MyCo化学筛选和分析，抗氧化活性和发酵菌株Snef1216的生化组成（青霉菌chrysogenum)

摘要

抗氧化剂是一种自由基清除剂，可以抑制过氧化反应和其他自由基过程，反过来保护不同的生物体免受由自由基反应引起的各种疾病。合成抗氧化剂可以抑制自由基，但它们也有有害的副作用。然而，天然真菌来源的分支化学物质是安全的和有害的合成化学抗氧化剂的最佳替代品。这项研究的主要目标包括Snef1216的适当的定性和定量分支化学筛选、抗氧化能力和化学成分(青霉菌chrysogenum)。该研究采用氯化铝Colouremetric方法，Folin-Ciocalteu试剂测定和DPPH（1,1-二苯基-1-PICRYDRALADALAZALALZERALDRHOWDRALZEL）分别分析总黄酮含量和酚含量和抗氧化活性。然而，通过气相色谱 - 质谱（GC-MS）筛选生物活性化合物的存在。定量分析证明存在类黄酮，糖苷，黄酮，皂苷，酚类和不包括生物碱，三萜类化合物，类固醇和知性单宁的儿香糖单宁。结果暴露了总黄酮含量和酚醛含量p . chrysogenum分别为85.31±1.23 mg·QE/g和135.77±1.14 mg·GAE/g。Snef1216 (p . chrysogenum）显示最高的自由基清除活性，抑制DPPH的63.86％。分析证实了SNEF1216（p . chrysogenum)是天然抗氧化剂的另一来源。所获得的数据为其在农业、环境和制药工业中的应用提供了基础。

1.介绍

自由基与人类许多慢性和急性疾病有关，如哮喘、动脉粥样硬化性白内障、糖尿病、肝损伤和神经退行性疾病[1]。抗氧化剂是通过废除其靶位部位来抑制自由基的有用成分[2]。它们有能力捕获自由基，如过氧化氢和过氧化氢，这些自由基会抑制氧化并导致退化阵列[3.]。合成抗氧化剂抑制自由基，并且还具有有害的副作用[4]。然而，天然的分支化学物质资源是安全的，是化学抗氧化剂的更好替代品[5]。真菌是天然抗氧化剂的重要来源，因为它们具有产生次生代谢产物的天然能力[6]。它们含有抗氧化剂，包括类固醇、醌类、生物碱、苯丙烷类、生育酚、酚、单宁、内酯、萜类、三萜类胡萝卜素和类黄酮等。7]。

真菌中所含的化学物质如酚类物质由于具有抗氧化抑制疾病的特性而受到人们的广泛关注。酚类和类黄酮是真菌的主要次生代谢物[6]。此外，真菌来源的酚类和类黄酮含量可作为潜在的治疗药物，如抗诱变、抗生素、抗癌和抗氧化剂[8]。属真菌aspergillus.,毛壳菌属,Creosphaeria,镰刀,毛霉菌,青霉菌,Tolypoclaidium,Xylariaceae显示出非凡的抗氧化潜力[9]。

属真菌青霉菌在本质上是很常见的[10]。它们是丝状真菌的嗜酸性生物，但也可以殖民化广泛的材料[11]。它们通过分解各种外来生物在生物修复过程中发挥重要作用[12]。它们产生多种初级和次级代谢产物，这主要是由于它们含有类黄酮、生物碱、矿物质、蛋白质、酚、单宁、维生素和抗氧化活性等生物活性成分[5]。

青霉菌chrysogenum是一个常见的模具，并在几乎所有生态系统中存在[13]。青霉素是第一个从该物种中分离出来的抗生素，其具有生物活性的次生代谢物是近几十年来深入研究的课题[11]。从样品中分离出许多具有生物活性的物质p . chrysogenum如丹宁酸、生物碱、萜类和丹宁酸[6]。它被发现的品种青霉菌产生清除的DPPH自由基[14]。青霉烯醇、丙烯酸D和阿托品venetin均从青霉菌sp.作为一种潜在的抗氧化剂[15]。

应变Snef1216 (青霉菌chrysogenum)被Jiang等人识别[16]。Yao等人[17]和Sikandar等人[18报告了它的效率有隐姓埋名的女人(根结线虫)分别在番茄和黄瓜。然而，分枝化学分析和生物活性化合物的存在尚未得到适当的研究。因此，本研究拟对发酵菌株Snef1216 (青霉菌chrysogenum)于2019年在沈阳农业大学中国北方线虫学研究所(NINC)工作。

2.材料和方法

2.1。Snef1216菌株的活化(p . chrysogenum)和发酵的准备

菌株Snef1216 (p . chrysogenum）从中国一般微生物培养中心获得并保持在-80°C。为了确认菌株的纯度和活化，将少量将该菌株加入到PDA-（马铃薯葡萄糖琼脂 - ）填充的空腔中，然后在25-28℃下保持在培养箱7天。发酵的营养培养基的组成：50g蔗糖，8g硝酸钠，磷酸二钾，0.4g氯化钾，0.08g硫酸镁七水合物，以及0.003g硫酸亚硫酸氢盐，在1000ml蒸馏水中混合。将随后的混合物煮沸5-6分钟，然后将100ml培养基倒入250mL烧瓶中。将培养基在蒸汽高压灭菌机（Ziamen）仪器有限公司，型号NO.GI54DS型号）灭菌30分钟，在121°C下加入5个真菌蛋糕（每次直径约1毫米）进入100毫升培养基。然后，将所得混合物在150rpm和28℃下置于振荡器中3天。3天后，将100ml新的营养培养基加入每个烧瓶中，然后在150rpm和28℃下置于振荡器8天。过滤发酵并在4℃下储存直至使用[16- - - - - -18]。

2.2。定性Mycochemical分析

对发酵菌株Snef1216 (p . chrysogenum)使用标准方法。

2.2.1。苷类测试

用3毫升5%氯化铁(FeCl)测定糖苷的存在性_3.)和3ml蒸馏水放入3ml的发酵液中。然后，将混合物在水浴中加热15分钟。冷却后，倒入1.5 ml苯，用力摇晃15秒。随后的混合物在室温下静置1分钟。加入5-6滴浓氨(NH)_3.)，使混合物呈现粉红色，证实了糖苷的存在[19]。

2.2.2。生物碱类测试

通过将3ml 2％盐酸（HCl）加入干发酵，将生物碱加入干发酵，并将混合物在100℃下在水浴中加热15分钟。将过滤的混合物同样倒入两根试管中。将2-4滴拖拉渣试剂倒入一个试管中，而2-4滴梅尔试剂倒入第二试管中。用混合物中的黄色沉淀物存在测定生物碱的存在[20.]。

2.2.3。黄酮类和黄酮类化合物试验

在6ml的发酵液中加入4ml稀释的氢氧化钠(NaOH)，测定了黄酮类化合物和黄酮类化合物的含量，结果显示混合物呈黄色。然后在混合物中加入2ml 5N盐酸(HCl)，使其无色，证实了黄酮类化合物的存在，而橙色则证实了黄酮类化合物的存在[19]。

2.2.4。酚类测试

苯酚的存在是根据Ahmed等[21]。3毫升蒸馏水和3-4滴10%氯化铁(FeCl)_3.)倒入1.5 ml的发酵液中。蓝绿色的外观表明混合物中存在酚类物质;另一方面，在6ml 10%醋酸铅中加入4ml发酵液，形成白色沉淀，确认苯酚的存在。

2.2.5。类固醇和三萜酸测试

将1 g发酵后溶解到4 ml氯仿中，用于类固醇和萜类化合物的估算。混合液经过过滤后保存在冰箱中。4毫升醋酸和4-5滴100%硫酸(H₂所以₄）小心地倒入混合物中。粉红色或粉红色环的外观证实了萜类化合物的存在，而类固醇的蓝色或蓝色存在，两种颜色的混合物表明存在萜类化合物和类固醇[22]。

2.2.6款。皂苷测试

为了估计皂苷，将1g发酵加入20ml蒸馏水中，大致摇动。1厘米泡沫层的发展证实了皂苷的存在[23]。

2.2.7。单宁测试

通过加入2ml蒸馏水和2-4滴浓缩铁（FECL）来评估单宁存在的存在（FECL_3.)加入1毫升发酵液。呈现青绿黑色或蓝色，分别显示儿茶酚和没食子单宁的存在[23]。

2.3。定量化学分析

2.3.1。总黄酮含量的测定

以氢氧化钠(NaOH)和三氯化铝(AlCl)为原料，采用氯化铝比色法测定总黄酮含量_3.)。简而言之，将2ml发酵溶液倒入6mL甲醇中，加入10ml蒸馏水，0.2ml 1M乙酸钾（CH_3.和0.4毫升10%氯化铝(AlCl)_3.)放入混合物中。然后将随后的溶液在室温黑暗中孵育30分钟。使用“吸光度酶标仪”(SpectraMax 190，美国设计，中国制造)在420 nm处计算96孔ELISA板的吸光度。以槲皮素为标准溶液(1 mg/ml)，得到一系列浓度分别为0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.25、0.50、1 mg/ml的校准曲线。用线性回归方程(Y=−0.004x+ 0.053;R²= 0.995)。结果表明，槲皮素当量(QE) mg/g发酵。这个实验一式三份[24]。

2.3.2。总酚类含量的测定（TPC）

采用福林- ciocalteu试剂法计算总酚含量。2毫升发酵液加入4毫升2%碳酸钠(Na)中₂有限公司_3.)和5ml 10%的福林- ciocalteu试剂。随后的溶液在室温黑暗中孵育15分钟。然后，为了测定765 nm处的吸光度，将得到的混合物倒入96孔ELISA板中。用没食子酸(1 mg/ml)配制标准曲线。通过一系列没食子酸浓度(0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.25、0.50和1 mg/ml)的标准曲线来测定结果。用线性回归方程(Y=−0.005x+ 0.053;R²= 0.998)。结果以没食子酸当量(GAE) mg/g化合物确定。这个实验一式三份[24]。

2.3.3。测定DPPH自由基清除活性

基于DPPH基团（1,1-二苯基-1-富铬酰基）的清除活性来计算抗氧化活性。将0.5ml发酵溶液加入到新鲜制备的3.5mL DPPH甲醇溶液（0.004g / 100ml）中。将混合物在室温下在黑暗中温育30分钟，倒入96孔ELISA板中，以观察517nm处的吸光度。通过使用以下等式通过减少吸光度来测量DPPH的抑制百分比。吸光度较少表示更自由基清除潜力，反之亦然[25]。 哪里一个_空白吸光度在控制中吗一个_样本为样品的吸光度。

2.4。气相色谱-质谱法(GC-MS)样品的制备

发酵准备气相色谱-质谱，如上文Popova等人在程序中所述[26只做了一些小小的修改。将0.05 g的干发酵溶解于5ml HPLC级甲醇中。200年μ将后续溶液的L与800混合μ取L甲醇，进一步稀释成1ml，倒入1.5 ml离心管中。

2.5。气相色谱-质谱分析

用Agilent 6990 -5973 GC-MS进行发酵分析_N,美国。气相色谱(GC)采用HP1 TG-5MS聚二甲基硅氧烷毛细管柱(30 m×250)μ米×0.25μm)与惠普5973质量选择探测器接口。参数是固定的;初始温度从70℃扩展到220℃，每分钟增加10℃，但入口温度为250℃，分裂比为10:1,MS四倍温150℃，热辅温285℃，MS扫描温度35-520单元，电离能70 eV;氦气作为载气，流速为1.0 ml/min⁻¹。利用文献资料或Wiley/ nist数据库对化合物进行GC-MS质谱解释鉴定。98.1 [27]。每个化合物的比较产率是基于GC的原始数据区域评估的，没有响应因子校正FID(火焰电离检测)。

2.6。统计分析

所有数据均采用Duncan多重极差检验(单因素方差分析)进行统计学分析( )。所有统计分析均使用IBM-SPSS软件(25.0版)进行。

3.结果与讨论

3.1。定性Mycochemical分析

化学筛选试验表明，Snef1216 (p . chrysogenum)(见表1)。由于相似度较高，化合物的估计用最大存在(++)表示;由于反应混合物的颜色没有任何相似或改变，平均或微弱而中等的存在。糖苷的检测是由粉红色的外观决定的。绿色或蓝色表示混合物中存在酚类物质。黄酮类化合物和黄酮类化合物的检测分别通过将反应液的黄变为橙色和无色得到。皂苷的存在是通过在溶液中形成泡沫层来确定的。黑色或绿色的外观证实了儿茶酚单宁的存在。

化学筛选的定性检验结果表明，在样品中糖苷含量适中，而生物碱含量不高p . chrysogenum。此外，酚类和黄酮类化合物的高度存在，而黄酮是适度存在的。发酵的定性化学筛查显示，不存在类固醇和萜类化合物，而记录了皂苷的中等存在和运动单宁。然而，在化学筛选期间没有记录了加仑单宁。营养培养基的化学分析仅显示酚类和黄酮类化合物的适度存在。

抗氧化剂是对引起氧化应激的自由基所造成的损伤具有防御作用的关键物质。真菌化学物或次生代谢物自然存在于真菌中，真菌是天然抗氧化剂的重要来源，具有治疗、保护和防御潜力[28]。这些支化剂可以在多种机制中发挥有用的作用，如将氢过氧化物转化为非自由基、清除氧、与金属离子结合、中和单线态氧或吸收紫外线辐射[29]。由于其抗氧化活性抑制疾病的特征，真菌含有的基本型肌肉化学产品达到了更多的关注。

MyCochemical筛选暴露了化学成分的存在，即糖苷，生物碱，酚，黄酮类，三萜类化合物，黄酮，类固醇，单宁和皂苷。萜类化合物用作抗炎和抗癌剂并含有Leishmanicidal和胰蛋白酶活动[30.]。单宁具有抗菌、抗肿瘤和抗病毒活性[10]。生物碱具有广泛的抗肿瘤、抗高血压、抗抑郁、抗胆碱能、肌松药、抗炎、拟交感神经、止咳、催眠、利尿剂、抗肿瘤、催吐和抗菌等作用[31]。

我们的结果同意Jakovljevićet al。10中含有萜类化合物、生物碱、类黄酮和苯酚p . cyclopium和p . brevicompactum。Mycochemical筛选p . frequentans显示化学成分的存在，如萜类、酚类、皂苷类、单宁、类黄酮和生物碱，而类固醇则不存在[32]。aspergillus.sp, JPY1Phomasp。p . chrysogenum展示了萜烯，单宁，甾醇和黄酮类化合物的存在[4]。本研究表明，Snef1216 (p . chrysogenum)显示出重要的生物活性化学成分。

3.2。定量Mycochemical分析

3.2.1之上。总黄酮含量(TFC)

用槲皮素连续浓度为0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.25、0.50、1 mg/ml，通过标准曲线计算总黄酮含量。其总黄酮含量p . chrysogenum营养培养基在表格中列出2。黄酮类化合物内容物p . chrysogenum营养培养基中槲皮素当量QE/g分别为85.31±1.23和1.43±1.33 mg。营养培养基中黄酮类含量低于发酵菌株Snef1216 (p . chrysogenum)。

类黄酮是真菌的主要次生代谢产物[33,34]。它们是多酚类化合物，因其抗氧化特性和清除自由基的潜力而被人们所认识[35]。它们充当潜在的治疗剂，如抗病毒，抗癫痫，解热，抑制，抗毒性，抗肿瘤，抗菌，抗生素，抗毒性，抗炎，抗炎活性和抗炎症活性和抗氧化剂[36]。Bhardwaj等[32]描述了黄酮类化合物的含量P。frequentans(17.48毫克/克),链格孢属交替(17.41毫克/克),Thielaviopsis basicola(17.41毫克/克)Geotrichium alphida(17.41毫克/克)。营养培养基中黄酮类含量低于发酵菌株Snef1216 (p . chrysogenum)。大多数情况下，抗氧化剂的富集是在发酵过程中发生的，这是因为类黄酮化合物的分解与微生物之间存在联系[37]。另外，发酵促使大型和复杂分子的结构分解，其导致各种抗氧化剂的释放或合成[38,39]。我们的研究表明，Snef1216 (p . chrysogenum是黄酮类化合物的重要来源。

3.2.2。总酚类含量（TPC）

用没食子酸的连续浓度(0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.25、0.50和1 mg/ml)通过标准曲线测定总酚含量。总酚含量p . chrysogenum呈现营养培养基（表2)分别为135.77±1.14和3.68±0.96 mg没食子酸当量GAE/g。然而，与发酵菌株Snef1216 (p . chrysogenum)。在发酵过程中，生物活性化合物可通过次生代谢途径产生，或由微生物产生的酶从底物中释放出来[40]。

从真菌中提取的酚类化合物通过阻止氢过氧化物转化为非自由基或使脂类自由基失活显示出抗氧化特性[41]。本研究发现，Snef1216 (p . chrysogenum)。相比之下，营养培养基表现出极少的酚类含量。然而，我们的结果与Jakovljević等人相矛盾。(6世卫组织报告说p . chrysogenum总酚含量(2.859 mg·GAE/g)低于p . fumiculosum(2.109 mg·GAE / g)。总酚含量p . chrysogenum15.45 mg·GAE/g [42]。在本研究期间，在发酵中记录了较高量的酚醛含量p . chrysogenum。类似地，早期的研究人员观察到发酵可以有效地提高任何被测材料的酚含量[43- - - - - -45]。基本上，这些总酚含量的增强是由于微生物参与发酵[46,47]。Snef1216 (p . chrysogenum)可作为酚类化合物的重要来源，有助于生产天然抗氧化剂的较好选择。

3.2.3。DPPH(1,1-二苯基-1苦基肼)自由基清除活性

DDPH(1,1-二苯-1-苦基肼)是一种稳定的自由基，在517 nm处显色吸收。这些自由基可以被不同类型的抗氧化分子清除，因为这些自由基可以很容易地释放出它们的氢分子，从而使DPPH(1,1-二苯-1-苦基酰肼)的溶液颜色变成浅黄色，引起吸光度下降。DPPH自由基被广泛用于自由基清除活性的评价。表格2为发酵菌株Snef1216清除DPPH的活性(p . chrysogenum)和营养培养基。Snef1216的DPPH抑制率(%)(p . chrysogenum）被记录为63.86±0.82。此外，营养培养基没有显示无DPPH激进的清除活性。

DPPH清道夫作用研究结果显示，DPPH对小鼠的抑制率为51.34%p . fumiculosum37.42％p . chrysogenum(6，而在本研究中，Snef1216的DPPH抑制率(%)(p . chrysogenum)为63.859±0.823。前期研究报道发酵可显著增强DPPH自由基清除能力[48]。Chomcheon等人[49)表明,黑曲霉在发酵过程中表现出显著的抗氧化化合物。我们的发现表明Snef1216 (p . chrysogenum)可作为一种天然的抗氧化剂。

3.3。气相色谱-质谱分析

Snef1216中生物活性化合物的存在(p . chrysogenum)通过GC-MS分析筛选。主化合物、峰面积(%)、保留时间(R.T)、分子量g/mol (M.W)的分子式(M.F)见表3.。对Snef1216发酵过程的GC-MS分析结果显示，有10种化合物的存在，占总发酵量的100%。以苯甲酸、2-甲氧基-、甲酯(23.51%)、十六酸、甲酯(18.68%)、十一烷(11.94%)、肉豆蔻酸异丙酯(11.66%)、肟、甲氧基-苯基(9.22%)为主要成分，其他成分含量较低，峰值在3.83-5.78%之间。气相色谱-质谱分析得到的色谱图检测了不同的化合物峰(见图)1)。

这些生物活性化合物负责抗氧化活性。Baert [50报道称苯甲酸、2-甲氧基-、甲酯或邻氨基茴香酸可作为非甾体抗炎药。肟、甲氧基苯基和十六烷酸具有抗氧化和抗菌作用[51,52]。环三硅氧烷、六甲基和肉豆蔻酸异丙酯等化合物具有抗氧化潜力[53,54]。十一烷具有广泛的抗菌活性[55]。苯甲酸甲酯对昆虫有驱蚊作用Bemisia Tabaci.(56]。Chen等人[57也报道了苯甲酸甲酯对害虫、昆虫和螨虫有杀虫作用。保存等[58报道称，1,2-苯二羧酸，丁基酯，可用于关节炎，微生物过敏和癌症的药物发育中，但它也可用作抗氧化剂和抗微生物剂[59]。8-十八烯酸甲酯(E)具有抗氧化和抗菌活性，对哺乳期妇女的血脂也有影响[60,61]。Merlin等。(62]报道，十七烷酸，16-甲基，甲酯具有抗炎、抗菌和抗氧化性能。Snef1216中几乎所有的化合物(p . chrysogenum)从药理学和农业的观点来看是重要的。

4.结论

根据本研究结果，发酵菌株Snef1216 (p . chrysogenum由许多次级代谢物组成的;黄酮类化合物和酚类物质具有清除自由基的活性。它可能是一种有效和安全的天然抗氧化剂来源。真菌化学筛选显示，Snef1216的抗氧化活性有10种生物活性化合物的存在(p . chrysogenum)。本研究为Snef1216 (p . chrysogenum)作为天然抗氧化剂。然而，对于Snef1216在农业和制药工业的商业应用，需要进一步的研究来探索其抗氧化活性的分支化学物的作用。

数据可用性

本稿件中所报告的支持当前发现的所有数据均在稿件内，不作为任何补充文件附加。

的利益冲突

作者没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了国家公益性农业科研专项基金(201503114)和中国农业科学研究体系(CARS-04-PS13)的资助。

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