用超高效液相色谱-质谱法研究鼠毛氨酸和鼠毛氨酸的组织分布

抽象的

毛细素和毛细素是从中药中提取的两种生物碱单体钩藤rhynchophylla具有抗高血压、抗感染和保护心脏等药理作用。建立了超高效液相色谱-质谱联用法测定组织(肝、肾、心、脾、脑、肺)中毛细素和毛细素的含量，并对其吸收、分布和代谢进行了研究，为其药理作用机制提供信息。UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm × 100 mm, 1.7μ.M）用于色谱分离。流动相是乙腈-0.1％甲酸，梯度洗脱，总运行时间为4分钟。在正离子模式下使用电喷雾，并且多反应监测（MRM）模式用于定量。使用乙腈沉淀法去除蛋白处理的小鼠血浆和组织匀浆样品。在2-5000ng / g的浓度范围内，组织中的氯丁丁和君堇显示出良好的线性度（R > 0.995), and the lower limit of quantification was 2 ng/g. In the plasma and liver tissues, the interday and intraday precision of hirsutine and hirsuteine was less than 15%, the accuracy was between 90.9% and 110.1%, and the average recovery was better than 73.0%. The matrix effect was between 86.2% and 104.7%. The results showed that the precision, accuracy, recovery, and matrix effects meet the requirements for the study on the distribution of hirsutine and hirsuteine. After intraperitoneal administration of 10 mg/kg hirsutine and hirsuteine in mice, the distribution levels were highest in liver and kidney tissues, followed by the spleen and lung. Hirsutine and hirsuteine were low in brain tissue, but had obvious distribution, suggesting that they may pass through the blood-brain barrier.

1.介绍

钩藤rhynchophylla（miq。）miq。前哈维尔.是一种常用的中药，属于钩藤Schrebernom.缺点。1.–3.］.药理研究表明钩藤rhynchophylla对钙有拮抗作用²⁺，它可以阻止外部CA²⁺涌入和释放内部CA²⁺[4.］.它对心血管系统具有很强的抑制作用，并显着降低了血压;它具有明显的神经传导阻滞浸润麻醉和脊柱管腔麻醉;它对中枢神经系统的突触传递过程具有显着的抑制作用，具有抗癫痫作用[5.–7.］.它可用于治疗高血压，镇静，睡眠和反痉挛效应[8.–12.］.吲哚生物碱钩藤rhynchophylla是主要的活性成分。

身体中药物的分布与药物的药理作用密切相关，它们的分布决定了效果的强度和持续时间[13.–15.］.目前尚不清楚六葡萄酒和君堇是否可以吸收到血液及其新陈代谢和组织分布中。然而，在文献中尚未报告有关六葡萄酒和君堇的组织分布的研究。

组织分布是药代动力学研究的不可或缺的一部分，它可以澄清组织药物浓度随着给药时间的变化趋势，然后评估药物在体内的靶向和组织积累，并判断药物的安全性和有效性[16.–18.］.在本文中，我们建立了用于定量测定组织匀浆中六葡萄酒和君堇的UPLC-MS / MS方法。

2.实验性

2．1.试剂和动物

从成都蒙斯特制药有限公司（中国成都）购买了多毛碱和多毛碱（纯度>98%）以及地西泮（内标，纯度>98%）。色谱纯乙腈、甲醇和甲酸购自Tedia（美国俄亥俄州）。超纯水通过微孔净化系统制备（美国马萨诸塞州贝德福德）。ICR小鼠（20只） ± 2g，雄性）由温州医科大学动物实验中心提供。

２.２.仪器和条件

ACQUITY H类UPLC和XEVO TQS-MICRO TRIPLE QUADRUPOLE质谱仪（Waters Corp，Milford，MA，USA）。MassLynx 4.1软件（Waters Corp.）用于数据采集和仪器控制。

色谱柱是Waters UPLC BEH C18（2.1mm×50mm，1.7 μ.m），柱温为40℃。流动相由0.1％甲酸 - 乙腈组成，流速为0.4ml / min。梯度洗脱步骤为：0-0.2分钟，乙腈10％;0.2-1.5分钟，乙腈10％-80％;1.5-2.0分钟，乙腈80％;2.0-2.5分钟，乙腈80％-10％;和2.5-4.0分钟，乙腈10％。

质谱参数设置为毛细管电压2.5 kV，源温度150°C，脱溶温度500°C，脱溶气体为氮气(900 L/h)和锥状气体(50 L/h)。采用MRM模式定量分析毛精Z369.2⟶226.0，hirsuteine m /Z367169.9和内标（Diazepam）M /Z285.1⟶193.3。

2.3. 对照溶液的制备

将氯丁丁和血清堇精确称量为10ml容量烧瓶，用甲醇 - 水（50：50）制备氯丁丁和苯堇（1.0mg / ml）储备溶液。将Diazepam精确称量为10mL容量烧瓶，用甲醇 - 水（50：50）制备二嗪泮（1.0mg / ml）储备溶液。将储备溶液用甲醇稀释至各种浓度的工作溶液，储存在4℃的冰箱中，在使用期间在室温下保持。

2.4。样品处理

组织样品从冰箱中取出并解冻。组织被研磨，然后称重（50mg）。将称量的组织置于1.5ml离心管中，并将其置于200毫升 μ.加入了内标（50ng / ml）乙腈。涡旋1.0分钟后，将其放置在低温高速离心机（13000 r / mim，4°C）中10分钟。然后，150 μ.上清液的L拍摄并将其放入套管中，进入样品瓶中，2 μ.L为注射用，用于UPLC-MS/MS检测。

2.5。标准曲线

将适量的氯丁丁和血清素工作溶液添加到空白组织（脑，肾，心脏，肝脏，脾脏和肺部）中，以制备六葡萄酒和血轮标准曲线。浓度在2-5000ng / g的范围内，浓度为2,5,20,100,200,500,1000,2000和5000ng / g。以与标准曲线相同的方式，质量控制样品（QC）以三种浓度（4,450和4500ng / g）制备。

2.6。方法验证

2.6.1。选择性

为了分析用六核，六乌斯汀和内标掺入的空白组织和空白组织，组织样品以10mg / kg在小鼠中腹膜内施用，以评估该方法的选择性。

2.6.2。线性

将标准工作溶液制备成不同标准系列，标准浓度范围为2至5000ng / g。在与要测量的组织样品的条件相同，测量每个峰的峰面积，并且使用峰面积与内标峰面积的比率来吸引样品浓度的标准曲线。

2.6.3。精度和准确性

通过测量这三种质控样品浓度水平（4450和4500）的组织样品来评估精密度和准确度 ng/g），共6次重复。日内和日间精密度通过连续三天在三个浓度水平下测量QC样品来确定。通过测量三个浓度水平下QC样品的平均值与连续三天的真实值的一致性，确定日内和日间准确度。

2.6.4. 回收率和基质效应

通过将测量的低，培养基和高浓度QC样品与相应的标准峰面积进行比较来评估回收。通过使用乙腈-0.1将通过制备样品处​​理后制备坯料等离子体或组织以制备低，培养基和高浓度（4,450和4500ng / g）而获得的峰值区域。％甲酸（1：1，v / v）评估基质效应。

2.6.5. 稳定性

小鼠QC样品分别在低、中、高浓度(4,450和4500 ng/g)条件下进行分析，分别在小鼠血浆或组织中研究trichostine和dehydropilus。对进样小瓶的稳定性、短期稳定性(室温下2小时)、长期稳定性(−20℃，30天)、冻融稳定性(−20℃至室温)和3种浓度的新鲜制备(4,450和4500ng /g)标准样品的峰面积进行了比较，以考察稳定性。

2.7。组织分布

30只小鼠腹腔注射毛茸和毛茸碱10 mg/kg，分别在0.25、0.5、2、4、6、12 h，加入4%氯化物，醛麻醉后处死5只小鼠，收集组织标本(肝、肾、心、脾、脑、肺)。收集后，用冰冷的盐水清洗表面，用滤纸干燥。然后将组织样本保存在−20°C。

3。结果与讨论

3.1. 方法优化

电喷雾ESI阳性和负极选择通常在方法学研究中进行评估[19.］.本文使用MRM阳性离子模式用于定量分析。通过优化离子电离参数，将所选的量化离子设置为M /Z369.2326.0为君森，以及m /Z367⟶169.9为君堇。

HPLC条件尽可能从分析物和内标分离内源性干扰物质，并且柱子和流动相的色谱行为起到决定性的作用[20.–22.］.BEH C18 (2.1 mm × 50 mm, 1.7μ.M)可以得到满意的峰时间和峰形。我们还尝试了不同的流动相，如乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸和甲醇-0.1%甲酸，发现乙腈-0.1%甲酸的峰形和灵敏度最好。因此，BEH C18 (2.1 mm × 50 mm, 1.7μ.M）柱用于该工作中，使用乙腈-01％甲酸。

在UPLC-MS/MS分析之前，去除蛋白质和潜在干扰是方法开发的关键[23.–25.］.在我们之前的工作中，我们发现快速简单的乙腈沉淀法对大鼠血浆的效果最好。考虑到组织标本比血浆复杂，50 mg组织匀浆经200℃处理μ.乙腈沉淀。结果表明，直接蛋白沉淀法可以获得较好的提取回收率和基质效果。

3.2。方法验证

3.2.1之上。选择性

数字1.显示空白肝组织、含多毛碱、多毛碱和内标物的空白肝组织以及小鼠样品的典型UPLC-MS/MS光谱。在粗氨酸、粗氨酸和内标物的保留时间内未发现干扰物质。

3.2.2。标准曲线和敏感性

浓度范围为2-5000ng / g，峰面积比和浓度线性回归。各种组织的线性方程如表所示1..组织的定量下限为2ng / g，精度在10％至18％之间，精度在85％和118％之间。检出限为0.5ng / g，信噪比为3。

3.2.3. 精密度、准确度、回收率和基质效应

表中的数据2.结果表明，对于组织中的毛细和毛细，日内精度小于13.5%，日间精度小于14.5%。日内精度在90.8% - 110.1%之间，日内精度在88.8% - 113.6%之间。平均回收率在73.0% ~ 95.5%之间，基质效应在86.2% ~ 104.7%之间。结果表明，精密度、精密度、回收率和基质效应满足研究毛细素和毛细素分布的要求。

3.2.4。稳定

将小鼠组织样品在室温下在室温下测试2小时，在-20℃下30天，也进行了冷冻稳定性试验。结果表明，林林和林堇的变异在±15％以内，RSD在15％以内，表明它们是稳定的。

3.3。组织分布

在腹膜内注射10mg / kg氯丁嘌呤和君王小鼠后，组织的平均时间分布曲线如图所示2..浓度高于5000ng / g的组织样品用坯料组织稀释10倍。

尽管一些文献研究报道了大鼠体内的多毛碱或多毛碱的药代动力学[26.–29.]没有文献报告了六葡萄酒或君丝松的组织分布。汉等人。建立了UPLC-MS / MS方法，以确定在大鼠等离子体中的六葡萄酒和君堇，用100 μ.l等离子体，需要4分钟一次样品[26.］.Wu等人。使用UPLC-MS / MS法测定口服给药后等离子体中的rhynchophylline和六核;需要使用100个样品6分钟进行分析和液液萃取 μ.L等离子体[27.］.Kushida等人。使用100，开发了一种LC / MS-MS方法，用于同时测定大鼠等离子体和大脑中的七种生物碱，使用100 μ.l血浆或脑[29.]. 然而，在这些文献研究中，并未报道大鼠或小鼠体内的多毛碱和多毛碱的组织分布。

它通过血液循环在各种组织和器官中迅速分布，最高水平分布在肝肾组织中，然后是脾脏和肺。这种现象表明它广泛分布在小鼠中，这可能与林丁和君瑞琳的脂质溶解度相关。随着施用时间的延伸，每个组织中的氯丁丁和氯堇的药物浓度迅速下降，每组组织的浓度在6小时下已经低。最高浓度是肝肾组织。六葡萄酒和君堇的代谢主要发生在肝脏组织中，其在肾组织中排出，并且可能与肝脏和肾组织的大血流量和良好的血液流动有关。血红序和血清堇脑组织较低，但具有明显的分布，表明药物可能通过血脑屏障。

4。结论

我们建立了一种基于UPLC-MS / MS的方法，用于检测组织中的六葡萄酒和林堇，线性范围为2-5000ng / g。UPLC-MS / MS简单且敏感，需要50毫克组织。用10mg / kg六葡葡萄酒和君堇向小鼠注射腹膜内注射后，肝脏和肾组织中的分布水平最高，其次是脾脏和肺。本研究的结果还有助于更好地了解六葡萄酒和君毛汀的药理学机制。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包含在文章中。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

该研究得到了浙江药业协会（2017年ZY31和2019ZY10）。

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