定量测定7 Saikosaponins Xiaochaihu与带电气溶胶颗粒使用高效液相色谱法检测

文摘

Bupleuri基数(中文Chaihu)的主要药物Xiaochaihu颗粒(xg),是中国著名的中药制剂。因为之前的分析方法并没有集中在multiactive saikosaponins Chaihu,很难有效地控制XG市场上的质量。在这个手稿,同时测定7 saikosaponins (saikosaponins C, H, A, B₂、G和B₁在XG)高效液相色谱与带电气溶胶检测(CAD)和确认由LC-Q-Orbitrap,8经。saikosaponins纯化在SPE墨盒和确定水域CORTECTS C18柱(4.6毫米×150毫米,2.7μ米)通过梯度洗脱使用0.01%醋酸溶液和乙腈。结果显示良好的线性的r²对所有分析物值高于0.998。平均回收率在三种不同浓度水平范围从80%到109%,盘中和interday精度(相对标准偏差,RSD %)的1.0%∼∼2.1%,1.9%和1.4%。建立HPLC-CAD方法被应用于15批XG调查批次一致性和可控制性。该方法可以用于XG的质量控制,也是有助于Chaihu及其相关制剂的质量评价。

1。介绍

Xiaochaihu颗粒(xg)源自中国传统医学(中医)经典公式Xiaochaihu-tang在日本(名为Sho-saiko-to)。现代中药制剂是由7草药包括Bupleuri基数(中文Chaihu)、黄芩根(Huangqin)、党参基数(党参)、甘草根(Ganchao)、半夏(Banxia),枣果(Dazhao),和姜根茎(Shengjiang)。它的功能诱导汗水驱散热量,舒缓的肝脏和协调胃(1]。如今,XG由数十个生产销售作为一种成药,广泛用于治疗流感,支气管炎,肺炎,肝纤维化,胃肠疾病在临床实践2,3]。由于其疗效好,副作用少,方便管理,XG一直是最畅销的anticold药品和用于治疗在中国大约每年数以百万计的患者。

Chaihu XG的主要药物是治疗的主要治疗作用的主要疾病和综合征。文学研究报道,saikosaponins有许多药理学活动,如抗病毒、抗菌、抗肝炎,immunomodulating效应(4- - - - - -6),主要有效成分saikosaponin (SSa), saikosaponin C (SSc),和saikosaponin D (SSd) Chaihu [7,8]。因为不稳定的烯丙基氧化债券可以在弱酸性条件下被打破或加热,它们可能是部分或全部转化成saikosaponin B₁(SSa⟶单边带₁),saikosaponin我或H (SSc⟶SSi或SSh),和saikosaponin B₂(SSd⟶单边带₂相应的)。由于缺乏紫外线生色团,HPLC-UV [9saikosaponins分析)是不完美的。蒸发光散射检测器(ELSD) [10)和带电气溶胶探测器(CAD) (10)通常建议分析这些化合物薄弱或没有紫外吸收。加工(10]CAD和蒸发光散射检测器方法相比在Chaihu 10 saikosaponins的同时分析。然而,这两种方法被证明是不适合在XG saikosaponins分析由于含量低,多组分相互干扰。此外,质谱(MS)技术(8,11]一直主要集中在体内代谢研究。包等。8)建立了一个质/ MS方法来确定几个saikosaponin衍生品出现在Chaihu及其phytopharmaceuticals Xiaochaihu-tang,可应用于DMPK评价和研究。质技术有一些局限性大规模常规分析中药由于其昂贵的价格,维护成本高,低渗透。此外,大多数方法旨在Chaihu转移XG分析非常困难,因为活性成分之间的结构转变(7,8]。样品处理过程分析也是一个关键因素。一些新颖的提取方法,如微波辅助萃取(12),超声波辅助提取(12),超声波,slat-assisted液液萃取(13,14),基质固相分散(15,16],vortex-assisted液-液微萃取(17),已经开发了天然产物分析。考虑到实用性和可操作性的定量方法用于QC实验室常规方法包括液液萃取和固相萃取进行了比较和评价。当前中国药典(ChP)方法(1saikosaponins)忽略了分析和日本药典(JP)方法(18单边带)只关注单一成分₂。人们普遍认为多个活动的协同效应组件负责中药制剂的疗效。因此,报告的方法和当前标准不足以有效地确保XG的质量。

在这工作,7 saikosaponins (saikosaponins C, H, A, B₂、G和B₁)在XG明确识别通过比较参考标准使用LC-Q-Orbitrap,8经。所有分析物被纯化和浓缩C18 SPE墨盒。老牌HPLC-CAD方法证明是具体的、可靠和实用的定量测定7 saikosaponins并成功地应用于质量评价XG 15批处理的。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

Saikosaponin (SSa)和Saikosaponin D (SSd)从美国国立购买食品和药物控制(中国,北京)。Saikosaponins C (SSc),我(SSi), H (SSh), G(具体),B1(单边带₁)和B2(单边带₂)购买从成都Desite生物技术有限公司有限公司(中国成都)。其结构如图1。15批XG由广州Baiyunshan光华药业有限公司有限公司(广州)。Sep-Pak C18 SPE墨盒得到水域(米尔福德,妈,美国)。但是有的年级乙腈和乙酸购自费舍尔(英国拉夫堡)。其他试剂均为分析纯,购自泰坦科技有限公司有限公司(上海,中国)。去离子水制备Milli-Q系统(贝德福德,妈,美国)。

2.2。样品制备

2.2.1。参考标准的解决方案

SSc的股票混合标准溶液(0.1 mg·毫升⁻¹),SSi (0.1 mg·毫升⁻¹),SSh (0.1 mg·毫升⁻¹),SSa (0.3 mg·毫升⁻¹),单边带₂(1毫克·毫升⁻¹),江源发展促进会(0.2 mg·毫升⁻¹),单边带₁(0.5 mg·毫升⁻¹)制备甲醇。一系列的混合标准解决方案通过适当的稀释股票绘制校准曲线的解决方案。所有的解决方案在4°C存储在冰箱里,直到分析。

2.2.2。样品溶液制备

3 g的整除XG溶解在6毫升水被加载到一个使用C18 SPE墨盒的先决条件是按顺序用6毫升甲醇和10毫升水。墨盒洗了10毫升10%甲醇水溶液含有5%集中氨和30%甲醇水溶液紧随其后。之后,墨盒使用10毫升甲醇使解除吸附筛选了分析物。洗出液被蒸发干燥使用真空浓缩器。渣是用甲醇溶解,然后转移到一个2毫升容量瓶长大与甲醇的体积。所有的解决方案都是通过一个0.22 -过滤μm LC分析之前过滤膜。

2.3。质条件

saikosaponins的定性识别XG进行了使用Q Exactive™混合quadrupole-orbitrap质谱仪配有Dionex终极3000 LC系统(美国热费希尔科学)。分析物被发现在30°C水域CORTECTS C18柱(4.6毫米×150毫米,2.7μ米)。0.01%的流动相是由乙酸(A)和乙腈与梯度洗脱程序(B): 0∼9分钟,5 - 25% B, 9日∼16分钟,25 - 35%的B, 16∼23分钟,35 - 60% B, B和23日∼30分钟,60 - 80%流量为0.3毫升·分钟⁻¹。ESI (H-ESI)加热源操作,和参数优化如下:女士喷涂电压、3.5 kV;鞘气流,40 L /分钟;辅助气体流量、10 L /分钟;毛细管温度、320°C;辅助气体加热器温度、350°C。一个完整的/ dd-MS女士²(数据依赖的女士²)方法用于收购。完整的扫描范围是在负离子模式下从100年到1500年在70000年和17500年的一项决议²扫描。MS / MS谱被高能分散collision-induced离解(HCD)规范化碰撞能量(指标)值在10%的水平,20%,30%。日期采集和处理与Xcalibur完成软件(版本4.2,热费希尔科学、美国)。

2.4。HPLC-CAD色谱条件

Dionex终极3000 LC系统(热费希尔科学、美国)组成的真空脱气装置,四元泵、autosampler,恒温器列车厢,CAD,与Chromeleon软件,用于定量分析。列、流动相、柱温度一样质条件。梯度洗脱程序如下:0∼55分钟,30 - 32%,50∼58分钟,32 - 90% B, 58∼60分钟,90 - 30% B,最后,整理列有30% B权力平等主义的10分钟。流量为0.8毫升·分钟⁻¹,注入体积是10μl . CAD的氮入口压力设置为50 psi和喷雾器室温度是50°C。

2.5。方法的验证

定量HPLC-CAD方法充分验证的特异性,线性、检测极限(LOD),定量限度(定量限),内部interday精度,可重复性和准确性依照我指导Q2 (R1) [19]。特异性评估从空白的解决方案,通过比较获得的色谱混合标准溶液,没有Chaihu测试样本和测试样本。一系列的混合标准解决方案在6个不同浓度水平是准备和绘制校准曲线,在哪里y和x代表的对数峰面积和浓度的对数(μg·毫升⁻¹)。LOD和定量限与甲醇稀释测定参考标准的解决方案,当信噪比口粮(S / N)约3:1和10:1,分别。为内部和interday精密,混合标准溶液测定在同一天(n= 6)在连续三天,分别。六个复制按照测试方法代表单个批处理准备和分析证明了可重复性。的精度和可重复性进行了评估,计算每个峰面积的相对标准偏差(rsd)。经济复苏是用来表达的准确性的方法,这是由已知数量的激增样本三个浓度水平(50%、100%和150%)的混合标准溶液。

3所示。结果与讨论

3.1。方法优化

蒸发光散射检测器和CAD通用探测器和明显的优势在检测这些化合物薄弱或没有紫外吸收。这两个探测器之间的性能比较研究了一些研究人员(10,20.]。这是表明CAD在线性优越,灵敏度、重现性和清晰度峰值。因此,CAD作为有价值的替代蒸发光散射检测器用于药物分析(21- - - - - -23]。

XG是多种草本植物混合,从而有一个广泛的复杂和多样的化学成分24- - - - - -27]。低的saikosaponins测定是困难的,因为内容和多组分相互干涉XG。样品处理过程能够净化和集中分析物可以解决这个问题。液液萃取(米歇尔)使用水饱和正丁醇溶液和C18 SPE筒进行了比较。表明,米歇尔是无法去除的主要干扰成分黄芩苷在Huangqin彻底和其他杂质,而SPE盒有明显优势的提取速度、精度和可靠性,因此用于样品制备。三个品牌的SPE墨盒(水,Sepax技术,和Welchrom)进行了研究,并发现水盒清理效率高和良好的复苏与他人相比。Saikosaponins完全吸收在C18筒在使用低比例甲醇在碱性溶液作为洗脱液,能摆脱最干扰组件。不过,他们也很容易被洗脱眠比例高的甲醇溶液。

在参考文献[描述的HPLC-CAD色谱条件10)是最初未遂,但发现不适合在XG saikosaponins分析保留时间漂移,可怜的峰形状,分析物之间的低分辨率,及其附近的山峰。几个梯度程序通过使用不同的流动相添加剂(甲酸、醋酸和醋酸铵)进行调查,得到更好的分离和更高的响应。

3.2。定性识别Saikosaponins

在XG 7 saikosaponins山峰明确确认女士通过比较他们的保留时间和紫外光谱与参考标准的解决方案。提取离子色谱(共同)和MS / MS数据呈现在图2和表1。峰3显示在图2初步确认是根据文献[rotundioside D26]。SSd(最高9)没有发现在测试样本,可能是因为它已经完全变成了单边带₂(6)峰值在XG的生产。这个结果是按照文献报道[8]。

3.3。方法验证

如图3,没有干扰峰出现在目标分析物的保留时间在测试样本,这表明该方法具体。线性回归、相关系数(r²)、线性范围、LOD、定量限内,interday精度、可重复性和表7列出分析物的复苏2和3。结果显示良好的线性关系,精度高。重复性的变化(RSD %) NMT 6.0% SSc, SSa,单边带₂江源发展促进会,单边带₁和NMT SSi和SSh为8.0%。的平均回收率三个不同浓度水平在80%和109%之间。这些获得值说明伟大的重复性和准确性。

3.4。样品分析

验证HPLC-CAD定量方法也被应用于确定7 saikosaponins (SSc, SSi, SSh, SSa,单边带₂江源发展促进会,单边带₁在15批XG)。结果(毫克/包, )呈现在图4。的内容在XG saikosaponins单边带的顺序₂>单边带₁> SSa > SSh≥江源发展促进会> SSi > SSc。SSa的高标准差值,单边带₂,单边带₁可能在15批次Chaihu的质量差异造成的。考虑到结构变换在处理过程中,目标分析物的总含量计算每一批质量评估。平均含量为1.37毫克每包和相对标准偏差(RSD %)为4.4%,这表明接受批次一致性和可控制性。包等。8)报道,主要包含在测试Xiaochaihu-tang saikosaponins和Sho-saiko-to样本单边带₂(26.9%),SSa(25.8%)、单边带₁(22.4%),江源发展促进会(14.3%)、SSc (6.9%)、SSh(5.4%),和SSi (2.9%)。我们的研究结果和文献数据之间的差异主要是由于不同的草本萃取过程XG和Xiaochaihu-tang (Sho-saiko-to)。

4所示。结论

总之,7 saikosaponins (SSc, SSi, SSh, SSa,单边带₂江源发展促进会,单边带₁)在XG明确标识使用LC-Q-Orbitrap,8经,因此选为质量控制组件。特定的、敏感和准确HPLC-CAD方法在确定分析物被描述在这个手稿。一个C₁₈SPE盒是用来净化和洗脱的分析物集中了10%甲醇水溶液含有5%集中氨和30%甲醇水溶液,然后由甲醇。7 saikosaponins被布置得井然有序的山峰,虽然大多数分析物的异构化合物。这种定量方法可以满足质量控制的要求质量分析实验室。同时,该方法可以用于Chaihu及其相关制剂的质量评价。

缩写

HPLC-CAD:	高效液相色谱法与带电气溶胶检测
LC-Q-Orbitrap,8经:	液相色谱与混合quadrupole-orbitrap质谱仪
XG:	Xiaochaihu颗粒
中医:	中国传统医学
NMT:	不超过
:	平均值±标准偏差。

数据可用性

本研究使用的数据来支持来自GenChim测试(上海)有限公司,有限公司,上海,中国,可从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究得到了国家重点研发项目的中国(2018 yfc1707300)。

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