通过HPLC-DAD和汤制备方法及其转化途径（茵陈）六酚酸在茵陈的定量分析

摘要

本研究旨在建立5-咖啡基奎酸、3-咖啡基奎酸、4-咖啡基奎酸、1,3-双酚基奎酸、3,4-双酚基奎酸、4,5-双酚基奎酸六种成分的定量分析方法茵陈采用高效液相色谱联合DAD法对银杏及其汤进行了研究。并分析了六种成分在汤剂制备过程中的转化途径。该分析方法在线性、灵敏度、精密度、重复性、回收率等方面均得到充分验证，并应用于银辰汤中6种成分转化趋势的评估和定量分析。银杏和银杏汤中6种成分的含量差异较大，且两者之间存在着不可分割的内在联系。推测3-咖啡基奎酸被异构化，生成5-咖啡基奎酸和4-咖啡基奎酸。同样，4,5-双affeylquinic酸异构化得到1,3- dicaffeylquinic酸和3,4- dicaffeylquinic酸。综上所述，本研究为银辰汤的质量控制提供了化学依据，并通过筛选的标记物的变化，为研究物质与药效的关系提供了新的视角。

1.介绍

中国传统医学上经常使用在临床上，其煎剂对中国医生最常用的剂型成分的药物，它也是中国药材的最古老和最广泛使用的准备。不过，也有它的详细研究不多，尤其是对单味中药汤剂，其内涵和外延都不清楚[1，2]。茵陈（YC），其属于埃希艾家庭菊科，是由两个物种的，艾scoparzaWaldst。等套件。和茵陈藤，它们由两个不同的名字，根据不同的收获季节定义。所述植物的地上部分被收获在秋季和所谓的“华茵陈”，并在弹簧收获所述植物的相同部分被称为“绵茵陈” [3]。“面阴臣”是临床常用的饮片。

YC主要含有酚酸、类黄酮和香豆素[4-7]。和酚酸已被证实具有多种生物学功能，包括抗氧化作用[8，9]，消炎（药 [10),抗菌11]，细胞保护性[9],王亚南[12，13]及抗骨质疏松[14，15]效应。他们被认为是YC药草重要的活性成分。到目前为止，一些研究在YC草药研究一种或几种活性成分的分析，上述[16，17或含有YC的草药配方[18-22]。此外，HPLC-DAD和HPLC-高分辨率MS被应用于研究8种有机酸和分析可能在制备YC提取物在它们之间发生的可能变换[23]。

饮片标准汤剂由使用标准的过程中应受中国传统中医理论为指导，根据临床实践中单味药，并提到了现代的提取方法与标准工艺[2]。虽然这些研究对YC药材或其制剂的质量控制有一定效果，对YC的药草和YC煎剂及其转化途径之间酚酸的质量控制没有系统性相关的研究。因此，有必要建立一个全面的分析方法来识别和测定YC汤的酚酸。而且它调查的酚酸改造是否可以发生在汤的准备，可能转化途径，以及是否存在。这是非常重要的，以确保安全性，有效性和质量YC汤稳定性。

本研究的目的是开发和验证一个新的分析方法来分析酚酸的质量控制YC汤使用多个标记,即5-caffeoylquinic酸,3-caffeoylquinic酸,4-caffeoylquinic酸,1,3-dicaffeoylquinic酸,3,4-dicaffeoylquinic酸,和4,5-dicaffeoylquinic酸。为此，建立了一种采用高效液相色谱-二极管阵列检测的方法分析YC汤及中药的化学成分。另外，在不同加热温度和加热时间下，研究了六种酚酸在水煎过程中的浓度变化。该方法可用于黄芪汤及黄芪药材的定性和定量分析，可作为黄芪汤及黄芪药材质量评价的新工具。煎煮过程中酚酸浓度的变化可以为研究物质与药效的关系提供一些新的思路。

2.实验

2.1。化学品，试剂和材料

5-咖啡基奎尼酸化学标准(批号:X-014-180410)、3-咖啡基奎尼酸(批号:4-咖啡基奎尼酸(批号:Y-067-180425) 1,3-双酚基奎尼酸(批号E-007-190118)， 3,4-二苯醌(批号:Y-069-170516)， 4,5-双酚基奎尼酸(批号:Y-070-171216)购自生物净化植物化学有限公司(中国成都)。其结构如图所示1。

乙腈和甲酸是这是从阿拉丁化学公司（上海，中国）购得HPLC级的。其他试剂溶液均为分析纯（上海化工，上海，中国）。用于色谱流动相纯净水是从中国资源异宝饮料（中国）有限公司（广州，中国）。

2.2。植物材料和样品预处理

本品采自中国不同地区。YC草药的来源见表1。马志国博士鉴定了它们的植物来源，它们来自干燥的地上部分茵陈藤。的菊科。凭证标本均在药房暨南大学学院，沉积。收集后，将样品在50℃下[干燥24]。


不。	批号	原产地	不。	批号	原产地

YC-1	180810	陕西	YC-7	HX18H01	陕西
YC-2	180421	山东	YC-8	180401	河南
YC-3	180301	山东	YC-9	20180601	山东
YC-4	181001	甘肃	YC-10	171201	陕西
YC-5	18Z0601	山东	YC-11	2017120731	山西
YC-6	180809	陕西	YC-12	1809003	山东

2.3。标准溶液的制备

含有5-咖啡酰奎宁酸的混合标准储备溶液（1），3-咖啡酰奎宁酸（2），4-咖啡酰奎宁酸（3），1,3-二咖啡酰奎尼酸（4），3,4-二咖啡酰奎尼酸（5），和4,5-二咖啡酰奎尼酸（6）在20％甲醇中的溶液制备。所有标准溶液通过过滤0.45μ注射分析前米的尼龙膜。

2.4。样品溶液的制备

Preparation of YC decoctions: YC herbs (50 g) were soaked in 600 mL distilled water (1 : 12, w/v) for 30 min and then refluxed by boiling for 1 h. The extract was filtered through a 200-mesh filter cloth. Then, 500 mL of water was added to the filter residue and heated to reflux for 20 minutes. The two filtrates were then combined and concentrated in vacuum to 250 mL, and mixed to obtain a concentration of 0.2 g crude drug/mL. Then, the YC decoction (1 mL) were measured accurately into a 10 mL volumetric flask with stopper, and 10% methanol was added to dilute to the mark, and filtered through 0.45 μ注射用m膜。

YC中草药溶液的配制:将已筛(24目)YC中草药样品的干粉准确称取1 g，放入100ml带塞的锥形瓶中，加入50%甲醇50ml，静置30min。取锥形瓶前后称重。将提取液过滤，准确测量5ml，置于25 mL带塞子的锥形瓶中，加入50%甲醇，摇匀，过滤，滤液通过0.45-μ米注射器注入到用于分析的HPLC系统之前过滤器（尼龙，金龙，天津，中国）。

2.5。装置和HPLC色谱条件

定量分析使用Thermo UltiMate 3000 HPLC系统(美国)，配备DAD (190-400 nm)、柱温控制器和自动采样器。Agilent Eclipse XDB-C₁₈柱(250mm×4.6 mm, 5μm)使用并保持在30℃。流动相为0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)，其梯度程序如下:0 ~ 20 min，线性梯度7% ~ 15% B;20 ~ 30分钟，线性梯度15%-20% B;30 ~ 35分钟，等相洗脱20% B;35 ~ 45分钟，线性梯度20% ~ 25% B，流速为1.0 mL/min时，postrun(5分钟)。注射体积为5英寸。在330 nm处进行信号监测。

2.6。的HPLC方法的验证

2.6.1。校准曲线，检测限，和孔定量科幻阳离子

为了评价该方法的线性度，校准曲线是从色谱峰面积建立（ÿ)相对于浓度(X)的每个组成部分。计算了六种组分的回归方程ÿ=一个X + b. The LOD and LOQ for six constituents were estimated at小号/ñ的3〜10，分别由注射用已知浓度的一系列稀释溶液。

2.6.2。精度和稳定性

在一天中六个重复进行对各构成盘中精度。And to confirm the stability, sample 4 was analyzed at 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20, and 24 h, respectively. Variability was expressed by RSD (%).

通过分析同一样品(No. 4)配制的六种不同工作溶液来评估重复性，峰面积的变化以RSD值的百分比表示。

2.6.3。复苏

在YC煎煮液中加入已知剂量的混合标准溶液(100%样品中已知剂量的标准溶液)，测定了六种成分的回收率。通过比较标准品的测定量和原添加量，计算回收率。

2.7。在不同温度下六酚酸的转化途径

将同批YC煎液分成4等份，置于4个圆底烧瓶中。电加热套分别设置在40、60、80、100℃，加热0.5、1、1.5、2、2.5、3.0 h。取适量的溶液，在不同的加热时间，稍冷，然后通过0.45-支数m的微孔膜。

3。结果与讨论

3.1。HPLC条件的优化

考察了不同流动相和色谱柱对HPLC分析结果的影响。经多次试验发现，选用乙腈- 0.1%甲酸作为流动相，具有良好的分辨率和对称的峰形。一个安捷伦TC-C₁₈Column (5 mm, 4.6 × 250 mm) and an Agilent eclipse XDB-C₁₈Column (5 mm, 4.6 × 250 mm) were tested. The analytical results showed that the latter one was more suitable, exhibiting better peak separation. The detection wavelength was selected at 330 nm according to the analytical results of 3D plots. Representative chromatograms for the standard analytes and the samples are shown in Figure2。

（一个）

（b）中

（C）

3.2。在通过HPLC样品成分的鉴定

根据参考文献[23，25]，本色谱和中国医药标准条件下，六个峰值检测从这些样品被鉴定为5-咖啡酰奎宁酸（峰1），3-咖啡酰奎宁酸（峰2），4-咖啡酰奎宁酸（峰3），1，3-咖啡酰奎尼酸（峰4），3,4-二咖啡酰奎尼酸（峰5）和4,5-二咖啡酰奎尼酸（峰6）的其HPLC的保留时间的比较和与那些参考成分的紫外光谱。

3.3。高效液相色谱法验证

通过测定线性度、LOD、LOQ、日内精度、稳定性和准确度，验证了所提的HPLC-DAD定量分析方法的有效性。如表所示2中，所有校正曲线显示出良好的线性度测试的范围内，整体的LOD和LOQ均在0.66-2.52范围 μ克/毫升-8.40和2.21μ克/毫升，分别。盘中的变化，可重复性和六个分析物的稳定性的RSD值均小于2.63％，总回收率98.76％和105.10％之间铺设用RSD小于1.83％（表3）。另外，峰纯度通过分析所述DAD调查;无杂质的迹象可寻。两者合计，结果表明，所建立的方法准确的在汤剂六个国化工标记的决心。


不。	分析	校准曲线^一个	[R²	线性范围	LOD	定量限

1	5-Caffeoylquinic酸	ÿ= 0.1718X + 0.0524	1.0000	7.640~458.4	0.66	2.21
2	3-Caffeoylquinic酸	ÿ= 0.1749X+ 0.1528	0.9999	8.520∼681.2	0.88	2.95
3	4-Caffeoylquinic酸	ÿ= 0.1518X+ 0.0197	0.9999	8.800~528.0	0.98	3.27
4	1,3-Dicaffeoylquinic酸	ÿ= 0.1903X+ 0.0243	1.0000	4.400~264.0	0.73	2.42
五	3,4-Dicaffeoylquinic酸	ÿ = 0.1282X+ 0.0132	0.9999	5.640∼338.4	1.38	4.59
6	4,5-Dicaffeoylquinic酸	ÿ= 0.1197X−0.0317	0.9999	6.480~388.8	2.52	8.40

^一个 ÿ=一个X+ B,ÿ为峰面积，X为各成分的浓度(μ克/毫升）。


不。	分析	精密（RSD％）^一)	重复性(RSD %,ñ= 6)	稳定^一个（RSD％，ñ= 6)	复苏^b(%,ñ= 6)
不。	分析	盘中(ñ= 6)	重复性(RSD %,ñ= 6)	稳定^一个（RSD％，ñ= 6)	的意思是	RSD％

1	5-Caffeoylquinic酸	0.06	0.10	0.57	104.64	0.22
2	3-Caffeoylquinic酸	0.27	0.10	1.31	105.10	0.34
3	4-Caffeoylquinic酸	0.25	0.04	1.14	102.82	1.82
4	1,3-Dicaffeoylquinic酸	0.21	0.09	0.45	98.76	1.39
五	3,4-Dicaffeoylquinic酸	0.46	0.84	1.34	103.45	1.79
6	4,5-Dicaffeoylquinic酸	0.29	0.99	2.62	99.68	1.27

^一个[R小号D (%) = (SD/mean) × 100.^b复苏(%) = 100 × (amount found – original amount)/amount spiked.

3.4。银辰药材及复方汤剂的定量分析

发达应用于高效液相色谱法(HPLC)同时测定的化学标记包括5-caffeoylquinic酸(1)3-caffeoylquinic酸(2)、4-caffeoylquinic酸(3),1,3-dicaffeoylquinic酸(4),3,4-dicaffeoylquinic酸(5)和4,5-dicaffeoylquinic酸(6)在YC药草和煎煮的样本。结果如表所示4因为这两个重复进样的平均值。


样品没有。	1^C			2			3			4			五			6
样品没有。	YC^一个(%)	YCD^b(%)	传输速率^d(%)	YC (%)	YCD（％）	传输率（％）	YC (%)	YCD（％）	传输率（％）	YC (%)	YCD（％）	传输率（％）	YC (%)	YCD（％）	传输率（％）	YC (%)	YCD（％）	传输率（％）

1	0.039	0.069	175.4	1.024	0.261	25.4	0.064	0.089	138.2	0.045	0.029	63.0	0.088	0.046	52.7	0.310	0.048	15.4
2	0.025	0.034	140.0	0.651	0.185	28.5	0.040	0.049	121.9	0.036	0.028	78.7	0.076	0.040	52.7	0.188	0.052	27.8
3	0.036	0.102	283.7	1.450	0.242	16.7	0.067	0.112	166.0	0.026	0.021	82.8	0.092	0.047	51.3	0.254	0.042	16.5
4	0.033	0.060	184.2	1.237	0.169	13.7	0.052	0.072	136.9	0.018	0.013	72.9	0.077	0.045	58.0	0.198	0.049	25.0
五	0.060	0.055	92.9	1.413	0.174	12.3	0.104	0.068	65.6	0.017	0.018	109.7	0.108	0.049	45.1	0.494	0.062	12.5
6	0.046	0.031	66.9	1.408	0.155	11.0	0.070	0.043	62.1	0.041	0.012	29.4	0.116	0.030	26.2	0.338	0.038	11.3
7	0.040	0.035	88.7	1.075	0.115	10.7	0.067	0.044	65.4	0.027	0.012	44.6	0.097	0.040	41.5	0.442	0.050	11.3
8	0.40	0.049	124.9	1.135	0.183	16.1	0.059	0.064	109.1	0.019	0.015	77.2	0.081	0.044	54.3	0.299	0.051	17.2
9	0.18	0.019	102.6	0.908	0.085	9.4	0.038	0.026	66.5	0.049	0.016	32.3	0.075	0.021	28.4	0.180	0.029	16.3
10	0.046	0.048	104.7	1.023	0.160	15.7	0.057	0.058	103.0	0.045	0.020	44.1	0.067	0.050	74.2	0.271	0.062	22.9
11	0.027	0.043	161.4	0.786	0.080	10.2	0.045	0.045	98.1	0.017	0.013	75.4	0.073	0.035	47.6	0.315	0.033	10.4
12	0.029	0.025	84.3	0.565	0.090	15.9	0.024	0.105	430.6	0.038	0.018	46.6	0.053	0.016	29.5	0.162	0.018	11.2
平均值	0.036	0.048	134.1	1.056	0.158	15.5	0.057	0.064	130.3	0.032	0.018	63.1	0.084	0.039	46.8	0.288	0.045	16.5

^一个银辰药厂(茵陈研究)。^bYCD，茵陈汤加减。^C分析人员与图中相同2。^d转化率(%)= YC汤中指标成分质量/ YC药材中指标成分质量* 100。

如表所示4结果表明，不同样品中YC和YC煎剂的含量有显著差异。在12批YC药材中，4-咖啡因基奎酸的含量差异最大，为0.024% ~ 0.104%，而3,4-双酚基奎酸的含量差异最小，为0.053% ~ 0.116%。这些化学成分的差异可能是由多种因素造成的，如气候、生长区域和收获条件的差异。YC煎剂中5-咖啡基奎尼酸的含量变化最大，为0.019% ~ 0.102%。1,3-双酚基奎尼酸含量变化最小，为0.012% ~ 0.029%。造成差异的主要原因可能与制作YC汤剂所用的YC药材的含量差异及YC汤剂的制作工艺有关。此外，各组分在不同批次样品间的转移率也存在较大差异。5-咖啡基奎酸和4-咖啡基奎酸的平均转移率均超过100%，在130%左右，而3-咖啡基奎酸和4,5-双酚基奎酸的平均转移率仅为15%左右。YC药材与YC煎煮的差异如此之大，可能是由于水煎过程中成分的转化所致。

3.5。六化学成分的汤过程中的变化

为了验证是否有在YC汤的制备组分转化，将制备的YC汤提取物煮沸，并在不同的加热时间和加热温度下回流。然后，将样品注入到分析HPLC系统中。结果示于图3。随着水煎过程加热时间的延长，这六种成分的浓度在40℃和60℃时变化不大，在80℃时变化趋势较小。当温度为100℃时，六种成分均有显著变化，且随着加热时间的增加，六种成分的增加趋势变化较大。其中,3-caffeoylquinic酸的浓度和4,5-dicaffeoylquinic酸显著减少,而5-caffeoylquinic酸的浓度,4-caffeoylquinic酸,1,3-dicaffeoylquinic酸,和3,4-dicaffeoylquinic酸表现出上升趋势,5-caffeoylquinic酸和4-caffeoylquinic酸的浓度显著增加。另外，加热3h后，六种组分之间的差异最小，趋于稳定。根据咖啡基的结合位点和数量(图1），5-咖啡酰奎宁酸，3-咖啡酰奎宁酸，和4-咖啡酰奎宁酸是单咖啡酰奎尼酸，以及它们彼此的异构体。二咖啡酰奎宁酸主要包括1,3-二咖啡酰奎尼酸，3,4-二咖啡酰奎尼酸，4,5-二咖啡酰奎尼酸，其也异构体。在制备过程中YC煎剂，外部条件如加热温度和时间，咖啡酰会发生破裂，和其中在奎尼酸的取代位置的影响下会被重新排列，以产生相应的异构体。从上述结果，与六种酚酸化学成分的结构相结合（图1)，推测3-咖啡基奎酸异构化生成5-咖啡基奎酸和4-咖啡基奎酸，两者也异构化;同样，4,5-双affeylquinic酸也可以产生1,3-双affeylquinic酸，3,4-双affeylquinic酸也可以相互异构化。可能的转换路径如图所示4。

（一个）

（b）中

（C）

(d)

4.结论

在这项研究中,HPLC-DAD方法开发和验证的定性、定量分析六个酚酸在YC煎煮和YC草药,即5-caffeoylquinic酸,3-caffeoylquinic酸,4-caffeoylquinic酸,1,3-dicaffeoylquinic酸,3,4-dicaffeoylquinic酸,和4,5-dicaffeoylquinic酸。此外，本方法还研究了YC汤中6种酚酸成分在不同加热温度和加热时间下的变化。现有文献[23，25，26在煎煮过程]主要研究的酚酸的温度（100℃）的变化。为了进一步调查的酚酸对温度的敏感性，四个加热温度（40°C，60°C，80°C，100°C）在本研究中进行了比较。结果表明酚酸几乎当温度低于60°C C改变，当温度为80℃，但趋势并不明显改变，并且当温度为100显著改变°。它表明酚酸异构化现象变得越来越明显随加热温度的升高。研究结果可以为我们提供新的思路来研究物质和药物疗效之间的关系。此外，它提供了一种用于YC式颗粒和质量标准的未来研究固体实验基础。

缩略语

高效液相色谱法:	高效液相色谱法
爸爸:	二极管阵列检测器
定量限:	定量限
LOD：	检测限
RSD：	相对标准偏差
YC:	Yincen。

数据可用性

支持本研究的数据来自中国广州暨南大学，可以从通讯作者处获得。

的利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

致谢

这项工作是由中国的国家重点研究发展计划资助下，支持（无。2019YFC17115000）。

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化学分析方法杂志

在六酚酸的定量分析茵陈（茵陈）通过HPLC-DAD及其转化通路在汤制备方法

摘要