.1。化学物质和动物

Apremilast(1毫克,纯度98.5%)和内部标准氯吡格雷(化学纯度99%)由多伦多研究化学物质(加拿大多伦多)。甲酸溶液的高效液相色谱(49 - 51%)和甲酸铵获得Sigma-Aldrich公司(圣路易斯,美国)。高效液相色谱级乙腈和甲醇来源于费舍尔科学(美国新泽西州)。动物中心提供的小猎犬的狗被华西药学院,四川大学。

2.2。准备的标准和质量控制样品

apremilast和氯吡格雷(内部标准)标准的解决方案被增溶的准备适量的甲醇。准备每周的新的解决方案。校准范围从2的浓度范围ng·毫升⁻¹3000 ng·毫升⁻¹。QC样品准备以类似的方式在三个浓度。所有解决方案和QC样品准备在琥珀色玻璃瓶和存储−在使用前20°C。

2.3。样品制备过程

一个200μ50 L整除等离子体的混合μl 5%的甲酸,1毫升tert-butylmethyl醚,10μL是(1μg·毫升⁻¹)。在仔细vortex-mixed 3分钟(VtexMixer VX200, Labnet国际、美国),混合离心机在12000转3分钟。澄清上层清液被转移到一个新的聚丙烯管和蒸发干燥下氮在45°C(吹气压力集中器TurboVap II;,卡尺,美国)。残留于100年重组μL甲醇,在上述条件下vortex-mixed,再次离心。一个10μL上层清液引入1.5毫升的高效液相色谱microvials保持在+ 4°C到UPLC-MS-MS分析。

2.4。设备

使用的色谱仪是一个Acquity超高效LC系统由一个四元泵、流动相的脱气器和一个autosampler,和柱的温度控制器模块(水域,美国)。分离进行一个亚特兰蒂斯UPLC本·盾RP18列(50毫米×2.1毫米,1.7μ米颗粒大小、水、美国)放置在列模块的温度控制器。UPLC系统耦合三重四极(TSQ) Xevo TQTM从水域Inc .)、质谱(MS)和一个Z喷电喷雾电离(ESI)接口和操作分析软件包(美国水域4.1版本)。

2.5。LC-MS-MS条件

用于色谱的流动相组成的5毫米的甲酸铵水(溶剂)和甲醇(溶剂B)。梯度条件如下:0∼0.50分钟,70%;0.50∼0.52分钟,70%∼5%;0.52∼2.00分钟,5%;2.00∼2.10分钟,5%∼70%;和2.10∼4.00分钟,70%。

串联质量的条件如下:ESI电离在积极的模式中,毛细管电压:3.00 kV,和源温度:350°C。碰撞气体(氩气)流量为0.16毫升·分钟⁻¹。锥和desolution气体(氮气)流速50和800年Lh⁻¹,分别。女士是在多反应监测(MRM)模式。Apremilast化学结构如图1。这些离子转变对461.0/178.0(锥:26和CE: 26)和461.0/257.2(锥:26和CE: 9) apremilast和322.1/184.0(锥:22和CE: 20)氯吡格雷的内部标准。

2.6。方法验证协议

根据FDA生物分析方法验证方法验证指导(18包括线性,量化(LLOQ)的极限精度、准确性、复苏,选择性,基体效应,稳定。

方法特异性评估通过分析六个来自不同来源的空白血浆样品。MRM转换之间的“相声”是评估通过分析不同的空白样品。

为了探讨线性,一系列的校准标准apremilast准备通过分析已知浓度和添加到空白血浆。

盘中精度、interday精度和精度分析测定QC样品三个浓度(5、50和1000 ng·毫升⁻¹,n= 6)分开三天。精度定义为QC样品的相对标准偏差(RSD)浓度确定6点复制,而精度评估是标称浓度的百分比(%)。

复苏决定通过比较nonextracted的QC样品的峰值区域与相应的控制样本提取样本。三种不同浓度水平的每个分析物(5、50和1000 ng·毫升⁻¹,n= 6)进行评估通过分析六个样本在每个级别。同样的评价进行100 ng·毫升⁻¹。

基体效应的评价是比较postextracted空白血浆飙升的峰值区域混合工作解决方案的相应的标准解决方案三个质量控制水平,一式三份;同样的步骤进行(100 ng·毫升⁻¹)。QC样品受到短期室温(2 h, 18°C),紧随其后的是一个长期冻结(30 d,−20°C)和三个冻结/解冻(−20°C-18°C)稳定性测试。

2.7。药代动力学研究

十二个健康小猎犬狗(男性;重量:8.5 - -12.5公斤)被用于药代动力学研究调查apremilast的血浆浓度水平。食物被撤销前12 h实验。小猎犬狗收到每日apremilast平板电脑通过口服剂量30毫克·的一天⁻¹。收集血液样本(大约3.0毫升)从小猎犬狗肝素化管前剂量在0.17,0.33,0.50,0.75,1.00,1.50,2.00,3.00,4.00,6.00,9.00,12.00,24.00,36.00,48.00,60.00,和72.00 h postdosing分别。立即离心后获得的血浆样本4000 rpm 10分钟,然后转移到埃普多夫管之前存储在−20°C到分析。动物实验是按照指南进行动物实验,和协议是机构批准的动物保健和使用委员会(IACUC)本机构(执照号:K2015014)。

药代动力学参数的计算是通过统计软件“药物和Statistics2.1.1”(DAS 2.1.1、数学药理学专业委员会,中国)和“统计产品和服务Solutions16.0”(SPSS 16.0, SPSS . n:行情),芝加哥,美国)。成对的学生的t以及(C_马克斯、AUC CLz)和Wilcoxon测试(t_马克斯)是用于统计分析。三个剂量比较由单向方差分析之后,土耳其的多个比较测试差异有关p值小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果与讨论

3.1。液相色谱和质谱条件

方法开发始于色谱条件的优化包括列类型和流动相组成。因为小直径列常用UPLC-MS-MS,三种类型的水域ACQUITY UPLC 1.7在本·列μ米直径被在我们的调查和比较。本·HILIC列第一次被排除由于不满意峰值apremilast的形状。此外,Rt apremilast的本·盾RP18列(1.49分钟)是比这更合适的本·C18(< 1.00分钟),不管他们的相似的选择性和apremilast的形状达到峰值。因此,要考虑足够的分析物的分离水相干扰物质(Rt < 1分钟),水域ACQUITY UPLC在本·盾RP18列应用在当前分析方法总的运行时间为4.0分钟。此外,apremilast水相时表现出更好的响应包含5毫米(最终)浓度甲酸铵代替5毫米醋酸铵结合0.1% (v / v)甲酸。此外,之间没有明显差异的敏感性5毫米甲酸铵溶液和10毫米甲酸铵溶液,和5毫米甲酸铵溶液体积的被用来减少浪费。总之,液体阶段由水和甲醇包含5毫米甲酸铵是在我们目前的研究工作。在上述色谱条件下,apremilast并筛选了在保留时间为1.49分钟,1.70分钟,分别(图2)。

(一)

(b)

(c)

在方法开发的早期阶段,apremilast的标准解决方案,在浓度为1μg·毫升⁻¹分别注入到质谱仪。它注意到信号强度apremilast和增强剂在积极模式相比,消极的模式,这可能是由于更好的带正电荷的电喷雾电离apremilast下积极模式。因此,应急服务国际公司在正离子模式下采用量化的apremilast在当前的研究中。女儿扫描质谱(米+H]⁺显示在m /特色产品的详细信息z分别为461.3和322.1 apremilast和氯吡格雷。如图1最敏感和稳定的产品离子m /z178.0和257.2 apremilast和m /z184.0分别为,。ESI参数包括毛细管电压、锥电压、碰撞能量,气体流量,和源温度进行了优化,最大化女士的反应。气体的流量(反溶剂气体,气体锥和碰撞气体)和源温度最小对女士的反应的影响。

3.2。验证过程

3.2.1之上。特异性

在目前的研究中,特异性和选择性研究了通过使用独立的血浆样品从六个不同的狗。图2显示代表色谱空白(无污染)提取物,和图3显示空白样品中掺入apremilast标准LLOQ和真正的血浆样品分析物。没有重要的内源性干扰从等离子体在Rt分析物或发现。

(一)

(B)

Autosampler结转是由注入校准用标准最高,然后一个空白样品。没有观察到的峰值分析物的保留时间和色谱图的空白血浆随后注射后最高的校准标准。

3.2.2。线性和LLOQ

校准曲线的浓度范围从2到3000 ng·毫升⁻¹在小猎犬狗等离子体线性。apremilast的校准曲线生成的验证过程y= 0.0126x+ 0.0072 (r= 0.9979),y代表apremilast的峰面积比,和x是名义上的分析物的浓度。的LLOQ apremilast ng是1毫升⁻¹可接受的精度(RSD)为5.5%和准确性(RE)的1.9%。

3.2.3。精密度和准确度

盘中,interday精密度和准确度的试验进行了总结表1。盘中,interday精度范围从3.3%到5.9%和4.6%到8.3%,分别;和盘中interday准确性apremilast在92.4%和100.1%之间。


名义(ng毫升浓度⁻¹)	盘中的决心(n= 6)			Interday测定(n= 6)
名义(ng毫升浓度⁻¹)	(ng毫升浓度决定⁻¹)	精度(%)	R.S.D. (%)	确定浓度(ng / mL)	精度(%)	R.S.D. (%)

5	5.00	100.1	5.9	4.64	92.8	5.5
500年	461.97	92.4	5.3	475.99	95.2	8.3
1000年	935.94	93.6	3.3	900.56	90.1	4.6

3.2.4。复苏和矩阵的效果

apremilast的提取回收率,5点50,1000 ng·毫升⁻¹范围从87.4%到97.4%(表2)。绝对的基体效应在105.9%和108.1%之间,说明基体效应在实验条件下可以忽略不计。


复合	浓度(ng / mL)			经济复苏(%,n= 6)	相对标准偏差(%)
	名义上的	之前确定/提取	确定/萃取后

Apremilast	5.00	4.81	5.51	87.4	5.9
	50.00	46.05	49.08	93.8	5.3
	1000.00	842.08	864.48	97.4	3.3

3.2.5。稳定性研究

稳定性结果表明,apremilast在室温下稳定2 h偏离初始浓度小于15%。和分析物也稳定在−3个冻融循环和储存后40°C 3个月不到10%偏离初始浓度。这些结果在可接受的限制,表明该分析物在分析确定十分稳定。

3.3。应用程序在小猎犬狗药代动力学研究

上述分析方法应用于药代动力学研究apremilast药片口服后在30毫克公斤⁻¹(天)在十二个男小猎犬狗。这是发现的血浆浓度与时间剖面的意思是apremilast图所示4apremilast很好吸收的最大血浆浓度在3.04 h。后来,apremilast迅速分发到外围组织,导致低血浆浓度48 h后几乎就能识别出来。药代动力学参数包括t_1/2,t_马克斯,C_马克斯,AUC_去年,AUC_正,V_z/ F(表观分布容积),C_l/ F(间隙)的计算是通过DAS和表中列出3。的比率C_马克斯和AUC apremilast男性小猎犬的狗是0.09。


药物动力学参数	Apremilast

AUC_(0-t)( )	22650.98±
AUC_{(0 -∞)}( )	22758.56±
t_1/2z(h)	5.41±
T_马克斯(h)	3.04±
V_{z / F}(左)	11.28±
CL_{z /}F (L h⁻¹)	1.52±
C_马克斯(ug L⁻¹)	2148.33±

收集血液样本(3.0毫升)在肝素化管剂量在0.17,0.33,0.50,0.75,1.00,1.50,2.00,3.00,4.00,6.00,9.00,12.00,24.00,36.00,48.00,60.00,和72.00 h postdosing分别。等离子体获得直接离心后收集血液样本在4000转10分钟。

4所示。结论

在这项研究中,我们验证了UPLC-MS-MS apremilast液液萃取后的量化方法小猎犬狗等离子体。验证结果表明,没有重要的矩阵对分析物的影响和选择。报道的方法成功地应用于药代动力学研究apremilast口服后在小猎犬的狗。t1/2Z均值为5.41 h·天30毫克⁻¹口服后对小猎犬的狗。AUC0-t线性从3.51增加到1802.13经过政府的单一剂量。

缩写

UPLC-MS-MS:	超高效液相chromatography-tandem质谱分析
MRM:	多反应监测模式
PsA值:	银屑病关节炎
Th1:	辅助T细胞1
Th17:	辅助T 17
宫:	银屑病关节炎的长期临床疗效的评估
是:	内部标准
Rt:	保留时间。

数据可用性

所需的原始/处理数据复制这些发现也不能在这个时候作为数据共享一个正在进行的研究的一部分。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

引用

sncf的p·d·d·最终c Mease, d·o·克莱格和p .纳什,“银屑病关节炎:流行病学、临床特征、课程,结果,“风湿性疾病上,卷64,不。2,pp. ii14-ii17, 2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
A . Chiricozzi d . Caposiena诉Garofalo m . v .坎尼扎罗s奇门蒂和r•萨拉瑟诺”的新治疗严重银屑病的治疗:apremilast,”临床免疫学专家审查,12卷,不。3、237 - 249年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
m·a·洛斯a . m . Bowcock和j·g·克鲁格,“银屑病发病机理和治疗”,自然,卷445,不。7130年,第873 - 866页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
p·谢弗,”Apremilast牛皮癣和银屑病关节炎的作用机制和应用,“生化药理学,卷83,不。12日,第1590 - 1583页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
p . Kulkarni和a . Deshpande”分析方法测定Apremilast从散装,”剂型和生物液体:一个评论,2020年,页1 - 10。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
m·霍夫曼,g·库马尔,p .谢弗et al .,”性格,新陈代谢和质量平衡[14 c] apremilast口服后,“Xenobiotica第41卷。。12日,第1075 - 1063页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
g . Schett v . s .斯隆,r·m·史蒂文斯和p·谢弗,”Apremilast:小说PDE4抑制剂治疗自身免疫和炎性疾病,”治疗肌肉骨骼疾病的发展,卷2,不。5,271 - 278年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
Y.-D。吴,X.-L。张,X.-H。刘”、制备、表征、结构和解散分析apremilast solvatomorphs,”晶体学报:C结构化学卷,卷73,不。4、305 - 313年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
j . r .马丹a·r·帕瓦尔·r·b·帕蒂尔r . Awasthi和k Dua”制备、表征及体外评价平板电脑包含apremilast微波固体分散体的,”Polimery W Medycynie卷,48 17-24,2018页。视图:谷歌学术搜索
k .出全新m·穆罕默德·e . Ezzeldin法蒂玛,a . Alalaiwe m·伊克巴尔,“准备持续释放apremilast-loaded PLGA纳米粒子:体外表征和在大鼠体内药代动力学研究,“国际期刊的纳米,14卷,第1595 - 1587页,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
s . r . Chaudhari和a . a . Shirkhedkar”实验设计大道RP-HPLC-PDA方法的开发和验证测定apremilast散装和内部平板配方,”分析科学与技术杂志》上,10卷,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
s . b . Landge s . b . Dahale s . a . Jadhav p v . Solanki s . r . Bembalkar和v . t . Mathad”发展和验证稳定指示快速RP-LC方法测定过程和退化相关杂质apremilast,抗炎药物,”美国分析化学》杂志上,08年卷,没有。6,380 - 394年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
沈陆y、x、t .挂和m .歌曲,“识别和描述过程相关物质和降解产物在apremilast:流程优化和降解途径说明,“制药和生物医学分析杂志》上卷,141年,第78 - 70页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
p . m . Tang, s .黄问:郑,h . Yu, y,“延长释放配方的开发apremilast和小猎犬狗vitro-in体内相关性研究,“化学和制药公告,卷64,不。11日,第1615 - 1607页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
m·伊克巴尔e . Ezzeldin s . t . Al-Rashood f .阿訇和k . a . Al-Rashood”测定大鼠血浆中apremilast UPLC-MS /女士在ESI-negative模式以避免离子加合物的形成,“生物分析法,8卷,不。14日,第1508 - 1499页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
L.-g。陈、王z s . Wang t . Li y,和x Lai”测定大鼠血浆中apremilast UPLC-MS-MS和药代动力学研究中的应用”色谱科学杂志》,54卷,不。8,1336 - 1340年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
r·m·普尔和公元巴兰坦Apremilast:第一全球批准,”药物,卷74,不。7,825 - 837年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
US-FDA,”食品和药物管理局指导工业:BioanalyticalMethod验证,”2001年,http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM070107.pdf。视图:谷歌学术搜索

分析方法在化学杂志》上

文摘