敏感的量化Liensinine生物碱使用HPLC-MS / MS方法在Microvolume鼠等离子体及其应用

文摘

Liensinine,莲子的重要生物碱,抗艾滋病等多种功能,抗癌,抗抑郁药和抗高血压属性。在这项研究中,一个高度敏感的HPLC-MS / MS方法的开发和验证的liensinine量化microvolume鼠血浆低至45μl使用反相色谱分离进行了Gemini-C18列(100毫米身份证。×5×3毫米μ米),和大规模的选择性检测使用多个反应监测是获得使用电喷雾电离源,它积极的运作模式。Dauricine作为内部标准。precursor-to-product离子过渡m / z 611.15 > 206.10检测liensinine被选中;625.25 m / z > 206.10被用于dauricine的检测。发达的方法是线性浓度范围的0.05 -1000 ng / mL,一个优秀的确定系数(R²= 0.991)。复苏的范围从92.57%到95.88%在三个质量控制水平。盘中,interday精密度和准确度小于12.2%和6.59%,分别。量化的下限(LLOQ)是0.05 ng / mL。基体效应是微不足道的和可接受的。验证方法成功应用于药代动力学研究liensinine的老鼠。该方法可用于在活的有机体内研究中药的质量控制以及包含liensinine生物碱的花草茶。

1。介绍

莲子心是绿色的胚胎莲子坐落在两个子叶(1]。在中国,人们普遍消费作为一种茶在夏天。l .胚芽被广泛用作抗炎,抗抑郁,制冷和收敛剂在东南亚和中国2]。各种活性成分分离和从lotus特征包括生物碱、脂肪油,黄酮类化合物,常用药用,维生素3- - - - - -6]。生物碱的主要成分是莲花(7]。类似于其他bisbenzylisoquinoline isoliensinine和甲基莲心碱等生物碱,liensinine也展品抗艾滋病毒(8,抗心律失常的9,10,抗炎11,12],退热剂[13,抗癌14),抗抑郁药(15,16),和抗高血压17]属性。

确保liensinine的安全性和有效性,准确,有效的,高度敏感的检测方法是必要的。各种方法包括高效液相色谱法(18,19),薄层色谱法(TLC)扫描20.高速逆流色谱(HSCCC) [],21,22),但是23- - - - - -25],HPLC-TOF-MS [26)开发liensinine测定生物碱的植物提取物和生物样本。这些方法不敏感或需要大量的血浆样品。此外,样品制备技术也效率低下;例如,只使用离心样品制备(25]。

在这项研究中,我们开发了一个高度敏感,充分验证HPLC-MS / MS liensinine生物碱的检测和量化的方法。该方法提供了一个小周转时间分析和高灵敏度的使用一个简单的液液萃取microvolume鼠血浆(45μL)。样品制备对复苏和基体效应的影响是通过比较两种不同的萃取过程,也就是说,蛋白质沉淀(PPT)和甲基叔丁基醚(MTBE)液-液萃取(米歇尔)。与PPT相比,MTBE米歇尔最干净的样品提供了一个更高的恢复和减少了基体效应。比较研究(高pH值与低pH值移动阶段)使用两种不同的反相柱(pH值稳定Gemini-C18比正常Sunfire-C18)也进行了评估pH值对liensinine生物碱的敏感性的影响。与酸性条件(pH值2.5)相比,更高的灵敏度在高pH值(10)条件。量化的下限(LLOQ)是0.05 ng / mL,低于之前报道的100倍LLOQ [23,25]。发达的方法可用于在活的有机体内研究和质量控制(QC)包含liensinine生物碱中药和草药茶。

2。材料和方法

2.1。试剂和标准

以下使用化学药品和试剂:liensinine生物碱是购自天津Shilan科技,中国。内部标准(是)dauricine购买从北京Beina Chuanglian生物技术研究所(中国,北京)。HPLC-grade甲醇和乙腈(ACN)购自热费希尔科学(美国宾夕法尼亚州匹兹堡)。Mass-grade甲酸和碳酸氢铵(NH)₄HCO₃)从Sigma-Aldrich购买(瑞士)。MTBE是购自上海Richjoint化学试剂(上海,中国)。水是生产使用mk - 459微孔Milli-Q +超纯水系统。等离子体是分开收集的血液retro-orbital老鼠的出血。

2.2。仪表和HPLC-MS / MS条件

岛津制作所(日本京都)三重四极杆串联质谱仪质8040配备了电喷雾电离(ESI)是用于分析。设备包含两个Nexera LC-20AD泵,CTO-20AC柱温箱,一个DGU-20A脱气器(日本岛津公司公司,日本京都),一个SIL-20AXR autosampler, 20和通信总线模块。质/女士是界面上的,使用计算机控制软件”实验室解决方案^®5.72版”(日本岛津公司公司,日本京都)。一个Phenomenex^®美国双子RP-C18列托兰斯,CA(100毫米身份证。×5×3毫米μ1 - 12 m)与pH值稳定范围和水域^®美国Sunfire-C18列米尔福德(150×3.5×2.1毫米身份证μ在40米)与pH值稳定范围2 - 8°C。LC流动相由10毫米碳酸氢铵缓冲溶液(pH值调整到10氢氧化铵)和移动B阶段包含50:50 (v / v)的混合物ACN-methanol 0.4毫升/分钟的流量在一个简单的二元梯度时间计划。梯度时间计划使用如下:最初短权力平等主义的部分10%的B 0.3分钟,紧随其后的是一个线性梯度B部分是在1分钟从10%上升到95%,95%的权力平等主义的洗脱B在接下来的3分钟,然后列1分钟内回到它的初始条件。流量从0.4毫升/分钟提高到1.0毫升/分钟时间3.0 - -3.5分钟,举行这个流率在接下来的0.5分钟,并回到初始流量(0.4毫升/分钟)4.5分钟,和列reequilibrated下样品的分析。总运行时间为7.0分钟,其中包括reequilibration的列。这一策略有助于消除强烈保留在RP列矩阵组件,从而增加列的生活并确保有一个轻微的翘尾因素在随后的运行。

质谱仪是在积极的电喷雾多反应监测(MRM)模式对目标分析物(liensinine)和。质谱参数优化获得最高的MRM信号。parent-to-product离子对m / z 611.15 > 206.10使用MRM liensinine,和m / z 625.25 > 206.10被用于。在线六端口双位阀是用于从LC系统介绍了废水的质谱仪高峰期间洗脱时间,也就是说,从2.25分钟3分钟,或者转移到排水前后峰洗脱时间。

接口参数也优化产生离子的最大强度。优化界面参数如下:喷洒气体流量的3.0 L / min (N₂,纯度> 99.999%),反溶剂线(DL) 280°C的温度,加热块温度为400°C,干燥气体流量的15.0 L / min, 4.5 kV,接口的接口电压电流为0.3μ检测器电压1.88 kV, CID气体(他,纯度> 99.999%),230 kPa和压力。碰撞能量(CE) liensinine 36.0 eV和39.0 eV,分别。

2.3。准备的解决方案

股票的解决方案liensinine(图1(一))是由溶解1毫克/毫升的甲醇。股票的解决方案是在黑暗中储存在−20°C。工作标准解决方案(0.5、1、5、50、500、1000、3000、5000和10000 ng / mL)在甲醇-水(5:95年,v / v)准备从股票的解决方案。校准标准解决方案(0.05,0.1,0.5,5,50岁,100年,300年,500年和1000 ng / mL)是由无毒鼠血浆飙升(45μL) 5μL工作的相应的解决方案。三个QC样品0.05(低质量),5.0(介质QC),和750 ng / mL(高质量)准备确定矩阵的影响,精度、准确性、复苏,和稳定的方法。QC样品准备在空白血浆(45μ与5 L)飙升μL工作的相应的解决方案(0.5 ng / mL, 50 ng / mL,和7500 ng / mL),分别。同样,一个dauricine(图1 (b))股票的解决方案是准备在1毫克/毫升的浓度溶解在甲醇。这支股票的解决方案是用甲醇-水稀释(5:95年,v / v)生产的最终浓度20 ng / mL。

2.4。样本提取

药物提取、50μ样品和50 L的越来越多μL是(20 ng / mL)的解决方案是混合在一个prelabeled离心管的涡混合30年代。混合物中提取了350年μL MTBE的漩涡高速搅拌2分钟,然后在14500 g离心10分钟。上有机层被转移到另一个prelabeled 1.5毫升埃普多夫管。上层清液干下的N₂在45°C,残留于200年重组μL甲醇-水(5:95 v / v)。这个重组的解决方案是用5分钟在室温下超声发生器,然后过滤(0.22μm膜过滤器),转移到autosampler瓶。最后,5μL女士注入HPLC-MS /系统进行分析。

2.5。方法验证

特异性的方法验证、校准曲线,敏感性,复苏,延滞,矩阵的影响,精度和准确性(盘中和interday)。

特异性评估通过分析获得的空白血浆从六个不同的老鼠和比较它们与空白血浆LLOQ飙升并提取样品。

方法的线性估计在0.05 ng / mL的浓度范围到1000 ng / mL通过分析九校准标准。的平均峰面积比分析物/ (y设在)策划与分析物标准浓度(x设在)来构建一个校准曲线。最小二乘线性回归是用来获得回归方程(y=mx+b)确定确定系数(R²),y的面积比分析物/;米斜率;x是名义上的分析物的浓度;和b是y拦截。信噪比(S / N) 3是用于确定检测极限(LOD),和S / N 10被用来确定LLOQ。

恢复矩阵分析物的确定三个质量控制水平。获得的平均峰面积比率分析物/ prespiked和提取的样本相比相同浓度的postextracted和飙升的样品(n= 5)。根据验收标准,分析物的恢复,但不需要100%应该是可再生的,精确的,持久的。

基体效应是评估通过比较分析物/的平均峰面积比(postextracted和飙升的样本)与相同浓度的标准解决方案(n= 5)。根据验收标准,基体效应不应> 15%的标准解决方案。

盘中,interday精密度和准确度测定三个质量控制水平,在同一天,连续三天。根据验收标准,精度和准确性不应该> 15%的实际浓度除LLOQ (≤20%)。

稳定性研究进行了四个质量控制水平,也就是说,在环境温度12小时(短时间内),在autosampler条件24 h,三冻融循环后,在−20°C一个月(长期)。验收标准是90 - 110%相比,刚做好的解决方案。

2.6。应用药代动力学研究

健康男性的雄性sd大鼠中(n= 15)重220 g±20 g从实验动物中心,获得西安交通大学,中国。在实验开始之前,老鼠被安置(控制环境条件与免费获取食物,水,和12 h黑/光周期)。食物是保留12 h后剂量和恢复4 h后采样的开始。五天的适应时期给老鼠调整在新的环境条件。12 h后黑/光周期和禁食12小时,三组大鼠接受单剂量口服5,12.5,25毫克/公斤的liensinine口服填喂法。血从老鼠使用retro-orbital出血方法收集。老鼠轻度麻醉乙醚给最小的痛苦。执行一系列的血液抽样间隔的0.00,0.08,0.25,0.5,1、3、6、9、12、24小时从每个老鼠。在1.5毫升血液收集埃普多夫管(处理0.5%肝素生理盐水)。血液样本离心机在4°C(14000克10分钟)立即获得等离子体(90μL)。血浆样本存储在−20°C在黑暗中,直到分析。

2.7。统计分析

日本岛津公司”实验室解决方案^®5.72版”软件是用于峰面积积分。最小二乘线性回归是用来生成校准曲线数据。5.0 GraphPad棱镜用于生成plasma-time浓度曲线。Liensinine血浆浓度与时间数据为每个组的老鼠进行了分析使用药物和统计软件(DAS,版本3.0,上海BioGuider医药技术,中国)。

3所示。结果与讨论

3.1。开发和优化HPLC-MS / MS条件

全扫描质量(100 - 1000 Da)光谱,即应急服务国际公司积极和ESI - liensinine,,如图所示2(一个)。最好的电离模式liensinine和ESI⁺。作为质子化了的米+H]⁺前体离子产生了liensinine (m / z 611.15)和(625.25 m / z),前体离子(米+H]⁺被分散在串联模式collision-induced离解(CID)生产相应的产品离子(图2 (b))。Parent-to-product离子质量选择过渡611.15 > 206.10的检测liensinine和m / z 625.25 > 206.10。

LC方法的开发过程中,不同的移动阶段反复试验基地进行评估。其中包括ACN,甲醇,ACN-water混合物,甲醇-水混合物为0.1%甲酸(pH值2.5)没有甲酸,NH或10毫米₄HCO₃缓冲(pH值10)。Liensinine,基本性质和主要存在于电离形成在低pH值(0.1%甲酸,pH值2.5)。因此,峰保留时间较短(小于1分钟)是观察,观察和强度两列(水域Sunfire RP-C18, 150毫米×2.1毫米,证件×3.5μm,和双子座RP-C18, 100毫米×3.0毫米身份证。×5μ(数据3(一个)和3 (c))。流动相是0.1%甲酸(pH值2.5),和移动阶段B是一个ACN /甲醇(50:50 v / v)混合物。流量为0.4毫升/分钟。这些结果(分析物的保留时间和强度)同意先前的研究获得的(23- - - - - -25最常用的0.1%甲酸条件下)。如果保留时间短,早期的亲水洗脱矩阵组件可能干扰电离过程的分析物。因为这些亲水性差矩阵组件保留RP-C18列,它们与分析物coeluted (s) (27]。

基本分析物主要存在于工会形成高pH值,两个单位高于pKa价值。在高pH值移动阶段,基本化合物导致不再保留,好峰的形状,和优秀的色谱效率(28,29日]。铵离子在本质上是不稳定的和兼容质谱仪;因此,10毫米碳酸氢铵缓冲pH值10 a作为流动相移动阶段B是ACN-methanol的混合物(50:50 v / v)。高强度峰值,良好的分辨率,不再保留(liensinine 2.58分和2.75分),和对称双子RP-C18观察,100毫米×3.0毫米身份证。×5μ米列(图4)。水Sunfire RP-C18列没有使用在高pH值由于硅溶解的可能性。因此,高pH值条件确保更高的灵敏度与低pH值条件下(2,23- - - - - -25]。

3.2。优化样品制备

在样品制备的优化,两个不同的萃取过程,也就是说,PPT和米歇尔。甲醇和ACN测试蛋白质沉淀剂。MTBE是用于米歇尔。PPT, 100μL ACN添加到50μL飙升的样本。同样的步骤与甲醇用于PPT。对于MTBE米歇尔,MTBE (350μL样本(50)被添加到越来越多μL)。结果liensinine复苏后PPT ACN的双重卷和甲醇具有可比性,如表所示1。然而,明显的基体效应观察甲醇作为提取溶剂时,可能由于甲醇的高溶解度的脂质。生产MTBE米歇尔最干净的样品高复苏,而减少复苏甲醇用于样品制备时观察到的。因此,样本提取与MTBE米歇尔节中描述2。4。

3.3。方法验证

方法选择性条评估通过比较空白样品的色谱从六个不同的老鼠的色谱相应飙升样本。空白样品的典型色谱(A),空白样品掺入了分析物在LLOQ和(B),和生物样本从老鼠3 h后获得等离子体口服5.0毫克/公斤(C), 12.5毫克/公斤(D), 25.0毫克/公斤(E) liensinine老鼠(C)如图5。没有检测到内源性干扰分析物的保留时间,表明本文方法的选择性是令人满意的。

发达的方法是线性浓度范围为0.05 ng / mL 1000 ng / mL。确定系数(R²)是0.9913。回归方程被发现y= 0.1255x−0.8251。校准曲线的最低浓度0.05 ng / mL决定10 S / N代表方法的灵敏度(LLOQ),而LOD是0.001 ng / mL的S / N = 3。之前报道LLOQ值167 ng / mL (2),36 ng / mL [18),5 ng / mL (23),10 ng / mL (24),5 ng / mL (25]。因此,开发方法是敏感100倍比最小值(5 ng / mL)报告到目前为止。高度敏感的方法有助于了解药物在体内的时间进程。体内的药物浓度可以监控几个半衰期,这是一个重要的参数评估的程度(毒性)的药物在体内积累。

此外,在几个时间点采集的血液样本确定啮齿动物的临床前药代动力学参数。服用大量血液经常扰乱正常的血液生理、产生错误的结果(30.]。许多方法已经开发出来的决心liensinine生物碱在生物样品使用血浆样本超过100人μL (2,18,23,25]。我们的方法只使用45μ大鼠血浆L。

经济复苏(表2)分析物与MTBE米歇尔提取后表明,高效提取方法恢复目标分析物的矩阵。的恢复质量的三个层次上分析物从92.57%到95.88%不等。

结转期间评估方法验证通过注射空白样品后校准标准上限的量化。用回归方程计算翘尾因素。结果表明,结转后的空白样品高浓度标准是4.94% (liensinine生物碱)和4.63%(是),令人满意的标准。

基体效应结果(表3)表明,基体效应是否在可接受范围之内,从93.26%到106.47%不等。无关紧要的抑制和增强观察MQC和认证机构,分别。然而,抑制和增强的范围内。精密度和准确度(表的结果4)表明,interday和盘中精度(% RE)不到6.59%,而interday、盘中精度(%相对标准偏差)范围从3.28%到12.2%,分别。不同的稳定性评价结果如表所示5,表明样本稳定预期的研究期间。

3.4。药代动力学研究

验证方法成功应用于药代动力学的研究liensinine后大鼠血浆胃内的管理5,12.5,分别为25毫克/公斤。本文方法的灵敏度和选择性适合分析。均值(±SD)血浆浓度时间资料的分析物在胃内的管理(n= 5)liensinine 5, 12.5, 25毫克/公斤。liensinine的主要药代动力学参数计算使用DAS V3.0和noncompartmental分析(表6)。的主要药代动力学参数liensinine后胃内的管理(23- - - - - -25]在5毫克/公斤比较使用DAS V3.0和noncompartmental分析(表7)。liensinine胃内的政府后,血浆浓度liensinine大幅减少在3 h,然后在12 h达到平衡。liensinine在大鼠血浆浓度时间数据最好安装单舱开放模式。的AUC_{0 -∞}和C_马克斯值后胃内的管理结果相比明显降低静脉管理(23- - - - - -25),这表明liensinine生物利用度较低体内。AUC的值_{0- t}和AUC_{0 -∞}和F增加剂量依赖性的方式从5到25毫克/公斤。综上所述,这表明liensinine是线性的Pk概要所使用的剂量范围。

4所示。结论

本研究报告高度敏感和验证HPLC-MS / MS方法量化皮克microvolume鼠liensinine生物碱的等离子体。LLOQ 0.05 ng / mL, LOD是0.001 ng / mL。验证方法是敏感100倍比之前报道的方法。这个方法可以用于体内研究的中药质量控制以及包含liensinine生物碱的花草茶。

缩写

LLOQ:	下限的量化
薄层色谱:	薄层色谱法
HSCCC:	高速逆流色谱法
PPT:	蛋白质沉淀
MTBE:	甲基叔丁基醚
米歇尔:	液液萃取
是:	内部标准
雨:	乙腈
应急服务国际公司:	电喷雾电离
MRM:	多反应监测
DL:	去溶剂化线
CE:	碰撞能量
LOD:	检测极限
米歇尔:	液液萃取
质量控制:	质量控制。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

伦理批准

实验动物伦理委员会的批准西安交通大学实验协议。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(基金号。81703469和81703469),中国博士后科学基金会(没有。2017 m613157),世界一流大学(学科)和特征为中央大学(没有开发指导资金。PY3A012),中央大学基础研究基金。

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