单标记多组分定量分析法同时测定防风中六种色酮

摘要

建立了单标记多组分定量分析方法，并在高效液相色谱法(HPLC)的基础上进行了充分验证。在本研究中，cimifugin (C)、5- o -甲基visamminol (V)、hamaudol (H)及其相应的糖苷，prim-O-glucosylcimifugin (GC)、4 ' - o -β选择-D-glucosyl-5-O-methylvisamminol (GV)和sec-O-glucosylhamaudol (GH)作为SR.的生物活性成分和质量评价指标，以GV作为唯一的参考标准，计算GV与其他5种颜色的相对校正因子(RCF)。通过与传统外标法(ESM)的比较，探讨了QAMS方法分析色元的可行性。方法准确度为96.98% ~ 102.50%，重复性(RSD <3%)，稳定性(RSD <3%)，精密度(RSD <3%)，线性度(R^2.≧0.9999）。随后，采用QAMS测定了55批不同地区的市售SR，并采用主成分分析（PCA）、相关分析和层次聚类分析（HCA）对其含量进行了分析在此基础上，提出了较为完善的市售锶质量标准：当六个色酮的总含量大于3时，锶合格 mg·g^−1.此外，当同时满足这两个条件时，SR最初可被视为一种上等药物：GC、C、GV、V、GH和H的总含量大于8 mg·g^−1.，且C、V、H含量占总含量的比例均大于10%。研究表明，所开发的QAMS方法可以成功地对SR进行质量评价;同时，为提高锶的质量标准提供了有价值的信息。

1.导言

防风草(sapaposhnikoviae, SR)，在中国被称为“防风”，是由植物的干燥根衍生而来分叉防风属于伞形科。这种草药味道辛辣、甘甜、温热，进入膀胱、肝脏和脾脏经络。根据中医理论在祛风解外感、祛湿止痛、止痉等方面有显著疗效[1.]．作为许多传统中药处方的重要成分，如玉平风散、防风通生丸、通泻尧方[2.,3.]此外，许多药理学研究表明，SR具有解热、镇痛、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗过敏和抗氧化等多种疗效[4.–8.]．

SR有几种成分：色酮、多糖、香豆素、挥发油和其他成分[9–12]值得一提的是，色酮是锶中最具代表性的成分。一方面，它的含量极其丰富[13]另一方面，它与SR的药理作用密切相关，例如抗炎、镇痛和抗氧化作用[14–16]根据《中国药典》（2015年版）、prim-O-葡糖基西米呋金（GC）和4′-O记录，随着SR市场的发展，SR的质量控制越来越受到重视-β-选择D-葡糖基-5-O-甲基visamminol（GV）作为质量控制指标。然而，每种中草药都是一个具有多种活性成分的综合复合体，根据中医理论，通过协同作用和相互作用发挥特定功效[17]因此，对于复杂的植物产品和中药而言，使用少数成分来控制质量是不够的。根据上述色酮的重要地位，根据植物化学研究，可以选择多种有代表性的色酮成分作为评价SR质量的指标s、 GV、GC、sec-O-葡糖基哈马多（GH）、西米呋金（C）、5-O-甲基维氨醇（V）和哈马多（H）广泛存在于SR中[18,19]，其药理作用显著，且与SR疗效最相关[20,21]．因此，当选择G、GC、V、GV、H、GH作为新的质量控制指标时，可以综合表征SR的化学表征、药用功能和内在质量。有研究表明，提取铬素常用的方法有回流法和超声波法[22,23]．本工作在优化制样工艺的基础上，考虑了六种色酮指示剂的极性和溶解度，可采用加热回流法制备样品，并可采用甲醇作为萃取溶剂。

在许多研究中，多组分含量的测定通常采用外标法（ESM）进行，在该方法中，参考标准是必要的，需要花费越来越多的时间和经济成本进行分离纯化[24]．作为一种替代方法，单标记法(QAMS)多组分定量分析只需要一种参比标准品同时测定多组分含量，更有效，更适合于质量控制(QC) [25]当某些参考标准品不稳定、含量低或难以从植物中提取时，QAMS不仅可以降低成本，而且可以降低制备难度[26,27]．此外，该方法还能有效提高质量控制的实用性，扩大中草药产品的应用范围。在QAMS中，采用高效液相色谱法直接测定内标物的含量，采用多转换因子法计算其他组分的含量。因此，相对校正因子(RCF)是分析物含量计算公式中的一个关键参数。由于不同分析物的摩尔吸收率往往是不同的，RFC在使用单一参比测定多组分时起着校准作用[28,29].在ESM中，分析物的浓度(C_K)可通过样品溶液中分析物的峰面积比计算(A._K)，以其相应的单位浓度标准溶液的峰面积(A._s/C_s)，如下式所示：

在QAMS,C_K应通过每个分析物的RCF进行校准(F_K)，基于ESM的计算。公式如下:

重要的是，价值F_K是由单位标准物质浓度(A._s/C_s)来分析(A._K/C_K)如下:

值得一提的是，RCF的最终值通常是多个RCF在不同浓度内参考物质下经过一系列测定的平均值[30]由于使用了C、GC、V、GV、H和GH六种对照组分，ESM成本高，操作复杂。因此，采用QAMS方法计算六种色酮的含量，GV因其代表性强、稳定性高、含量高、药理活性显著而被用作内标葡萄[31,32]．

本研究采用一种新的替代方法QAMS同时测定锶中的六个色酮。作为对照品，用HPLC测定GV的含量，并根据GV与这些fiv之间的内在函数和比例关系，用RCF计算C、GC、V、H和GH的含量通过将结果与ESM进行比较，验证了该方法的可行性，并参考了一些可靠的参考文献，从线性、准确度、精密度（指令精密度和中间精密度）和稳定性等方面验证了该方法的有效性[33]．通过主成分分析(PCA)、相关分析(correlation analysis)和层次聚类分析(hierarchical cluster analysis)，初步确定了55批商用化猪油的质量评价标准。

2.材料和方法

2．1．仪器和色谱分析

主要使用Waters HPLC系统（Waters Crop，Milford，MA，USA）进行分析，该系统配有1525二元泵溶剂管理系统、2998 PDA检测器、2707自动取样装置和Breeze 2工作站。另外使用了两种不同的HPLC仪器：一种是高效液相色谱（美国马萨诸塞州米尔福德Waters Crop）配备1525双泵溶剂管理系统、2489紫外检测器和Breeze 2工作站。另一个是Waters Alliance e2695-2998 HPLC系统（美国马萨诸塞州米尔福德Waters Crop Empower工作站）。HPLC分离在CAPCELL PAK C上进行₁₈柱(4.6 mm × 150 mm, 5μm）柱温设置为25℃，进样量为10 μL.流动相为甲醇(A)和0.3%甲酸水溶液(B)。程序梯度洗脱，流速为1.0 mL·min^−1.如下:0-12分钟，32% A;12-40分钟，32%-50% A;40-50分钟，50%-70% A;50-52 min, 70% a。检测波长254 nm。

2．2.化学品和材料

从中国不同地区采集了55批黄芪，经北京中医药大学张源教授鉴定为黄芪干根分叉防风（Turcz.）Schishk遵循中国药典（2015年版）中描述的方法[1.]．GC、C、GH、GV分别来自成都曼斯特生物科技有限公司(中国成都)。这些参考标准品的纯度(≧98%)均假定为供应商提供。另外两种化合物V、H在本实验室进行分离纯化，纯度不低于98% (HPLC测定)。根据紫外光谱、质谱和核磁共振数据确定了结构，并与文献数据进行了比较。所有标准品的化学结构如图所示1.．

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

HPLC级的甲醇、乙腈、甲酸购自赛默飞世尔科技有限公司(美国威瑟姆，MA, USA)，其他试剂(北京化工厂)均为分析级。采用Pall Cascada IX系统(美国Pall)制备高效液相色谱级水。其他试剂均为分析级。

２．３．混合标准溶液的制备

将C、GC、H、GH、V、GV精确称量，溶解于甲醇中，制备浓度为0.1220 mg·ml的参比标准品混合原液^−1.0.2096 mg·毫升^−1., 0.0369 mg·ml^−1.0.1636 mg·毫升^−1.0.0808 mg·毫升^−1.，及0.3340 mg·ml^−1.然后，通过稀释混合储备溶液（稀释因子）产生一系列浓度的校准标准溶液 = 1、2、5、10、20、50和100）使用相同的甲醇。将溶液储存在4°C的冰箱中，并通过0.45%的过滤器过滤 μm膜过滤器。所有注入HPLC系统的样品在分析前制备。

2.4.样品溶液的制备

将适量待测样品粉碎并通过80目筛。接下来，精确称取0.25 g样品粉末，放入一个填充瓶中，准确加入10 ml甲醇，加热回流120分钟。值得注意的是，填料瓶在回流前后都要称重，然后如果需要的话，加入溶剂以保持在室温下的重量相等。通过过滤0.45μM过滤器，丢弃前2ml，剩余的滤液作为样品的检测液。

2．5．方法验证

2.5.1. 特异性

在优化的色谱条件下，将混合参考标准溶液和试验溶液分别注入HPLC（第节）2.1).

2.5.2。线性

上述制备的储备标准溶液（第2．3)根据色谱条件，使用一系列合适的浓度水平进行HPLC（第2.1),分别。基于信噪比(S/N)分别在3和10左右测量检测限(LOD)和定量限(LOQ)。

2.5.3.精度

为确保新方法的有效性，进行了仪器精密度和中间精密度试验。对于仪器精度，准备测试溶液（第节2．4)在一天内用高效液相色谱法检查六个重复，为了检测中间精密度，由不同的操作员在不同的日期用不同的仪器将制备的供试品溶液注入高效液相色谱法。

2.5.4。稳定

准备了相同的测试解决方案(章节2．4)，置于室温下，于不同时间点(0、2、4、8、12、24 h)注射HPLC。

2.5.5。可重复性

按照方法制备同一批次的六种平行样品溶液（第2．4)，并根据色谱条件用高效液相色谱法测定2.1).

2.5.6. 精确

对6份含量已知的同批次SR粉(0.125 g)分别称重。然后，按照样品含量与对照品的比例，在样品中加入一定量的控制标准溶液，比例约为1:1。6种样品溶液的制备和测定参照本节所述方法并行进行2.1和2．4．复苏是计算。

2.6。QAMS方法

2.6.1。计算相对离心力

配制7个浓度级的混合标准溶液2．3)并在色谱条件下注入HPLC（第2.1)此外，还记录了各组分的色谱峰面积。

2.6.2。RCF耐久性试验

三种不同的文书(列于本节)2.1)、三种色谱柱(Capcell Pak C .₁₈答案:C₁₈，和水对称性C₁₈) (4.6 mm × 150, 5μm），不同流速（0.9、1.0和1.1 毫升·分钟^−1.)，以及不同的色谱柱温度（25、30和35℃）来研究不同条件对RCF的影响。

2.6.3.被测组分色谱峰的位置

为了更好地验证以及方便商业SR的质量控制，使用不同的仪器和不同的柱对GC、C、GV、V、GH和H的色谱峰位置进行了研究。

2.6.4.QAM和ESM结果的比较

为了评估和验证SR中多元化合物的QAMS可行性，采用ESM和QAMS分别测定了15批样品中C、GC、V、GV、H和GV的含量。对于ESM，采用六种参考标准（GC、C、GV、V、GH和H）测定六种色酮，而对于QAMS，结果基于F_x，本征函数，以及所选参考分析物与其他分析物之间的比例关系。所选内部物质（GV）的含量与ESM一样确定，然后根据分析物与内部物质之间的相对转换因子计算其他五个色酮的含量[34]．

2.7。应用及数据分析

应用所建立的QAMS方法对来自不同地区的55批市售SR进行了定量评估，测定了GC、C、GV、V、GH和H的含量，然后分别通过PCA、相关分析和HCA进行分析，同时进一步分析了三种色酮苷（C、H和V）通过使用SPSS 22.0软件包探索分析功能，得出了这些数据。

3.结果和讨论

３．１．方法验证

3.1.1。特异性

如图所示2.，分析物分离良好，因为其在六种组分的相应位置没有干扰，根据色谱图中的保留时间，试验溶液的目标峰与参考标准溶液的峰相对应。说明该方法具有特异性。

(一)

(b)

3.1.2。线性

用色谱峰面积(Y)作为参考溶液的垂直轴和浓度(x)为横坐标。所有相关系数都具有良好的线性(R)在浓度范围内不小于0.999。此外，还计算了六种物质的LOD和LOQ，如表所示1.．


指示信号	回归方程^1.	R	线性范围(μg·毫升^−1.)	LOD(μg·毫升^−1.)	(定量限μg·毫升^−1.)

整洁的,O-葡糖基西米呋金	Y= 1815300x+ 8028	0.9999	2.10–209.60	0.29	0.96
西米夫金	Y= 2928940x+ 7329	0.9999	1.22–122.00	0.28	0.92
4 ' -O-β-D-glucosyl-5 -O-methylvisammino	Y = 1894482x + 14466	0.9999	3.34 - -334.00	0.28	0.94
5－O-甲基维氨醇	Y = 3222987x+ 4879	0.9999	0.81 - -80.80	0.18	0.61
秒- - - - - -O-glucosylhamaudol	Y= 2660022x+ 6702	0.9999	1.64–163.60	0.22	0.73
哈马多	Y = 4418335x+ 1757	0.9999	0.37 - -36.90	0.09	0.31

^1.在回归方程中Y = A.x+B哪里Y指山顶面积和x为指标浓度(μg·毫升^−1.).

3.1.3。精度

记录并计算6种化合物的色谱峰面积和相对标准偏差(RSD)。在表2.， 6种化合物对仪器精密度的RSD结果为0.42% ~ 0.75%。此外，用中间精密度计算的rsd均小于3%。结果表明，该方法具有较好的精度。


指示元件	仪器精度(N= 6)	中等精度(N= 6)	稳定性(N= 6)	重复性(N= 6)	准确度(N= 6)
指示元件	相对标准偏差（%）	相对标准偏差（%）	相对标准偏差（%）	相对标准偏差（%）	平均回收率(%)	相对标准偏差（%）

整洁的,O-葡糖基西米呋金	0.75	2．4	0.84	1.03	99.87	1.66
西米夫金	0.56	1.69	0.56	0.73	97.34	0.77
4 ' -O-β-D-glucosyl-5 -O-甲基维氨醇	0.43	1.23	0.54	0.49	96.98	1.31
5－O-甲基维氨醇	0.42	0.36	0.57	0．8	102.5	1.03
秒- - - - - -O-glucosylhamaudol	0.37	1.06	0.34	0.96	98.13	0.71
哈马多	0.67	1.45	0.69	1.35	99.48	0.68

3.1.4.稳定性

记录了GC、C、GV、V、GH和H的峰面积，RSD分别为0.84%、0.56%、054%、0.57%、0.34%和0.69%。因此，样品溶液在室温下24 h内是稳定的2.).

3.1.5。可重复性

结果表明，GC、C、GV、V、GH和H的平均质量分数分别为1.478、0.808、2.510、0.173、1.053和0.151 mg·g^−1.相应平均质量分数的RSD分别为1.03%、0.73%、0.49%、0.80%、0.96%和1.35%，证明该定量方法具有良好的重复性。

3.1.6.准确度

由于六种标记化合物的平均回收率在96.98%–102.5%之间变化，因此具有良好的准确性。同时，每种化合物的回收率的RSD值均低于3%。

３.２．QAMS方法

3.2.1之上。计算相对离心力

选择GV作为内标，并计算RCF值(F_x)对于其他五个指标，根据方程式计算不同浓度下的指标(3.)如上所述。每种化合物的平均RCF如下所示：F_GC= 1.047 (rsd % = 2.32)，F_C= 0.6489 (rsd % = 0.24)，F_v= 0.5909 (rsd % = 0.30)，F_生长激素 = 0.7223（相对标准偏差% = 0.68）及F_H= 0.7223 (rsd % = 0.28)。

3.2.2. 循环流化床耐久性试验

结果表明，5种颜色单体在不同条件(仪器、色谱柱、流速和柱温)下的RCF均小于5%，表明该方法计算得到的RCF具有良好的耐久性和系统适用性，适用于常规检测。

3.2.3.被测组分色谱峰的位置

色谱峰位置通过相对保留时间（RRT）确定，相对保留时间根据以下方程式计算：在哪里T_Rk是被测成分的保留时间，T_RS保留时间是否为内部参考，△T_地基处理是两者在保留时间上的差异。其中，明确识别出了GV的色谱峰位置，并将其指定为SR样品中的参比峰。采用不同仪器、不同色谱柱同时测定GV与其他5种成分的RRT, rsd均小于5%。结果表明，该计算方法稳定可靠，可用于鉴别被测组分的色谱峰位。

3.2.4。QAMS与ESM结果比较

采用QAMS法和ESM法测定了15批商品锶的含量。结果如表所示3.. 在两个分量变量之间建立相对误差（RE），以检查QAM和ESM之间的偏差。通过比较QAMS和ESM中五种成分的两组含量，发现它们的含量变化在5%的范围内。符合中国药典要求。为了评估结果的一致性，使用相关分析来评估QAMS方法和ESM之间的相似性。相关系数值是相似度评价中常用的参数。值越大，目标样本的相似性越高。当它们等于1时，目标相同。在这项工作中，数据如下表所示4.，均在0.900以上，表明QAMS与ESM之间无显著差异，所鉴定的RCF和所测色单体的色谱峰位参数可靠。综上所述，QAMS可用于六种色氨酸的测定。


不。	GV	GC			C			v			生长激素			H
不。	ESM	ESM	QAMS	相对误差（%）	ESM	QAMS	相对误差（%）	ESM	QAMS	相对误差（%）	ESM	QAMS	相对误差（%）	ESM	QAMS	相对误差（%）

1.	2.896	4.295	4.289	−0.14	1.048	1.047	−0.10	0.09829	0.09793	−0.37	1.069	1.070	0.09	0.06459	0.06460	0.02
2.	0.8574	2.646	2.642	−0.15	0.3916	0.3914	−0.05	0.04527	0.04511	−0.35	0.2362	0.2364	0.08	0.1061	0.1061	0
3.	1.889	3.783	3.778	−0.13	0.7479	0.7475	−0.05	0.06943	0.06918	−0.36	0.9545	0.9553	0.08	0.1507	0.1507	0
4.	2.480	2.885	2.881	−0.14	0.2100	0.2098	−0.10	0.05922	0.05901	−0.35	0.2845	0.2847	0.07	0.020008	0.02009	0.05
5.	2.848	3.510	3.505	−0.14	0.9254	0.9248	−0.06	0.08080	0.08051	−0.36	0.7045	0.7051	0.09	0.06158	0.06159	0.02
6.	1.832	2.019	2.016	−0.15	0.6268	0.6264	−0.06	0.05237	0.05219	−0.34	0.2341	0.2343	0.09	0.02235	0.02236	0.04
7.	1.961	2.241	2.239	−0.09	0.5400	0.5396	−0.07	0.05959	0.05937	−0.37	0.2508	0.2510	0.08	0.07276	0.07278	0.03
8.	2.062	2.249	2.246	−0.13	0.2459	0.2458	−0.04	0.06527	0.06503	−0.37	0.2155	0.2157	0.09	0.0256	0.02565	0
9	1.390	4.122	4.123	0.02	0.3810	0.3809	−0.03	0.0398	0.03918	−0.51	0.4580	0.4593	0.28	0.08772	0.08785	0.15
10	3.961	2.466	2.466	0	1.469	1.469	0	0.2263	0.2251	−0.53	1.264	1.267	0.24	0.3047	0.3051	0.13
11	2.004	3.054	3.054	0	1.491	1.491	0	0.1301	0.1294	−0.54	0.7997	0.8018	0.26	0.1760	0.1763	0.17
12	2.519	2.363	2.363	0	1.029	1.030	0.10	0.08996	0.08953	−0.48	0.6982	0.6997	0.21	0.06253	0.06263	0.16
13	2.848	4.417	4.416	−0.02	1.754	1.756	0.11	0.1763	0.1754	−0.51	0.9507	0.9528	0.22	0.1461	0.1463	0.14
14	2.233	4.983	4.983	0	0.799	0.800	0.09	0.07737	0.07700	−0.48	0.8065	0.8082	0.21	0.07475	0.07487	0.16
15	4.038	3.972	3.973	0.03	1.239	1.238	−0.08	0.1380	0.1372	−0.58	0.6367	0.6384	0.27	0.05454	0.05462	0.15

相关系数		0.999996894			0.999998781			0.999996565			0.99999876			0.999999518


不。	复合内容(mg·g^−1.)
不。	GC	C	GV	v	生长激素	H	总计

1.	1.317	0.4275	1.261	0.02920	0.2946	0.03354	3.363
2.	2.418	0.4976	2.382	0.04779	0.3659	0.03554	5.747
3.	2.651	0.5458	2.698	0.06159	0.3781	0.02972	6.364
4.	1.337	0.6792	1.654	0.04434	0.2859	0.06364	4.064
5.	2.689	0.2197	2.876	0.03020	0.3112	0.01964	6.146
6.	4.573	1.107	1.955	0.03020	0.5887	0.08134	8.335
7.	1.729	0.4001	1.835	0.03092	0.1675	0.02509	4.188
8.	2.564	0.3944	3.718	0.04341	0.2723	0.02125	7.013
9	2.430	0.1014	2.255	0.03667	0.2496	0.01529	5.088
10	2.258	0.6732	2.216	0	0.3463	0.05838	5.552
11	1.304	0.344	1.449	0.03023	0.3543	0.06303	3.545
12	2.452	0.1243	2.755	0.03687	0.1534	0.05423	5.576
13	1.346	0.9504	1.465	0.06466	0.3278	0.11580	4.270
14	1.777	0.5765	1.127	0.02988	0.2396	0.08358	3.834
15	1.786	0.6144	1.364	0.03312	0.1714	0.05189	4.021
16	2.896	0.422	2.682	0.06387	0.5827	0.09963	6.746
17	4.69	1.02	2.551	0.10200	1.1490	0.15070	9.663
18	1.043	0.2811	1.573	0.02553	0.1242	0	3.047
19	1.717	0.6368	1.962	0.08296	0.2502	0.15210	4.801
20	2.28	0.983	2.533	0.09785	0.3417	0.07771	6.313
21	2.729	0.3448	2.464	0.04038	0.2646	0.02275	5.866
22	4.2	1.147	3.442	0.14280	0.6112	0.06122	9.604
23	2.139	0.1695	1.929	0	0.3146	0.01560	4.568
24	2.744	0.8955	2.324	0.08142	0.7392	0.1081	6.892
25	4.45	1.843	2.509	0.09471	0.6873	0.07324	9.657
26	2.817	1.401	2.608	0.09266	0.9524	0.07638	7.947
27	2.368	0.5529	2.202	0.05162	0.3305	0.07492	5.580
28	1.487	0.1982	1.880	0.03231	0.1906	0.01684	3.805
29	3.599	0.6820	2.030	0.04863	0.5045	0.06149	6.926
30	2.116	1.4090	3.498	0.11720	0.3130	0.04773	7.501
31	4.237	1.2030	1.818	0.03805	0.7812	0.06076	8.138
32	2.077	0.9935	2.653	0.08411	0.3187	0.07907	6.205
33	2.221	1.1080	2.931	0.10130	0.2647	0.06694	6.693
34	1.863	0.3630	0.941	0.03012	0.3419	0.07997	3.619
35	1.818	0.3075	1.096	0	0.3717	0.12460	3.718
36	2.134	0.3686	1.076	0	0.1803	0.06089	3.820
37	2.173	1.3010	1.232	0.04985	0.5113	0.12210	5.389
38	3.773	0.3078	3.220	0.06403	0.3651	0.02726	7.757
39	2.234	0.4056	1.289	0	0.1985	0.03652	4.164
40	2.168	0.4823	1.776	0	0.2772	0.05842	4.762
41	1.490	0.4874	1.240	0	0.3820	0.12980	3.729
42	1.708	0.3880	1.587	0	0.3404	0.13020	4.154
43	1.834	0.2949	2.261	0.03667	0.1705	0.02114	4.618
44	2.199	0.5615	2.569	0.06130	0.2619	0.13020	5.783
45	3.667	1.3310	3.572	0.12560	0.8210	0.08447	9.601
46	1.985	0.1671	1.610	0.04060	0.1129	0.03844	3.954
47	1.765	0.2047	1.508	0.03583	0.1699	0	3.683
48	2.363	1.0300	2.519	0.08953	0.6997	0.06263	6.764
49	3.670	1.3180	1.900	0.11270	0.8467	0.18620	8.034
50	2.447	0.5516	1.778	0.07714	0.4362	0.07921	5.369
51	2.466	1.4690	3.961	0.22510	1.2670	0.30510	9.693
52	4.416	1.7560	2.848	0.17540	0.9528	0.14630	10.300
53	5.136	1.2960	3.769	0.17010	0.7804	0.07168	11.220
54	1.901	0.5797	0.953	0.03516	0.2994	0.10780	3.876
55	1.825	0.3481	0.867	0.03686	0.3172	0.09194	3.486

３．３．应用及数据分析

3.3.1。55批商品锶中6种色酮化合物的样品分析与特征

采用QAMS对来自不同地区的55批商用稻中6种色素的含量(GC、C、GV、V、GH和H)进行了测定。结果列于表中4.6种化合物的最大总含量为11.22 mg·g^−1.在S53号中，这些物质的最低总含量为3.047 mg·g^−1.这55批商品SR的浓度差异如此之大，可能归因于多种因素，包括植物来源、遗传变异和地理差异。为了进一步验证样品之间的关系并评估六种化合物的变异，我们进行了PCA、系数分析和HCA使用SPSS 22.0软件（IBM，美国）。

3.3.2. 主成分分析与相关分析

GC的含量(X_1.), C (X_2.)、问(X_3.)，V(X_4.)、GH (X_5.)及H (X_6.)，对55批商品样品进行PCA检测。结果如图所示3.．建立双主成分PCA模型，累计变异量为80.260%，其中第一个主成分(Z_1.)为62.614%，其次为(Z_2.)为17.646%。根据各成分得分系数矩阵(表5.图形4.)，每个系数之间Z_1.有六个指标是显著的，可以表明Z_1.代表六种成分的总含量。也就是说，每一种成分对SR.的质量评价都是必不可少的。Z_2.主要是反映X_6.由于其系数最大（0.733），综合得分(Z)对于每批样品，可按如下方式获得：


	主成分
	Z_1.	Z_2.

X_1.	0.749	−0.365
X_2.	0.866	0.122
X_3.	0.679	−0.580
X_4.	0.900	−0.049
X_5.	0.903	0.184
X_6.	0.599	0.733

55批样品的详细信息如表所示6..通过对每批样品的结果进行相关性分析，发现Z相关系数为0.875,6种成分的总含量均可纳入。因此，以6种成分的总含量为指标，综合评价枸杞的质量是可行的。同时，我们初步确定6种色素的总含量不小于3 mg·g^−1.根据以上测定的含量范围(3.047-11.22 mg·g^−1.).


不。	Z

1.	−2.2088
2.	−0.8149
3.	−0.3972
4.	−1.2788
5.	−1.3328
6.	−1.4037
7.	−2.187
8.	−0.7398
9	−1.9465
10	−1.1080
11	−1.8149
12	−1.5472
13	−0.1805
14	−1.5233
15	−1.7940
16	0.6962
17	4.3433
18	−3.1265
19	0.1636
20	0.7331
21	−1.2827
22	3.0727
23	−2.3900
24	1.7230
25	3.4021
26	2.8143
27	−0.4977
28	−2.5341
29	0.3312
30	1.4697
31	1.6586
32	0.5130
33	0.7921
34	−1.6345
35	−1.5166
36	−2.3571
37	0.8094
38	−0.0475
39	−2.3745
40	−1.7203
41	−1.2931
42	−1.2774
43	−2.0675
44	0.0793
45	3.6328
46	−2.3500
47	−2.7293
48	1.3859
49	3.8177
50	−0.0636
51	7.7397
52	5.6501
53	4.5777
54	−1.1113
55	−1.5619

3.3.3。杂环胺

利用HCA对GC、G、GV、V、GH、h的浓度进行分析，结果显示54批商品SRs(第51批为自成体系，不考虑)分为两类，如图所示5.一方面，第一组由45批样品组成（34、55、14、54、1、11、4、15、36、39、10、40、41、42、35、18、47、7、28、43、46、23、27、50、16、29、2、3、5、21、9、12、8、38、19、44、13、37、24、48、26、20、32、33、30），其中六种成分的总含量不超过8 mg·g^−1.．其余9批样品(6、31、25、22、45、53、17、49、52)均属于第二类，均大于8 mg·g^−1.的指标。与本部门的结果联系３．１．1.，有力地证明以GC、G、GV、V、GH和H的总含量作为指标可以合理、全面、客观地评价SR的质量。

对于SR的质量评估，色酮苷元不应被忽略，因为这在SR的药理活性中起着重要作用。此外，如表所示5.， C、V、H的相关系数均显著(0.866、0.900、0.0599)。以C、V、H总含量与6种色酮总含量的比值为指标，用HCA将53批商业SRs分为两类(第13批和第37批为自成体系，不考虑)。具体情况见表7.和数字6.．集群1包括41个批次(32岁,54岁,14日,19日,20日,4日,33岁,15日,48岁,25日,30日,51岁,49岁,52岁,26日,6日,31日,45岁的24日,41岁,11日,42岁,27岁,17岁,50岁,34岁,44岁,53岁,55岁,22岁,2,18日,7日,39岁,29岁,40岁,36岁,35),该比率大于10%。同时，其余12批样本(12、23、5、38、9、8、47、28、46、21、16、43)归属于聚类2，比例小于10%。说明这三种色素苷元的重要性，可作为评价黄连药材质量的指标。


不。	比率

1.	14.58
2.	10.11
3.	10.01
4.	19.37
5.	4.39
6.	14.62
7.	10.89
8.	6.55
9	3.01
10	13.18
11	12.34
12	3.86
13	26.49
14	18
15	17.39
16	8.68
17	13.17
18	10.06
19	18.16
20	18.35
21	6.95
22	14.07
23	4.05
24	15.74
25	20.82
26	19.76
27	12.18
28	6．50
29	11.44
30	20.98
31	16
32	18.64
33	19.07
34	13.07
35	11.62
36	11.24
37	27.33
38	5.14
39	10.62
40	11.36
41	16.55
42	12.48
43	7.64
44	13.02
45	16.05
46	6.23
47	6.53
48	17.48
49	20.13
50	13.19
51	20.62
52	20.18
53	13.70
54	18.64
55	13.68

最后但并非最不重要,基于聚类分析的结果两次,集群的样品2(45 6日31日,25日,22日,53岁,17岁,49岁,52)在第一HCA都包含集群1(32岁,54岁,14日,19日,20日,4日,33岁,15日,48岁,25日,30日,51岁,49岁,52岁,26日,6日,31日,45岁的24日,41岁,11日,42岁,27岁,17岁,50岁,34岁,44岁,53岁,55岁,22岁,2,18日,7日,39岁,29岁,40岁,36岁,35) in the second HCA。因此，我们可以初步推断，当GC、C、GV、V、GH、H的总浓度大于8 mg·g时，SR是一种较好的药物^−1.. 同时，苷元（C、V和H）的比例大于10%。在本研究中，9批样品（6,31,25,22,45,53,17,49,52）为优药，6个色酮含量大于8 mg·g^−1.同时，C、V和H的总含量均大于0.8 mg·g^−1.．

3．4．样品制备的优化

通过单因素试验对提取方法、溶剂、溶剂体积、提取时间进行优化，得到最佳提取效率。结果表明，回流提取法对分析物的提取效率高于超声提取法，因此剩余实验采用回流提取法，并与甲醇、70%甲醇、50%甲醇等溶剂进行比较，选择甲醇为最佳溶剂。分别测定提取体积(5、10、15 ml)和提取次数(60、120、240 min)。因此，当SR粉为0.25 g时，最佳制样参数为10 mL甲醇回流120 min。

4.结论

在常规高效液相色谱装置的基础上，建立了以GV为内标测定GV与其它五种色酮（GC、C、V、GH和H）之间RCF的方法——QAMS法根据方法验证的结果，QAMS的质量评估准确可行，QAMS和ESM获得的含量结果不存在显著差异。使用该方法，对来自不同地区的55批商业SR进行了测定，并对结果进行了PCA分析，相关性和相关性分析这可能包括色酮对锶的质量起着重要作用；同时，GC、C、GV、V、GH和H的总含量被用作全面、客观和可靠的评价指标。除此之外，如果六种铬的总含量莫内斯不少于3岁 mg·g^−1.. 此外，还进一步证明了色酮苷元对SR质量评价的重要性。如果GC、C、GV、V、GH和H的总含量大于8，则可以初步推断它是一种优良的SR药物 mg·g^−1.；C、V、H的比例均大于10%。

综上所述，这些研究结果为商业锶的发展提供了有用的信息，不同来源或不同购买地点的锶的质量是混乱和不稳定的。因此，应建立强制性SR处理标准并加以规范。最后，上述一系列的分析将对改进企业质量评价体系起到积极的作用。

数据可用性

所有用于支持本研究结果的色谱数据可根据要求从通讯作者处获得。

的利益冲突

作者声明，本论文的发表不存在利益冲突。

致谢

本研究由北京市教委普通建设项目资助(no. 20141202)。2016022)。

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