人类血清骨钙素的化学发光免疫分析和解决“鱼钩效应”

文摘

化学发光免疫测定人血清骨钙素,或骨质疏松蛋白质,使用double-antibody三明治模型成立。检查钩效应表明,显著降低,并没有观察到钩效应4000 ng / mL的骨钙素浓度。建立的方法显示良好的分析性能和热稳定性。检测极限是0.03 ng / mL。intra-assay变异系数(CV) 3.22% -5.64%, interassay CV 4.42% -7.25%,回收率在93.22% - -107.99%。大(CR)与牛没有观察到,老鼠,老鼠,兔子,猪样本。发达的方法表现出良好的相关性与N-MID从罗氏产品。总共1069份临床病人样本测量使用试剂盒开发的这项研究。

1。介绍

骨钙素是一种维生素K-dependent蛋白由成骨细胞在骨1,2]。这是骨基质的主要noncollagenous蛋白(3];一些骨钙素吸收骨基质后生产,而其余分泌进入血液(4]。在骨重建骨钙素起着重要的作用,特定的表达,调节成骨细胞(5,6]。也被称为骨标记是有用的在诊断骨疾病,检查骨头的历史,和监测干预的影响(7,8]。因此,发展一个在体外骨钙素诊断分析尤为重要。血清中骨钙素的主要形式包括整个分子(氨基酸1-49)和N-MID片段(氨基酸43-49),后者显示了外周血中更加稳定(9,10]。放射免疫测定是第一个骨钙素的分析,方法和酶联免疫吸附试验后来建立了;然而,这两种方法费时、劳动密集型或对环境和人体健康有害。在这项研究中,观察钩效应在研究过程中,所述的Lebeouf et al。11),和一些方法用来研究和解决这个问题。最后,double-antibody夹心免疫分析是检测血清骨钙素的化学发光免疫分析法(CLIA)系统。目前,CLIA市场上被广泛使用,因为它是一个简单的、敏感、高通量和廉价的方法量化分析物的样品(12,13]。

2。材料和方法

2.1。试剂和材料

Dynabeads MyOne streptavidin-precoated珠子,EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation装备,succinimidyl 4 - (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate和4′-hydroxyazobenzene-2-carboxylic酸(傻瓜)解决方案获得热费希尔(美国沃尔瑟姆,MA);perfluorohexanoate,甲醇,EDC, NHS,骨钙素买来σ(圣路易斯,密苏里州,美国);辣根过氧化物酶合从BBI购买解决方案(美国波特兰,我);链霉亲和素是从杭州购买神经肽生物科技公司、有限公司(中国);AKTA净化器系统购买通用电气医疗集团(美国芝加哥,IL);显微镜是购买奥林巴斯(日本东京);auto-microplate化学发光分析仪是由baime生物技术(盐城,中国);和一个auto-magnetic珠化学发光分析仪是由Zecheng生物技术(中国,北京)。从疯狂的抗体得到(上海,中国)。抗原是购自σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。

2.2。试剂成分制备

2.2.1。抗体轭合物与合

不同重量的anti-VD抗体和EDC完全溶解在分离0.05碳酸氢钠的解决方案;然后,涨跌互现的解决方案。合是溶解在0.1磷酸盐缓冲剂(pH值7.2),混合解决方案添加和pH值与稀释盐酸降至5.8。然后,解决方案是孵化5 h 26°C。最后,杂质被海水淡化列。

2.2.2。描述的Antibody-HRP轭合物

骨钙素涂于微型板块来验证适当的抗体结合,合。antibody-HRP共轭准备在不同的抗体/合比例。然后,50μL antibody-HRP或合单独控制添加到预镀微型板块,孵化为30分钟37°C,和洗了5次洗涤缓冲。接下来,100年μL衬底的试剂是补充道。结果表明,antibody-HRP配合准备使用(图1)。如柱状图所示,相对光单位(rlu)合以及超额摩尔增加增加;当合浓度超过两个抗体,信号显示增加。因此,抗体/合比是1:2。

2.2.3。与生物素抗体轭合物

抗体分离成PBS缓冲,pH值7.4。后添加EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin和抗体,在室温下孕育了PBS缓冲60分钟。混合物是然后用PBS缓冲两次透析。

2.2.4。描述的Biotin-Antibody轭合物

估计生物素结合,biotin-antibody的解决方案是添加到一个傻瓜和抗生物素蛋白溶液的混合物(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。生物素/抗体摩尔比约为6.2,计算为工具规范描述的方法。

2.2.5。优化的反应条件

骨钙素在血液中是不稳定的。分泌进入血液后,完整的骨钙蛋白被蛋白酶消化;因此,有两种主要形式的血清中骨钙素:完整的骨钙素(氨基酸1-49)和N终端片段(氨基酸1)。在这项研究中,两个特殊的抗体被用来检测两种形式。这试验包括biotin-antibody所需必要的试剂,antibody-HRP轭合物,和streptavidin-coated磁性粒子。biotin-antibody在混合antibody-HRP轭合物,和血清骨钙素三明治复杂的形成。然后,streptavidin-coated磁性粒子被添加到隔离三明治复杂。生成的rlu骨钙素的浓度成正比。利用几种不同的血清参考已知的骨钙素的浓度,可以生成一个量效曲线,可以确定一个未知的骨钙素浓度。在这项研究中,样本大小等因素,biotin-antibody antibody-HRP浓度和培养时间优化。

3所示。性能测试方法

3.1。检测极限(LoD)

校准器是测试20次0 ng / mL分析物,意思是+ 3的sd后计算。相应的浓度被认为是LoD。

3.2。精度和恢复

三个血清样本不同的骨钙素浓度分别进行了测试和重复在一个实验中,重复20天后,和intra-assay interassay变异系数(CV)计算。集中骨钙素的解决方案添加了三个不同分析物的水平,血清样本,计算回收率。

3.3。大(CR)

骨钙素的特异性抗体用于选择物质是评估通过添加不同浓度血清基质干扰物质。CR被定义为的减少信号对应于50%的信号实现在缺乏分析物(B / B0的50%),提出了分析物浓度的比例给予相同的下降信号。CR值计算如下:

3.4。加速稳定性

整个套件,包括生物素化的抗体,SA-coated磁性粒子,antibody-HRP共轭,和骨钙素标准,是在37°C孵化7天比较标准和样本信号在不同的日子。

3.5。方法比较

方法建立与市场从罗氏CLIA法。总的来说,使用171个样本,从0.6到283.3 ng / mL。

3.6。钩的效果

集中骨钙素测试解决方案和校准器最高水平,然后平均−3 sd值集中的骨钙素和平均+ 3 sd校准器水平最高的计算和比较。

4所示。结果与讨论

4.1。CLIA法的发展的建议

以下4.4.1。方法过程

首先,10μ血清L, 120μL生物素化的抗体,和120年μL antibody-HRP共轭被添加到反应管,混合,孵化了16分钟37°C。接下来,30μL streptavidin-coated磁的解决方案是添加和孵化6分钟37°C。孵化后,磁性粒子与洗涤缓冲洗了三次,然后200年μL衬底试剂添加到生成的信号。读者应该用于信号收集rlu和浓度计算值如果校准器曲线可用。

(1)优化的样本大小,Biotin-Antibody, Antibody-HRP浓度。钩的效果观察。在本研究的初始阶段,骨钙素浓度高的血清样本通常显示可怜的线性。这些样本梯度稀释后,成为明显的非线性关系,表明钩的存在影响,列于表1。

(2)优化的样本体积和抗体浓度的试剂。解决之前观察钩效果,几个策略被用来优化条件。抗体浓度增加反应体系相匹配的分析物。如表所示2,一系列的生物素化的抗体浓度和antibody-HRP测试,信号(250 ng / mL) /信号(0 ng / mL)值是最大的,当生物素化的抗体和antibody-HRP浓度分别为0.5和2μ分别g / mL。额外免费的抗体被添加到反应系统抗原过剩消费样本。样品体积和反应体积也被优化。如图2,最好的预期的观察和测试浓度之间的相关性与第三个条件,同时也减少了样本容量和体积增加了反应。最后,10μ血清L, 120μL生物素化的抗体(0.5μg / mL), 120年μL antibody-HRP共轭(2μg / mL)被选为最优的形成。

(3)优化的孵化时间。生物素化的抗体和antibody-HRP孵化时间评估。除了培养时间,过程仍然作为描述的方法。rlu延长培养时间和增加16分钟后保持不变,当反应达到动态平衡。由于省时的临床需求,我们选择了一个16分钟培养时间。信号结果如图3。

4.1.2。方法的性能

骨质疏松的蛋白质(东方)标准曲线符合4-parameter逻辑函数法。LoD 0.029 ng / ml。精度测试结果显示内部和interassay CVs的3.22% -7.25%,-5.64%和4.42%分别(表3)。回收率是96.53% - -107.15%(表4)。发达的方法表现出高选择性边界网关协议。与牛大不到0.1%,老鼠,老鼠,兔子,或者猪样本。加速稳定性研究表明,发达试剂温度应力下表现出极大的稳定性。rlu改变不到10%在7天期间少于37°C(图4)。

4.1.3。比较的方法

在这项研究中,171份血清样本测量使用的开发方法和罗氏的方法。测试结果退化使用最小二乘回归方程,相关系数是计算。数据如图5。试验结果表明良好之间的协议开发和方法相比,测试值和均值的差异表示这些方法之间的轻微的偏见。

4.1.4。钩的效果

病人血清与集中飙升骨钙素准备一系列的钩样本。钩样品和最高的校准器水平测试(表5)。集中的骨钙素的rlu超出最高的校准器,表明没有钩效应甚至在边界网关协议浓度高达4000 ng / mL。

4.1.5。临床研究

总共1069份临床病人样本测量使用试剂盒开发的这项研究。六个条件(表6)。边界网关协议不同的分布之间的男性和绝经后女性(数字6和7)。边界网关协议在不同浓度的范围如图的病人8。

5。结论

钩的效果通常被观察到在实验中由于过高的分析物浓度与捕获和检测抗体。钩效应主要发生(但不仅限于)一步immunometric化验(三明治),导致降低信号在非常高的分析物的浓度(14]。对于一些分析,如果有大的分析物浓度范围(如铁蛋白、生长激素、促,PRL, Tg,肿瘤标志物PSA, CA199,和CA125),抗原抗体反应会导致抗原过剩,导致错误减少的结果和潜在的误诊(14]。但在直接竞争免疫分析,钩效果不退出15]。根据以前的文献,有许多边界网关协议量化方法,如竞争和two-site放射免疫检定法(11),与单克隆抗体酶联免疫吸附试验(16)或多克隆抗体(17],dual-label immunofluorometric试验(18]。然而,这些方法是费时和吞吐量较低,从而限制广泛应用,特别是在机构与大样本大小。本研究建立了一个量化的CLIA边界网关协议在人类血清具有良好的性能和整体稳定性。比较的方法证明了该方法具有良好的相关性与罗氏公司的试剂盒,也就是市场上广泛使用。在这种方法的发展,这种现象是注意到:有些病人的血清显示边界网关协议浓度非常高,但较低的结果。这个钩子效应为医生提供虚假信息。我们减少了样本容量和调整抗体的浓度,以防止这种情况。因此,没有进一步的错误的结果被发现。这里,生物材料内部产生,如生物素化的抗体和antibody-HRP共轭,试剂的性能是至关重要的。因此,进一步的研究应进行生产抗体和结合的过程。 Minimising the differences in raw materials between batches should help to sustain the performance of the reagent kit. The clinical study using the developed kits showed good agreement between test results and disease, and the reagent kit fulfilled the clinical requirements.

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

信息披露

韩霜和薛翳风co-first作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作得到了江苏关键研发项目(BE2018621),研究生科研创新项目江苏普罗旺斯(KYCX18_1793)、轻工技术与工程国家一级学科计划(LITE2018-24)和15批江苏省“六大人才高峰计划”(swyy - 180)。

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