柚皮素，柚皮素，烟酰胺共晶体的药物动力学的比较大鼠通过LC-MS / MS

摘要

Naringenin (NAR)， 4 '，5,7-三羟基二氢黄酮，具有广泛的药理活性，但水溶性差，生物利用度低。本研究评估了具有更好溶解度的柚皮素-烟酰胺共晶(NAR-NCT)的药动学和生物利用度。大鼠口服NAR，即naringenin和烟酰胺(NAR + NCT)和NAR-NCT的混合物。NAR- nct的相对生物利用度为NAR、C的175.09%_最大NAR和NAR + NCT分别为8.43倍和2.06倍，Tmax由0.49 h提高至0.09 h, CL由91.1 L/h/kg降低至49.1 L/h/kg，且t_1/2was increased from 5.37 h to 8.24 h, highlighting its rapid absorption and slow elimination. This study showed that NAR-NCT could improve the bioavailability of NAR.

1.介绍

柚皮素（NAR），4'，5,7- trihydroxydihydroflavone（图1），是柚子，葡萄和柑橘的芸香科的水果广泛存在一个dihydroflavonoid。这是极大的兴趣，因为其丰富的药理活性，包括抗氧化[1,2]，抗肿瘤[3.,4,抗炎5,6]，抗辐射[7,8，以及免疫调节效应[9]以及对咳嗽和痰有作用[10]，这导致在药物的广泛使用[11]，食品和化妆品等行业。虽然它具有多种药理活性，研究表明，NAR是难溶于水[12]和在体内具有低的生物利用率[13,14]。

共晶体被定义为活性药物成分和共晶前组合的晶体。它具有特定物理和化学性质可以形成通过弱非共价相互作用，例如，氢键[15]。与母体化合物相比，在共结晶形式的活性药物成分可以提高不同的性能[16]，如改变的稳定性[17,18]，溶解度19]，和生物利用度[20,21]。先前，我们制备柚皮素 - 烟酰胺共晶体（NAR-NCT），以提高NAR的在不同pH缓冲溶液中的溶解度[22]。口服后在大鼠NAR与NAR-NCT的药代动力学的比较在这项工作进行了调查。After oral administration of NAR, the physical mixture (NAR + NCT), and NAR-NCT, and the plasma concentrations of NAR were determined by LC-MS/MS. NAR-NCT can improve the bioavailability of NAR and result in faster absorption and slower elimination.

2.实验

2.1。物料

柚皮素（> 96％）和烟酰胺（> 98％，NCT）由Bailingwei科技（北京，中国）提供。内标（IS），橙皮素（> 98％，图1），从益肺（上海，中国）提供。乙酸从TEDIA（费尔菲尔德，OH，USA）提供。甲醇（HPLC级），乙酸乙酯（GC等级），和其它化学品购自ANPEL（上海，中国）提供的。

2.2。制备与表征NAR-NCT的

共晶体是通过溶剂蒸发来制备。50 mg of NAR and 45 mg of NCT (at a molar ratio of NAR and NCT of 1 : 2) were mixed with ethyl acetate (10 mL). After ultrasonic dissolution, the mixtures were heated at 40°C for 4 hours [22]。物上的DSC-TGA凝视热分析仪（梅特勒，托莱多，瑞士）进行差示扫描量热法（DSC）。X-射线粉末衍射（XRPD）来分析NAR-NCT的变化。XRPD用D8 ADVANCE粉末衍射仪（Bruker，卡尔斯鲁厄，德国）进行。红外光谱（IR）中的溶液在400光谱仪傅立叶红外光谱仪（珀金埃尔默，沃尔瑟姆，美国）上进行。The NAR-NCT was kept at 60°C, at a relative humidity of 90 ± 5%, under light of 5000 Lx for 10 days and after 6 months at room temperature.

2.3。仪表

色谱分离用的Shimadzu UFLC-20AD系统XR（东京，日本）中进行。The column was Shim-Pack C18-ODS column (75 mm × 3 mm, 2.3 μ米)at 40°C and 0.3 mL/min. The mobile phase constituted 0.2% acetic acid-water (v/v, A) and methanol (B). The injection volume was 3 μL. The chromatographic program was as follows: gradient elution, 0–3 min, 60% B; 3–3.5 min, 60–90% B; 3.5–6.5 min, 90% B; 6.5–7 min, 90–60% B; and 7–10 min, 60% B.

AB SCIEX QTRAP 5500（MDS-Sciex的，一致，加拿大）以负模式电喷雾电离（ESI）界面配备有岛津UFLC-20AD XR。多反应监测用于分析的样品。质谱参数示于表1。

利用二次质谱增强产物离子(EPI)扫描获得特定离子的高质量质谱/质谱。这种扫描类型是在NAR和IS上执行的。图中记录了NAR和IS的产物离子质谱2。关于NAR到IS峰面积的比例来确定的NAR浓度。数据采集​​和分析，通过分析1.6软件计算。在此之后，以最小化在质谱仪样品的污染，NAR的峰值后和IS洗脱出来，剩余的组分从LC发送到废物阀，而不是通过MS系统程序。

2.4。标准工作溶液和内标溶液

NAR溶解于甲醇，得到102.6 μg / mL股票的解决方案。用甲醇稀释得到标准工作液10.3、30.8、102.6、513、1026、2052、4104、6156、8208ng /mL。橙皮苷溶于甲醇(300ng /mL)作为内标液。

2.5。校正标准及品质控制(QC)样本

The calibration standards of NAR at a range of 1.03 to 821 ng/mL, which were prepared from blank plasma and NAR standard working solutions.

QC样品分别以低、中、高浓度(LQC、MQC、HQC)对应的NAR为3.08、410、616 ng/mL，按上述程序制备。这些样品是防光的。

2.6。血浆样品预处理

等离子（100 μL）与10相结合 μL of 300 ng/mL internal standard solution in a centrifuge tube, and the mixture was vortexed for 5 min. Then, samples were mixed with ethyl acetate (300 μL), and mixtures were vortex-mixed for 5 min. After that, mixtures were centrifuged at 8000 r/min for 2 min. All supernatants were pipetted into a new tube and dried at 40°C under flowing nitrogen. And then, residues were reconstituted with methanol (100 μL) and vortex-mixed for 1 min.

2.7。方法验证

美国食品和药物管理局的指导方针[遵守所有的方法验证23]。

2.7.1。特异性

为了证明被测物质是预期的分析物，内源性物质和其他代谢物不干扰分析，首先建立了方法特异性。本分析包括空白血浆样本(不同来源)、NAR标准溶液和空白血浆的混合物以及口服给药后的血浆样本(n= 6)。

2.7.2。定量的标准曲线和下限（LLOQ）

将6个空白大鼠血浆样品与NAR标准工作液相结合，得到最终的NAR血浆浓度为1.03、10.3、51.3、103、205和821 ng/mL。如章节所述2.6中，NAR血浆浓度（ng / mL）中取为横坐标，而NAR到IS峰面积的比取作纵坐标，并通过加权的最小二乘线性回归（加权因子1 /X²)，以取得校正曲线。

在样品中可以可靠地定量的分析物的最低浓度是LLOQ。按本节所述对6个含NAR的标准血浆样本进行分析2.6。

在LLOQ，相对标准偏差（RSD，％）为≤20％时，相对误差（RE，％）被要求为±20％以内。

2.7.3。精密度和准确度

NARplasma standard samples were prepared at the LLOQ, LQC, MQC, and HQC concentrations (1.03, 3.08, 410, and 616 ng/mL), according to Section2.6。在每个浓度制备六个样品。测定在同一天和连续三天各样品的浓度，以评估细胞内和日间精密度和准确度。

验收标准为RSD（％）为≤15％，RE（％）被限制在±15％的区域内和日间，除了在LLOQ，其中RSD（％）应≤20％和RE（％）在±20％。

2.7.4。提取回收率（R)

NARplasma standard samples were prepared at the LLOQ, LQC, MQC, and HQC concentrations (1.03, 3.08, 410, and 616 ng/mL). Then, internal standard solution (10 μL) was added to the mixture, vortexed for 5 min, and added ethyl acetate (300 μL).此后，以8000 r/min离心2 min。所有上清液转移到新的试管中。均在流动氮的作用下浓缩至干燥，残渣在甲醇(200)中重新溶解μL）为分析做好准备。NAR的峰面积（AS）的记录。

空白血浆样品（100 μL）从不同的来源与乙酸乙酯混合（300 μL).将样品涡旋5 min, 8000 r/min离心2 min，取上清进行分析。能整除的10μL of the standard solutions (10.3, 30.8, 4104, and 6156 ng/mL) and 10 μL of 300 ng/mL internal standard solution were added. All of them were concentrated to dryness under flowing nitrogen, and the residues were redissolved in methanol (200 μL）进行分析。NAR的峰面积（作为'）被记录下来。

将As和As’代入下式，得到NAR的提取回收率(%):

本IS的恢复也同样调查。

2.7.5。基质效应（ME）

标准溶液(10μL, at concentrations of 10.3, 30.8, 4104, and 6156 ng/mL) were combined with the internal standard solution (10 μL, 300 ng/mL) in a centrifuge tube. The mixture was vortexed (5 min), dried at 40°C under flowing nitrogen, and redissolved in methanol (200 μL）。然后将上清液进行分析。NAR的峰面积（BS）的记录。

空白血浆样品（100 μL)，从不同来源，分别与乙酸乙酯(300μL), and the mixture was vortexed (5 min) and centrifuged (8000 r/min, 2 min). All supernatant of each sample was removed to a new tube, and standard solution (10 μ加入浓度为10.3、30.8、4104、6156 ng/mL的L作为内标液(10μL, 300 ng / mL)。样品在40°C流动氮下干燥。甲醇(200μL)用于在残渣中重组。记录NAR (Bs’)峰值面积。

上NAR基体效应（％）根据下式计算：

该是对ME进行了研究。

2.7.6。稳定性

分析物的在最低定量限，小叶女贞，MQC和HQC不同条件下的稳定性矩阵进行了调查。The evaluated conditions were 24 h short-term stability at room temperature (25 ± 3°C), freeze-thaw cycles three times, long-term stability under −80°C storage 21 days, and room temperature in an automatic sampler for 24 h.

为RSD（％）的验收标准为≤15％，RE（％）被限制在±15％，除了在LLOQ，其中RSD（％）为±20％以内≤20％和RE（％）。

2.7.7。稀释的可靠性

NAR在血浆中的稀释可靠性必须因为某些药物的血浆中的高浓度（超出校准曲线）的进行检查。The plasma sample (NAR, 6156 ng/mL) was diluted with blank plasma 10 times and analysed according to Section2.6。样品分析后，将NAR的峰值面积与IS的比值与校准曲线进行比较，并计算RE和RSD值(n= 6)。稀释后测定浓度的准确度要求在85% ~ 115%之间，精度要求在15%以内。

2.8。药代动力学研究

Eighteen SD rats (200 ± 20 g, 8 weeks, half male and half female) were obtained from National Institutes for Food and Drug Control (Beijing, China). The room environment was about 22 ± 2°C, the humidity of 50 ± 10%, light and dark recycle for 12 h. Before the experiment, the rats can be given water freely but were fasted for 12 h. All experiments were following the National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals [24]。

口服给药有三组。第一组给予NAR (30 mg/kg)。下一组给予NAR + NCT，其中NAR与NCT的摩尔比为1:2，以NAR 30mg /kg表示。最后一组给予NAR- nct (57 mg/kg)，相当于30 mg/kg的NAR剂量。这些是用0.5%的羧甲基纤维素钠研磨而成，剂量为1毫升/100克。在给药后0.05、0.083、0.167、0.333、0.5、1、2、4、8、10、12和24小时，从眼静脉取0.5 mL系列血样到离心管。样品以10000r/min (10min, 4℃)离心，离心后每个样品上清于- 80℃保存。

2.9。数据分析

通过DAS软件(国家药监局3.2.4版)对药动学参数进行非室间建模评估。

下面的等式来计算的相对口服生物利用度（FR，％）在大鼠中：

3。结果与讨论

3.1。NAR-NCT Cocrystal

的NAR-NCT共晶制备和表征，这可以提高在水中的溶解度。的NAR-NCT的DSC吸热峰为134.68℃。在DSC，XRPD和NAR-NCT的IR光谱的特征峰分别来自柚皮素 - 烟酰胺共晶体的不同文献报道[25]。结果表明，形成了新的NAR-NCT共晶。所述DSC，XRPD和IR光谱显示在图3.。

3.2。NAR-NCT的稳定性

The stability of NAR-NCT was investigated at 60°C, at a relative humidity of 90 ± 5%, under light of 5000 Lx for 10 days and after 6 months at room temperature. In terms of appearance, NAR-NCT showed no difference under the above conditions. A comparison of the XRPD spectra (Figure4)showed that the overall peak shape, position, and intensity are not a significant difference, indicating that the NAR-NCT was stable at 60°C, at a relative humidity of 90 ± 5%, under light of 5000 Lx for 10 days and after 6 months at room temperature.

3.3。等离子体样品制备的优化

蛋白质沉淀和液 - 液萃取的方法用于去除来自样品的干扰物种的进行了测试。有机溶剂，如甲醇，乙腈，乙醚，乙酸乙酯，和正己烷进行了调查，其结果示于图5。乙酸乙酯的提取效果最好，分别为100、200、300、400μ乙酸乙酯L的分析。结果表明，乙酸乙酯（300 μL）有最好的提取效果。因此，乙酸乙酯（300 μL）被用来进行预处理所提取的溶剂。

3.4。方法验证

的空白血浆样品显示没有信号与分析物的干扰测量。NAR和IS被井从内源性物质和代谢物分离，并且没有观察到干扰。色谱显示在图6。

The calibration curve showed good linearity, at the range of 1.03–821 ng/mL,Y= 0.11X + 0.0914, andr = 0.9995. The standard error of slope and intercept was 0.002 and 0.005, respectively. LLOQ was 1.03 ng/mL for the NAR plasma sample.

的精度和准确度日内和日间期间结果如下：两个RSD（％）值分别为≤8.5％，而两个RE（％）值在-6.2的％的范围内，以4.7％和-2.6％至2.8％（表2)。

回收率为69.0% ~ 76.5%，RSD(%)值≤10.2%。基质效应为107.7% ~ 131.2%，RSD(%)值≤7.7%(表2)2)。

血浆样品在室温(25±3℃)下稳定24 h, RE%值为0.9%至10.3%。经过三个冻融周期后，NAR也保持稳定(RE%: 1.6%至4.8%)。样品在−80°C下表现出21天的长期稳定性(RE%:−6.9%至0.2%)，在25°C的自动进样器中，准备注入的样品在24小时内保持稳定(RE%:−8.4%至4.4%)。这些结果记录在表中2。

等离子体QC样品用空白血浆稀释后，将RE介于-8.1 %%至1.9％，相对标准偏差为4.7％（表3.)。这些结果符合方法学验证的要求。

3.5。药代动力学和生物利用度

LC-MS/MS测定NAR的血浆浓度。用DAS软件进行浓度分析。主要药动学参数见表4和平均血浆浓度对NAR时间曲线示于图7。

与NAR时，C相比，_最大of NAR + NCT was greater by a factor of 2.06, and T_最大changed from 0.49 h to 0.11 h. Although NAR + NCT accelerated drug absorption, it did not improve drug metabolism. The values of CL andt_1/2结果表明，两组患者的排除率相似。因此，相对生物利用度为NAR的77.23%。

NAR- nct与NAR比较显示C_最大增加了8.43倍，而T_最大was advanced from 0.49 h to 0.09 h. In contrast to NAR + NCT, the CL of NAR-NCT decreased from 91.1 L/h/kg to 49.1 L/h/kg, andt_1/2increased from 5.37 h to 8.24 h, showing the rapid absorption and slow elimination of this formulation. The relative bioavailability of NAR-NCT was 175.09% of NAR, compared with 80.89% reported in the literature [25]。这一结果表明，NAR-NCT可提高生物利用度，并具有快速吸收和消除慢的优势。上述现象符合的假设[26]。NCT是易溶于水，并且在水溶液生物环境，NCT被更容易地从晶格分离并容易进入到溶液中。然后，NAR颗粒留在溶液介质。因为NAR-NCT溶解速度比NAR的超分子聚集体的形成速度更快分子本身，C_最大增加和T_最大降低。NCT，非晶NAR的溶解后，具有高自由能，慢慢转化成亚稳态，然后到最低能量NAR结构（通常是纯药）。这个过程所需的时间导致NAR消除较慢，在体内增加AUC。

NAR、NAR + NCT、na -NCT的峰值时间分别为0.49 h、0.11 h、0.09 h, NAR在0.5 h达到峰值。三组药动学研究的最后一个点均小于C的1/10_最大， 分别。After 0.5 h, a longer interval of blood collection was set. The rats could be allowed to drink water freely in longer blood sampling intervals. Therefore, the process of blood sampling did not have a serious impact on the pharmacokinetics of NAR.

NAR-NCT的用药时间曲线只有双峰，与肠肝循环一致[27]和在体内延长NAR动作时间。

4。结论

我们研究了口服NAR、NAR + NCT和NAR-NCT对大鼠的药动学特征和相对生物利用度的差异。这些结果表明，NAR- nct是提高NAR生物利用度的可行方法。这些结果为今后NAR的应用和研究提供了重要参考。

数据可用性

包括在此研究中的所有数据都可以在从相应的作者请求。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

该工作获得国家重大科技专项“重大新药开发”(2012ZX09301002-001-006)资助。

参考

1. A. H.赫格德，S. N.普拉香特，和J. Seetharamappa，“与小牛胸腺DNA的抗氧化剂类黄酮的相互作用分析通过光谱和电化学方法，”医药和生物医学分析杂志卷。63，第40-46，2012。查看在：出版商网站|谷歌学术
2. W. Wojnar，M.齐赫和I. Kaczmarczyk-塞德拉克“在1型糖尿病大鼠的透镜类黄酮柚苷配基的抗氧化作用，”生物医学和药物治疗， 108卷，第974-984页，2018年。查看在：出版商网站|谷歌学术
3. Y. Bak, H. Kim, j.w。一种合成的柚皮苷衍生物，5-羟基7,4′-diacetyloxyflavanone -N-苯基腙（N101-43），诱导细胞凋亡通过Fas / FasL表达和PI3K的抑制的上调/ Akt信号在非小细胞肺癌细胞的途径，”农业和食品化学杂志卷。59，没有。18，第10286-10297，2011。查看在：出版商网站|谷歌学术
4. H. Gumushan和T.的Akgun，“柚皮素通过阻断电压门控钠通道抑制前列腺癌转移，”Biopha卷。106，第770-775，2018。查看在：出版商网站|谷歌学术
5. S.-J.蔡C.-S.黄，M.-C.旺，W.-Y.锦，H.-Y.黄和M.-C.贤“糖尿病小鼠的柚皮素的抗炎和抗纤维化作用，”农业和食品化学杂志卷。60，没有。1，第514-521，2012。查看在：出版商网站|谷歌学术
6. M. A. Alam, N. Subhan, M. M. Rahman, S. J. Uddin, H. M. Reza和S. D. Sarker，“柑橘类黄酮、柚皮苷和柚皮苷对代谢综合征的影响及其作用机制，”在营养学研究进展卷。5，没有。4，第404-417，2014。查看在：出版商网站|谷歌学术
7. S. Kumar和A. B.梯酷“生化和柚皮素，从柑橘类水果的植物化学的辐射防护作用的分子机制，”农业和食品化学杂志卷。64，没有。8，第1676-1685，2016。查看在：出版商网站|谷歌学术
8. 张春，曾，姚，等，“柚皮素通过降低白介素-1改善辐射诱导的肺损伤。β水平,”药理学与实验治疗的卷。366，没有。2，第341-348，2018。查看在：出版商网站|谷歌学术
9. W. F.曾，F. Y.张，G. J.杜等人，“在新的免疫调节研究更新，柚皮素，”生物化学与生物物理进展卷。45，第915-925，2018。查看在：谷歌学术
10. B.-q.林，P.-b.李，Y.-g.王等人，“柚皮素的祛痰活性，”肺药理学与治疗学卷。21，没有。2，第259-263，2008。查看在：出版商网站|谷歌学术
11. J.闻，Y.巧，J. Yang等人，“UPLC-MS / MS法测定芍药苷，柚皮苷，柚皮素和在大鼠血浆和四逆散汤的口服给药后其应用到一个药代动力学研究甘草次酸，”医药和生物医学分析杂志卷。66，第271-277，2012。查看在：出版商网站|谷歌学术
12. T. T.张和C.麻，“柚皮素和大鼠血浆中，通过LC-MS / MS的葡糖醛酸结合物的测定方法”中国药学杂志卷。49，没有。10，第864-868，2014。查看在：谷歌学术
13. S. Chaurasia，R.R。帕特尔，P. Vure，和B.米什拉，“口服柚皮素纳米载体：制造，优化，药物代谢动力学和功效的化疗评估，”纳米，第12卷，no。11、第1243-1260页，2017。查看在：出版商网站|谷歌学术
14. S. L.修，T. Y.黄，Y. C.侯，D.H。下巴和P. D.李超，“在兔柚皮苷和柚皮素的药代动力学代谢的比较，”生命科学，第70卷，no。13页，1481-1489,2002。查看在：出版商网站|谷歌学术
15. 杨，郭，林等，“新型非洛地平共晶的实验与DFT模拟研究:表征、溶解特性与热分解动力学”医药和生物医学分析杂志，第154卷，第198-206页，2018年。查看在：出版商网站|谷歌学术
16. N.王，谢C.，H鲁等人，“共晶及其活性药物成分和食品配料领域的应用，”目前医药设计卷。24，没有。21，第2339至2348年，2018。查看在：出版商网站|谷歌学术
17. A.科扎克，P. H.马立克和E. Pindelska，“结构表征和与脂肪族二羧酸乙柳酰胺的三种新的共晶体的药物性质，”药学杂志卷。108，没有。4，第1476至1485年，2019。查看在：出版商网站|谷歌学术
18. B.公园，W.尹，J.韵，E.班，H.韵和A.金，“大黄素 - 烟酰胺（1:2）共晶体鉴定通过热筛选改善大黄素的溶解度，”国际药物杂志的，第557卷，第26-35页，2019年。查看在：出版商网站|谷歌学术
19. 李，皮，张等，“提高黄芩素口服有效性的策略:黄芩素-茶碱共晶”，Fitoterapia卷。129，第85-93，2018。查看在：出版商网站|谷歌学术
20. 刘，洪，姚颖等，“利用溶液结晶技术制备药物共晶:杨梅素-脯氨酸共晶的制备、表征及评价”欧洲药剂学和生物药剂学杂志卷。107，第151-159，2016。查看在：出版商网站|谷歌学术
21. D. P. McNamara, S. L. Childs, J. Giordano等人，“使用戊二酸共晶改善低溶解度原料药的口服生物利用度，”药物研究，第23卷，no。第1888-1897页，2006。查看在：出版商网站|谷歌学术
22. D.徐，李T.，T. T. Zhang等人，“准备和柚皮烟酰胺共晶体的表征，”中国医药杂志，第54卷，第291-296页，2019年。查看在：谷歌学术
23. 药品审评中心和研究（CDER），兽医中心（CVM）工业指南：生物分析方法验证，F.D.A.卫生和人类服务，银泉，MD，USA，2013年美国能源部。
24. 实验动物资源研究所，实验室动物的护理和使用指南，国家研究理事会，华盛顿特区，美国，​​2011。
25. W. X.崔，Z. H.他，Y. T. Zhang等人，“通过溶液结晶方法提高生物利用度和抗高血脂作用柚皮素制备共结晶”aap PharmSciTech卷。20页。115，2019。查看在：出版商网站|谷歌学术
26. G. Bolla和G. Bolla， "医药共晶:言行一致，"化学通讯卷。52，没有。54，第8342-8360，2016。查看在：出版商网站|谷歌学术
27. 马玉英，李鹏，陈丹东，方，李辉，苏，“大鼠血浆中柚皮苷及双峰现象药动学的LC/MS/MS定量分析”国际药物杂志的卷。307，没有。2，第292-299，2006年。查看在：出版商网站|谷歌学术

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