文摘
成纤维细胞在基质中发挥重要作用在肿瘤的进化。在这项研究中,我们评估结肠的影响成纤维细胞对结肠癌细胞治疗5 -氟尿嘧啶(研究者用),和鼠标结肠癌细胞系MC38和结肠的成纤维细胞NIH3T3被用于这项研究。一个敏感和快速UHPLC-MS / MS方法定量的研究者用细胞和介质已成功开发和验证。细胞与甲醇溶解,混合蒸发然后再溶解提取胞内研究者用。分析了UHPLC-MS /女士使用一个亚特兰蒂斯T3-C18列(3μ米,2。∗100毫米)和梯度洗脱甲酸乙腈和0.1%的水。方法验证包括以下参数:基体效应范围88.82% - -93.64%,经济复苏范围93.52% - -94.56%。盘中,interday精密度和准确度是< 11%,在±6%,稳定、特异性、遗留物,稀释效应,和线性都符合标准。该方法应用于检测的浓度研究者用细胞内和细胞培养基。初步结果显示,NIH3T3可以提高MC38的耐药性与细胞内的浓度下降研究者用研究者用MC38,显示一个积极的关系NIH3T3号码。
1。介绍
结直肠癌(CRC)是全球最常见的癌症之一。其发病率排名第三在前列腺癌和肺癌的雄性,雌性是第二个最常见的癌症。化疗干预结合手术是先进的CRC的主要治疗方法之一。在几十年之后发现,研究者用佐剂的骨干和姑息治疗结直肠癌(CRC) (1,2]。尽管近年来新的治疗药物的进展,研究者用CRC患者仍然是一线代理(3]。然而,在治疗过程中,大多数患者会出现耐药性,研究者用CRC治疗(这是一个主要障碍4]。近年来,耐药引起了研究人员的关注机制探索和消除阻力。
如今,人们已经发现,肿瘤微环境复杂,和肿瘤进展,转移和耐药肿瘤微环境在很大程度上提升,其中基质细胞和细胞外环境的发生和发展是至关重要的CRC (5- - - - - -7]。肿瘤微环境由不仅癌细胞,而且多种基质细胞,例如,癌症相关的成纤维细胞(保护),骨髓衍生的细胞,免疫和炎症细胞。自从佩吉特提出的“种子和土壤”假说8),肿瘤微环境生物的重要性已被广泛接受。战乱国家,最多在肿瘤间质细胞类型,是由激活的间充质细胞在体内,招募从骨髓来源间充质干细胞和成纤维细胞。战乱国家具有多种功能,包括调节肠道炎症,上皮细胞增殖,干细胞维护、血管生成、细胞外基质重塑,和转移,因此促进CRC的开发和进展(9]。现在,有许多研究在CAF促进耐药性,但研究者用不同的基质细胞介导大肠癌耐药性尚未阐明(10- - - - - -12]。
本研究的目的是建立和验证直接、敏感和有效UHPLC-MS / MS方法量化研究者用介质和细胞溶解产物的影响和评估不同的研究者用浓度的基质细胞癌细胞。
2。材料和方法
2.1。化学品和材料
研究者用和5-bromouracil (5-BrU、内部标准)从Meilun获得生物科技有限公司有限公司(大连,中国)。MS-grade乙腈(ACN)和甲醇从默克公司(默克公司,达姆施塔特,德国)。分析纯甲酸购买从麦克莱恩生物科技有限公司有限公司(麦克莱恩,上海,中国)。异丙醇在HPLC-grade购自上海泰坦科技有限公司有限公司(上海。中国)。蒸馏水是买从深圳屈臣氏蒸馏水有限公司有限公司(中国深圳)。Vivaspin®500超滤离心选矿机是购买的缝匠肌贸易有限公司(缝匠肌、上海、中国)。96 -孔板从康宁购买有限公司有限公司(美国康宁公司)。ScanSpeed MaxiVacα/β(GVS03511110028)是由基因有限公司(丹麦、德国)。
2.2。细胞培养
MC38(鼠标大肠癌细胞)是一个礼物来自同济大学药理实验室的。NIH3T3(鼠标结直肠纤维母细胞)从Meilun购买生物科技有限公司有限公司(大连,中国)。这两个细胞系生长在DMEM(杜尔贝科修改鹰的介质)补充heat-inactivated 10%胎牛血清,谷氨酰胺,1% penicillin-streptomycin 37°C和5%股份有限公司2。媒介是每2或3天刷新,直到达成80% - -85%融合,和细胞转移到下一个实验或准备股票的解决方案。
2.3。液相色谱测定和MS / MS条件
研究者用量化是安捷伦1290系列UHPLC系统包括一个在线脱气装置、一个二进制泵、autosampler,柱温箱,界面上的安捷伦6460三重四极质谱计配备了一个电喷雾电离源(美国安捷伦科技,圣克拉拉,CA)。所有的原始数据都使用安捷伦Masshunter数据获取和分析处理软件(版本B.06.00,安捷伦科技,圣克拉拉,CA,美国)。
2.4。液相色谱条件
研究者用色谱分离是通过使用一个亚特兰蒂斯®T3-C18列(3μ米,2.1×100毫米,水域有限公司米尔福德,美国),温度保持在25°C。甲酸(0.1%,V / V)在水中(A)和ACN (B)作为流动相使用下面的洗脱梯度:0分钟,2% B;0 - 3分钟,2%到70%的B;3.01 - -3.5分钟,95% - -95% b,和一个2分钟的时间。色谱分离分析物在3.5分钟之内就完成了,总运行时间为5.5分钟。液相色谱系统平衡的初始阶段10分钟之前第一次注射。注射量是5μL针洗用5%甲醇水溶液为3。
2.5。质谱条件
质量检测是优化的基于电喷雾电离源(13在积极的模式毛细管电压为4000 V。气体干燥气体,喷雾器,鞘气体氮。干燥气体被加热到325°C和交货10 L / min。鞘气体的温度设定在350°C,和流量是12 L / min。喷雾器压力优化在50 psi。高纯氮作为碰撞气体被调整为0.2 MPa。数据采集进行选择反应监测(SRM)模式(图1)。大规模转换在30 ms监视居住时间和参数表中列出1。
(一)
(b)
2.6。准备的标准和质量控制样品
两毫克的研究者用准确称重和溶解在甲醇获得股票溶液浓度为1000.0μ克/毫升。解决方案进一步整除和存储在一个冰箱在−80°C到使用。研究者用的原液稀释10%甲醇获得一系列工作的解决方案,和研究者用解决方案与DMEM稀释10倍的校准标准20岁,50岁,100,500,1000,2500,4000,5000 ng / mL。QC(质量控制)样本准备使用相同的程序在50浓度,分别于1000年和4000 ng / mL,分别存储在−预处理前80°C。同样的方法被用来准备是股票的解决方案,和1000.0μg / mL 5-BrU原液终于获得和存储在−80°C。样品预处理之前,10%甲醇是用来稀释溶液的浓度1000 ng / mL。
2.7。样本提取
中样本混合彻底2倍体积10%甲醇(包含1000 ng / mL),然后直接超滤器使用vivaspin®500超滤管,和滤液收集进行分析。100年μL细胞残骸样本,进行涡流,然后蒸发是在30分钟内完成(ScanSpeed MaxiVacα/β)。在蒸发过程中温度与压力设定在4°C小于100 pa,残留的是与100年重新溶解μL甲醇。涡2分钟后,混合物受到14500×g离心10分钟之后添加一个200μL 10%甲醇(包含1000 ng / mL),和一个80年μL上层清液被转移到样品瓶进行分析。
2.8。的影响不同数量的NIN3T3细胞的耐药性MC38治疗研究者用
本研究协议旨在调查的影响培养基(CM)从不同数量的NIH3T3 MC38耐药性的研究者用对待。NIH3T3被播种到96孔板40井和分成四组(10000 /毫升25000 /毫升,50000 /毫升75000 /毫升和100年μ信用证)。所有的细胞都在一夜之间完全培养基培养。NIH3T3中刷新了0.1% BSA(牛血清白蛋白)LG DMEM包含5μ研究者用和培养24小时。CM的NIH3T3细胞收获和1000×g离心前进行研究者用决心和转移治疗MC38细胞。1×PBS的NIH3T3细胞被洗两次,和50μL /甲醇是添加到所有NIH3T3细胞溶解细胞。混合物都是收获和储存在−80°C到样品预处理。MC38细胞被播种前24小时NIH3T3厘米收获到另一个96孔板60井和均匀地分成6组,和4000 /毫升MC38细胞被播种/好,一夜之间完全培养基培养。媒介MC38丢弃和1×PBS是用来洗MC38前两次NIH3T3厘米了。第一批MC38空白控制和0.1% BSA LG DMEM是用于治疗细胞。第二组接受0.1% BSA LG DMEM包含5μ研究者用。其他四组治疗NIH3T3 CM不同组,分别。所有的媒介和MC38收集细胞后24小时使用上述方法。
2.9。方法开发
在这项研究中,根据美国食品和药物管理局和中国药典(2015年版),特异性,线性,日间精密度和准确度,残留的效果验证。我们采用的方法王et al ., 201814]。
在特异性方面,我们比较了反应至少6不同批次的剂量与空白样品。六个复制准备,在低和高的浓度(50和4000 ng / mL,低和高),评估基体效应和恢复。五个复制准备在4个浓度水平(低限制,低、中、高),和每天和样品的精密度和准确度进行评估在不同的时间3批次。线性评价应进行三次,每个浓度点,逆浓度计算相应的校准用标准偏差应在15% (RE %)和下限(RE %)应在20%以内。的残余影响分析物被注入最高的校准标准样品测试。对比实际测量浓度和测量浓度稀释效应。每个稀释系数应该评估至少5倍,RSD %和%不超过15%和15%,分别。稳定性测试包括短期稳定(24小时自动取样器),长期稳定(1个月),和冻融循环稳定。QC样品评估在低和高的浓度,不超过15% (RE %)的名义浓度。
2.10。数据分析
统计分析和策划进行了使用SPSS软件(IBM公司,纽约,美国版本19.0.0)和GraphPad棱镜(GraphPad软件有限公司、芝加哥、钙、美国7.01版)。单向方差分析和LSD检验进行组间比较。P值< 0.05被认为有统计学意义。
3所示。结果与讨论
3.1。色谱和质谱条件的优化
找到更好的参数,适合我们的分析物,进行了一系列的测试。研究者用的检测,是通过质谱进行了优化电喷雾电离(ESI)模式下,显示的优越性在电离效率相对于大气压化学电离(APCI)来源15]。随着研究者用一个极性化合物具有高亲水性(日志P−0.786),和一个列与一个更强的保留特性是必需的。后测试不同的列,例如,ZORBAX SB-C18,水域亚特兰蒂斯T3-C18, Xselect本·,Xbridge本·,和Eclipse PLUS-C18,结果发现,研究者用具有更好的峰形状和保留时间的水域T3-C18列,和其他的列不显示令人满意的保留和对称的山峰。此外,较低的柱温(25°C)是有利于研究者用保留相比更高的温度(35°C)。研究者用的保留时间是优化后2分钟98%水阶段是应用于初始流动相。不同的流动相添加剂,如醋酸铵,甲酸,乙酸和测试的过程中,色谱条件的发展,最后,0.1%的甲酸(V: V)水和ACN研究者用更好的响应。醋酸铵会抑制信号反应,甲醇降低峰的对称性。质谱参数包括干燥气体,鞘气体,和毛细管电压优化序列获得更好的响应研究者用。节中列出的结果2。4和表2。
3.2。样本提取
细胞内药物提取,细胞被萃取溶剂(甲醇),细胞溶解和细胞碎片和研究者用收集在一起。几个步骤进行了进一步去除干扰物,因为简单的离心过滤和/或不能完成这个消除。在蒸发之前,标准与病态HLB固相萃取(SPE)、MCX、或MAX墨盒(美国米尔福德港水域有限公司)进行了测试,但复苏低(< 50%)在SPE获得。和简单的蛋白质沉淀测试使用甲醇(1:3 V: V), ACN (1: 2、V: V),丙酮(1:2、V: V),或10%三氟乙酸(1:1,V, V),但研究者用的反应是抑制严重的细胞碎片。最后,样本蒸发首先去除挥发性化合物和剩余重组甲醇和解决方案,然后进行离心获得一个令人满意的基体效应和恢复。
3.3。方法验证
3.3.1。特异性
研究者用的保留时间为1.92和2.23分钟,分别。比较空白的反应,飙升后,LLOQ,实际样品(图2),没有明显干扰的反应空白样本< 20%的研究者用LLOQ样本和5%的。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3.2。线性校正曲线和LLOQ
校准曲线是通过计算峰面积比(分析物/是)与标称浓度。八从飙升样本,获得校准标准和最佳线性最小二乘残差获得的权重因子下1 /χ2。研究者用的线性相关系数超过0.99。典型的回归方程如下:Y= 0.001163∗x+ 0.006233,r= 0.9976,LLOQ = 20 ng / mL。LLOQ是校准曲线的最低点。线性范围20 - 5000 ng / mL, 1 /体重因素χ2。反演计算偏差在±15%。
3.3.3。遗留物和稀释效应
遗留物样本之间在后者往往导致混乱,尤其是当后者有更低的浓度。在这种方法中,最高的校准标准和空白样本注入有序三周期评估空白样品中的分析物的反应。结果表明,没有一个明显的反应在空白样品(图3)。评估稀释效应,五个复制飙升10000 ng / mL样品刚做好的5倍和稀释介质,以这种方法来衡量,以及稀释因子的再保险%和RSD %在±15%,不到15%。
(一)
(b)
3.3.4。Interday和日内精密度和准确度
LLOQ,低,中,高尖的样品(20、50、500和4000 ng / mL)选择和分析国际米兰,日内精密度和准确度。研究者用的盘中精度为1.03 -3.96%,盘中准确性−0.77 -3.60%,盘中精度2.24 - -5.5%,盘中准确性−0.79 - -3.74%,所有这些满足药典(表的要求3)。
3.3.5。基体效应和恢复
预处理的基体效应和提取恢复了在低和高质量控制样品(50和4000 ng / mL)在六个复制(使用中作为一个矩阵)。研究者用基体效应的范围从88.82%到93.64%,并提取复苏的研究者用从93.52%到94.56%不等。RSD %调整矩阵的系数范围从-7.92%和1.01%提取复苏,它的范围从0.81%到-3.68%。基体效应和提取复苏的结果如表所示4。
3.3.6。稳定
稳定性研究的结果总结表5,包括长期稳定在-80°C(一个月),短期稳定autosampler(24小时),和三个frozen-thaw稳定的周期。偏差的测量分析物的浓度比标称浓度在±15%。
3.4。厘米的影响从不同数量的MC38 NIH3T3细胞耐药
探索的NIH3T3 MC38耐药性,我们对待不同数量的基质细胞与研究者用5μM 24 h, CM是收集和转移治疗MC38细胞。研究者用的浓度是确定MC38 NIH3T3细胞和介质,这两种细胞的数量是量化与MTT (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴)四唑试验。我们之前使用不同浓度的研究者用解决方案治疗MC38,和IC50值被计算为5μ(数据未显示)。如图4,研究者用的浓度在NIH3T3介质不同组之间没有明显变化,证明NIH3T3的数量没有影响的研究者用浓度中(图4(一))和胞内(图4 (c)),MC38中,没有发现差异在不同组织(图4 (b)),但明显降低浓度的研究者用MC38细胞内被发现,当处理厘米从更多的NIH3T3细胞(P< 0.01)(图4 (d)),和更多的数量的MC38量化与CM从更多的NIH3T3细胞(治疗组P< 0.05)(图4 (e))。我们的结果证明NIH3T3可以增强耐药性MC38研究者用,曾与NIH3T3数量正相关。研究者用的流出MC38提高了NIH3T3细胞可能是潜在的机制。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
近年来许多研究集中在研究者用和结肠癌细胞(16- - - - - -20.]。对研究者用化疗耐药(21- - - - - -24)已成为一个严重的问题在临床实践中,将近一半的转移CRC患者耐药性情况,研究者用和底层机制包括(1)代谢酶的基因突变;(2)增强药物流出;(3)具备干细胞改善癌细胞;(4)基质细胞介导肿瘤细胞的耐药性。Lotti et al。25]证明基质细胞治疗化疗药物(FOLFOX)秘密IL-17A促进起始细胞的自我更新和入侵26]。这什么et al。27)发现,肿瘤相关巨噬细胞诱导阻力研究者用化疗在CRC腐胺的释放。王WM等人报道,成纤维细胞分泌胱氨酸和谷胱甘肽来帮助癌症细胞流出铂,可以废除效应T细胞。在我们的初步研究,我们跟踪的变化研究者用NIH3T3和MC38之间,发现NIH3T3细胞可能提高研究者用MC38流出。进一步的研究需要阐明的具体机制,NIH 3 t3调解的耐药性MC38研究者用,结果可能铺平道路的优化5-FU-based化疗在临床实践中。
4所示。结论
在这项研究中,一个敏感和快速UHPLC-MS / MS法测定的研究者用细胞和介质建立和验证。校准曲线范围从20到5000 ng / mL,完全覆盖结肠癌细胞系的药物浓度。该方法已成功应用在决定细胞内和细胞外的研究者用浓度MC38细胞治疗由不同数量的CM NIH3T3细胞。NIH3T3可以增强耐药性MC38研究者用,与NIH3T3数字显示一个积极的关系,需要进一步的研究来发现基质细胞的机制介导肿瘤细胞的耐药性研究者用。
缩写
| 研究者用: | 5 -氟尿嘧啶 |
| UHPLC-MS /女士: | Ultrahigh-performance液相色谱串联质谱分析 |
| 儿童权利公约: | 结肠直肠癌 |
| CAF: | 癌症相关成纤维细胞 |
| MC38: | 老鼠的结直肠癌细胞 |
| NIH3T3: | 小鼠结肠直肠纤维母细胞 |
| 5-BrU: | 5-Bromouracil |
| 是: | 内部标准 |
| 雨: | 乙腈 |
| DMEM: | 杜尔贝科修改鹰的媒介 |
| SRM: | 选择反应监测 |
| BSA: | 牛血清白蛋白 |
| CM: | 培养基 |
| 麻省理工: | (3)- 4 5-Dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴离子 |
| LLOQ: | 下限的量化 |
| 应急服务国际公司: | 电喷雾电离 |
| APCI: | 大气压化学电离。 |
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称他们没有利益冲突有关这篇文章的内容。
作者的贡献
枫泾徐和志鹏王同样这项工作。
确认
这项工作由上海市自然科学基金的支持,中国(没有。17411972400),中国国家自然科学基金(没有。81830109),中国国家重点研发项目(没有。2018 yfc1707300),白求恩探索的项目:能力建立药学研究(批准号b - 19 h - 20200622)