初步研究甘草甙、去氧五味子素和Tanshinone II作为潜在Anti-Neurodegenerative疾病代理:测定的反相液相色谱在天网布药

文摘

天网布药(TWBXP)是一种中国古代经典的处方。甘草甙、去氧五味子素和tanshinone II TWBXP三种生物活性成分,已被证明是与神经退行性疾病的治疗效果密切相关。他们在TWBXP内容非常低。在这项研究中,我们使用二极管阵列检测器(爸爸)执行全波长扫描,以选择一个最合适的检测波长建立高效液相色谱法同时测定的TWBXP这三个组件。各种色谱条件进行调查来验证其适用性。最后,Kromasil C18柱(250×4.6毫米,5μ米)恒温30°C,流动相为0.2%磷酸溶液(洗脱液),和0.1%磷酸acid-acetonitrile解决方案(洗脱液B)。外标法和内标法用于量化。结果表明,两种方法是简单和方便的操作没有特殊的预处理和展览优秀的精度,重复性(RSD < 3.0%),良好的线性(R²> 0.9990),和良好的复苏(回收价值在95%至105%之间)。由于低含量样品的内部标准方法提供了一个准确的结果比外部的标准方法。稳定性结果表明样本成为稳定的室温在24小时内。该方法提供了一个方便、有效的方法对TWBXP的质量控制,它可以帮助在未来关于广告的研究。

1。介绍

天网布药(TWBXP)是一种中国古代经典的处方,记录她盛Mi砰明朝。处方已经代代相传至今用精致的和优秀的疗效在治疗heart-yin不足,心悸、健忘、失眠、多梦,干粪便等(1]。随着TWBXP越来越多的关注和研究,许多研究人员发现,TWBXP拥有等显著影响抗氧化(2,抗衰老的3,4),抗抑郁药(5),和心血管保护作用[6- - - - - -8]。因此,TWBXP已经在中国一个巨大的市场。根据记录,它由16个中药(中药)。

三个生物活性成分在TWBXP,甘草甙、去氧五味子素和tanshinone II,已被证明是与神经退行性疾病的治疗效果密切相关。甘草甙是主要的成分Glycyrrhizae基数已被证明可以显著改善空间学习、认知能力和记忆障碍与阿尔茨海默病大鼠(9]。它拥有不同的药理活性和展出各种积极的生物效应,包括神经保护(10,抗癌11,抗抑郁药(12)的效果。去氧五味子素是一种木脂素类成分五味子对果实,延缓衰老的效果(13[],王亚南活动14]和抗癌作用[15),实验结果证明,它可以显著改善β_1-42全身的短期和空间记忆障碍Y-maze和水迷宫测试(16]。Tanshinone II是一个主要成分Salviae Miltiorrhizae基数等根茎它具有强大的抗氧化活动(17]和神经保护作用[18- - - - - -20.]。它可以提高学习和记忆的认知功能障碍表现出和改善AD大鼠空间记忆障碍。可能的机制是tanshinone II可以改善突触赤字在早期阶段的广告和变弱AD-related蛋白表达(21- - - - - -25]。

由于甘草甙的药理作用、去氧五味子素和tanshinone II,三个生物活性成分的同时测定TWBXP是重要的披露的秘密对神经退行性疾病的疗效。太阳等人决定6木酚素(schisandrin schisandrol B, schisantherin、deoxyschisandrin schisandrin B,和schisandrin C)在TWBXP [26由RPLC)。燕等人确定四个组件(tanshinone II A cryptotanshinone salvianolic酸B,我tanshinone)的TWBXP UPLC-Q-TOF-MS [27]。正如我们所知,到目前为止,还没有人报道的同时测定组件与广告相关治疗。

在这项研究中,我们建立了高效液相色谱法同时测定TWBXP这三个组件。各种色谱条件进行调查来验证其适用性。根据前面的实验中,三个活性成分含量非常低。这三个组件的量化验证了内标法和外标法。该方法提供了一个方便、有效的方法对TWBXP的质量控制,它可以帮助在未来关于广告的研究。

2。实验

2.1。仪器

1100款配备LC-G13安捷伦高效液相色谱法溶剂交付单位,G1313A autosampler, G1315B二极管阵列检测器,LC色谱工作站。Kromasil C18柱(250×4.6毫米,5μm)和安捷伦C18柱(4.6×250毫米,5μ米)。电子秤BT25S模型从缝匠肌。超声波清洁KQ5200E模型从昆山超声仪器有限公司,有限公司数字循环水浴HH-2模型从金坛Ronghua仪器制造有限公司有限公司RE52CS模型旋转蒸发器从上海购买Yarong生化仪器工厂。ZDHW模型加热地幔和101型电动blast-drying烤箱来自北京中兴伟业仪器有限公司,有限公司高速粉碎机是天津Taisite仪器有限公司有限公司

2.2。材料

HPLC-grade乙腈是由Sigma-Aldrich(美国)。分析纯乙醇是由禹王集团(山东)。磷酸是天津恒星化学制剂有限公司甘草甙(纯度> 98%),去氧五味子素(纯度> 98%),tanshinone II(纯度> 98%),小檗碱(纯度> 98%)参考物质购买从中国国家控制药品和生物制品研究所。天网布药是从北京同仁堂集团购买的。

2.3。样品处理

股票的解决方案甘草甙(500μ去氧五味子素(300 g / mL)μg / mL), tanshinone II (500μg / mL)和内部标准(是)小檗碱(1500μg / mL)是由溶解在甲醇合适数量的标准物质。系列混合标准工作溶液的标准曲线被稀释股票解决甘草甙,准备去氧五味子素,和tanshinone II六点浓度水平相应的10,20,50岁,75年,100年和150年μ克/毫升的甘草甙;75年15日,30日,112.5,150年和180年μ去氧五味子素g / mL;和5,25岁,55岁,90年,125年和150年μa g / mL tanshinone二世是飙升到750混合标准工作的解决方案μ克/毫升。所有的标准工作的解决方案都标记为1,2,3,4,5,6,使用前储存在4°C。

TWBXP切成小块,准确地加权(9克),转移到100毫升圆底烧瓶。他们与50毫升甲醇提取,超声波浴为30分钟,甲醇稀释至50毫升。所有样品都是透过一个0.22μ米微孔膜注射器过滤器(沈阳色谱科学仪器有限公司)与750年飙升μg / mL小檗碱在注入到高效液相色谱系统进行分析。

2.4。建立高效液相色谱法测定三种活性成分

1100模型的分析进行了安捷伦高效液相色谱配备LC-G13溶剂交付单位,G1313A autosampler, G1315B二极管阵列检测器,LC色谱工作站。经过优化的检测波长、列类型和洗脱梯度(表1),进行色谱分离使用Kromasil C18柱(250×4.6毫米,5μm)恒温30°C,流动相为0.2%磷酸溶液(洗脱液),和0.1%磷酸acid-acetonitrile解决方案(洗脱液B)。梯度洗脱程序在10分钟B从0%到15%,从0%到30%在30分钟,从0%到75% B在70分钟,维持在75% B - 85分钟,回到0% B在86分钟,在列平衡了14分钟。波长是203海里。注射量是5μL,流量被设定为1毫升/分钟。


色谱的因素	条件	优化的条件	原因

洗脱梯度	(1)清廉分钟,0 - 15% B;10 ~ 30分钟,15 - 30%的B;30 - 70分钟,30 - 75%;70 - 85分钟,75% B;85 - 86分钟,75 - 0% B;86 - 100分钟,0% B;	过程(1)	高峰的决议
	(2)清廉分钟,0 - 15% B;10 ~ 30分钟,15 - 30%的B;30 - 60分钟,30 - 65%;60 - 70分钟,B 65 - 70%;70 - 85分钟,70 - 75% B;85 - 86分钟,75 - 0% B, B 86 - 100分钟,0%

2.5。验证的高效液相色谱方法

2.5.1。外标法

验证的高效液相色谱方法测定甘草甙,去氧五味子素,和tanshinone II在TWBXP,特异性,线性,精度,精度和可重复性的方法进行了研究。一卷5μL每个标准工作溶液混合的(1、2、3、4、5和6)注射操作色谱条件下先前描述。建立了校准曲线的绘制对应的峰面积与浓度。

2.5.2。内标法

5μ每个系列的L标准工作溶液混合(1、2、3、4、5、6)与750年飙升μg / mL小檗碱注射操作色谱条件下先前描述。每个校准曲线的线性度是由策划分析物的峰面积比是对分析物的浓度与加权线性回归。

某些验收范围为线性开发、精密,可重复性和准确性。的钟表和定量限甘草甙、去氧五味子素和tanshinone II基于信噪比估计的标准S / N = 3和10个,分别。线性相关系数的精度和可重复性的局限性,都是计算精度值。

恢复值百分比计算使用以下方程:

2.6。天网布药制剂的稳定性研究

TWBXP溶液储存在室温下的稳定性进行了研究在0、2、4、8、12和24小时。稳定极限集是< 3.0%,相对标准偏差(%)在24小时25°C和40% RH。

2.7。实际样品的测定

八批TWBXP样本准备根据2.3。示例解决方案(5μL)与750年飙升μg / mL小檗碱被注入到高效液相色谱系统;甘草甙的内容,去氧五味子素,tanshinone二世在TWBXP外部标准和内部标准测定方法。

3所示。结果与讨论

3.1。优化的色谱分离

列、紫外线波长和洗脱梯度进行了研究工作中(表1)。考虑甘草甙的吸收特点、去氧五味子素和tanshinone II, 203海里被选为检测波长。优化的列类型和洗脱梯度结果如表所示1。使用优化的条件、线性精度、可重复性和精度进行了测试。混合的代表色谱标准见图1。所有峰基线分离,有一个很好的分辨率(R≥1.5)在色谱条件下。标准甘草甙的保留时间、去氧五味子素和tanshinone II是22.8分钟,68.2分,分别和71.7分钟。

3.2。方法验证

方法的线性评价λ= 203 nm使用混合标准的解决方案。结果包括回归方程,线性范围,总结了回归系数表2和3。


	范围(μg / mL)	斜率(平均数±标准差)^b	拦截(平均数±标准差)^b	R²	LOD^一个(μg / mL)	定量限^一个(μg / mL)

甘草甙	10.00 - -150.00	7.20±0.41	23.14±1.52	0.9994	3	10
去氧五味子素	15.00 - -180.00	9.45±0.11	21.77±0.62	0.9984	5	15
Tanshinone二一个	5.00 - -150.00	6.07±0.06	30.90±1.05	0.999	1.5	4.5

^一个检测极限(LOD) S / N = 3,限制量化(定量限)的S / N = 10。^b提出了数据均值±SD (n= 3)。


	范围(μg / mL)	斜率(平均数±标准差)^一个	拦截(平均数±标准差)^一个	R²

甘草甙	10.00 - -150.00	(1.5±0.1)×10⁻³	(4.8±0.3)×10⁻³	0.9994
去氧五味子素	15.00 - -180.00	(1.9±0.1)×10⁻³	(4.8±0.2)×10⁻³	0.9984
Tanshinone二一个	5.00 - -150.00	(1.2±0.1)×10⁻³	(6.3±0.2)×10⁻³	0.9992

^一个数据表现为平均±标准差(n= 3)。

线性相关系数(R²)是0.99以上,外标法和内标法。精度(表4)和可重复性(表5)进行了测试。在精度实验中,甘草甙的相对标准偏差值,去氧五味子素,和tanshinone II是1.23%,1.88%,和1.43%,分别为(n= 6)。时可重复性,甘草甙的平均浓度,去氧五味子素,和tanshinone II在TWBXP 0.141毫克/克,0.129毫克/克,0.308毫克/克,而相对标准偏差为1.76%,2.00%,和1.95%,分别。


数量	甘草甙			去氧五味子素			Tanshinone二一个
数量	峰面积	平均	相对标准偏差(%)	峰面积	平均	相对标准偏差(%)	峰面积	平均	相对标准偏差(%)

1	300.90	298.57	1.23	659.60	678.33	1.88	270.30	273.37	1.43
2	299.40			684.10			276.90
3	299.30			684.80			268.60
4	291.20			664.70			273.80
5	300.40			688.70			278.80
6	300.20			688.10			271.80


数量	浓度(毫克/克)
数量	甘草甙	去氧五味子素	Tanshinone二一个

1	0.142	0.132	0.309
2	0.145	0.129	0.311
3	0.141	0.126	0.315
4	0.139	0.126	0.310
5	0.14	0.131	0.302
6	0.138	0.127	0.299
平均	0.141	0.129	0.308
相对标准偏差(%)	1.76	2.00	1.95

复苏的研究甘草甙、去氧五味子素和tanshinone二世进行了评估,分析每个分析物的样品。与方程(计算的数据1),总结在表6。经济复苏的甘草甙、去氧五味子素和tanshinone II是99.22%∼102.92%,100.48%∼105.28%,分别和96.27%∼100.03%。RSD值是1.50%。


复合	样本(毫克)	初始金额(μg)	添加量(μg)	发现数量(μg)	恢复(%)	平均回收率(%)	相对标准偏差(%)

甘草甙	15.98	11.37	10.00	21.64	102.39	100.83	1.52
	15.95	11.35		21.47	100.93
	15.92	11.33		21.28	99.22
	15.71	11.18		21.36	99.93
	15.65	11.13		20.00	102.92
	15.42	11.37		21.32	99.58

去氧五味子素	15.98	6.18	5.00	11.42	105.28	103.81	1.66
	15.95	6.17		11.36	104.08
	15.92	6.16		11.34	103.68
	15.71	6.07		11.40	104.88
	15.65	6.05		11.38	104.48
	15.42	5.96		11.18	100.48

Tanshinone二一个	15.98	29.05	25.00	53.50	98.05	97.84	1.50
	15.95	28.99		53.08	96.35
	15.92	28.94		53.06	96.27
	15.71	28.56		53.36	97.47
	15.65	28.45		54.00	100.03
	15.42	28.03		53.71	98.87

3.3。稳定性研究

稳定性试验结果如表所示7;RSD值甘草甙、去氧五味子素和tanshinone II是1.18%,1.34%,和1.88%,分别。结果表明样本变得稳定在24小时内25°C和40% RH。


时间	峰面积
时间	甘草甙	去氧五味子素	Tanshinone二一个

0 h	438.41	349.33	927.68
2 h	445.9	344.85	933.49
4 h	440.9	345.62	945.12
8 h	438.23	337.05	930.59
12小时	441.56	348.9	907.35
24小时	430.28	341.93	898.63
的意思是	439.21	344.61	923.81
相对标准偏差(%)	1.18	1.34	1.88

温度:25°C;RH: 40%。

3.4。样品分析和比较两种方法

8个批次样品的色谱图所示2。甘草甙的山峰,去氧五味子素,tanshinone II是标记为1,2,3。表8显示的内容这三种活性成分:甘草甙,去氧五味子素,和tanshinone II在外部标准法和内标法,分别。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)


数量	内容(毫克/克)
数量	分析方法	甘草甙	去氧五味子素	Tanshinone二一个

17052802	外部标准	0.16±0.01	0.15±0.01	0.49±0.01
17052802	内部标准	0.22±0.01	0.28±0.01	0.67±0.01
17053803	外部标准	0.14±0.02	0.12±0.02	0.42±0.01
17053803	内部标准	0.19±0.02	0.22±0.02	0.58±0.01
17070507	外部标准	0.15±0.01	0.11±0.03	0.47±0.01
17070507	内部标准	0.20±0.01	0.19±0.03	0.64±0.01
17091903	外部标准	0.17±0.02	0.13±0.02	0.41±0.02
17091903	内部标准	0.23±0.02	0.23±0.02	0.55±0.02
17102402	外部标准	0.16±0.01	0.14±0.01	0.45±0.01
17102402	内部标准	0.22±0.01	0.21±0.01	0.53±0.01
17015269	外部标准	0.15±0.01	0.12±0.02	0.40±0.02
17015269	内部标准	0.20±0.01	0.20±0.02	0.56±0.02
17055293	外部标准	0.13±0.01	0.11±0.03	0.38±0.03
17055293	内部标准	0.17±0.01	0.25±0.03	0.50±0.03
18015225	外部标准	0.11±0.01	0.11±0.03	0.36±0.03
18015225	内部标准	0.14±0.01	0.19±0.03	0.61±0.03

通常情况下,使用内标法在生物样品或其他矩阵样本。在这种情况下,我们可以看到,这三种活性成分的内容非常低的TWBXP样本。内容由内标法高于外部标准方法。因此,可以得出结论,当分析物的含量非常低,内部选择标准方法者优先。

4所示。结论

两种方法的同时测定甘草甙的内容,去氧五味子素,tanshinone二世在TWBXP发达HPLC测定和比较。这两种方法提供了以下优点:该方法是简单和方便的操作没有特殊的预处理和展览优秀的精度,重复性(RSD < 3.0%),良好的线性(R²> 0.9990),和良好的复苏(回收价值在95%至105%之间)。然而,当分析物遇到真正的中医与低含量样品的内部标准方法优于外部的标准方法。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

穿上旗袍太阳教授和王教授Sicen欣然承认的学术指导。西安交通大学创新改进项目,在中央大学(没有基础科学研究项目。PY3A012),陕西省的国家自然科学基金(没有。2017 jq8024)也承认。

引用

h·刘和j . h .黄”之间的相似点和不同点Suanzaoren煎煮和天网布丹在治疗缺乏yin-blood失眠、”天津中医药大学学报2018年,37卷,页25 - 27日。视图:谷歌学术搜索
g . t . Gim小时。金姆,j . Kim裴伟伟j . Kim。用力的,工程学系。秋,“天网布药的抗氧化作用中药公式:双盲、随机对照试验,”美国中华医学杂志》上,37卷,不。2、227 - 239年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
r .你们z z元,c . x戴“天网布汤结合休眠的卫生教育介入sub-healthy失眠患者的治疗阴虚火过剩综合症,”中国综合传统和西方医学杂志》上卷,31 p。618年,2011年。视图:谷歌学术搜索
李x m . c .金,j.p.周et al .,“天网布湾的影响的研究模型动物行为学和儿茶酚胺类神经递质含量的大脑,”药理学和中药学的诊所卷28日,7号到9号,2012页。视图:谷歌学术搜索
h·j·李,y高,p . Liu“天网布汤效果或天网布没有桔梗汤对大脑神经递质老鼠的失眠症模型成立,“中国《本草书,34卷,p。217年,2009年。视图:谷歌学术搜索
s . j . Liu和y l .周”Ningxin anshen方,Ciwujia联合tianwangbuxin治疗心血管神经症随机对照研究中,“实用中医内科杂志》上卷29日7 - 8,2015页。视图:谷歌学术搜索
吴w . b . p . Liu, b . et al .,“影响Salviae miltiorrhizae和桔梗在天网布汤的大脑脑膜微循环vascullosa在老鼠,”中国《本草书,32卷,不。22日,第2391页,2007年。视图:谷歌学术搜索
g·j·谢,w . j . Bo, p . p .黄et al .,“天网布丹对贵宾的影响和AVP模型大鼠慢性睡眠剥夺的表情,“中国中国传统医学档案36卷,第325 - 323页,2018年。视图:谷歌学术搜索
S.-L。贾,X.-L。吴,x。李et al .,“神经保护甘草甙对可溶性淀粉样蛋白引起的认知障碍的影响β1-42oligomers注入海马体。”亚洲天然产物研究杂志》上,18卷,不。12日,第1199 - 1186页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
m·f·张,y . c .赵和y沈,“研究adavances神经保护作用的中药及其glycyrrhizae黄酮类化合物,”抗感染药物,10卷,第175 - 170页,2013年。视图:谷歌学术搜索
江f (x, H.-Y。高,工程学系。高,“甘草甙诱导细胞凋亡和自噬在顺铂(DDP)防胃癌细胞体外和异种移植裸鼠体内,”国际肿瘤学杂志,51卷,不。5,1383 - 1394年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
z赵,w·王,郭h . d .周“甘草甙抗抑郁效应从乌拉尔甘草在慢性可变压力诱发抑郁模型大鼠,”大脑研究行为,卷194,不。1,第113 - 108页,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
黄x d j .应y . c . Wang和k .任“D-galactose-induced衰老大鼠抗衰老去氧五味子素的影响”,应用力学和材料卷,423 - 426,373 - 377年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
y l . Lu问:问:胡,l . Chen等人“交互的去氧五味子素和schizandrin B肝吸收转运蛋白OATP1B1 OATP1B3,”Xenobiotica卷,49号2,28,2018页。视图:谷歌学术搜索
张x, y y, y邵et al .,“抑制去氧五味子素对脑胶质瘤细胞的生长的影响及其机制,“吉林大学学报医学版,42卷,第715 - 711页,2016年。视图:谷歌学术搜索
李c, d .胡,n .汉et al .,“去氧五味子素分离五味子属的果实对改善β1-42-induced小鼠记忆障碍。”足底》,卷78,不。12日,第1336 - 1332页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
李·杨黄懿慧贾,j . et al .,“抗氧化tanshinone II和prohibitin心肌细胞,”中国的草药,2卷,第210 - 204页,2010年。视图:谷歌学术搜索
段c .郭y阴,j . et al .,“神经保护作用和潜在机制的钠danshensu [3 - (3 4-dihydroxyphenyl)乳酸根和根茎salviae miltiorrhizae =丹参)对脑缺血和再灌注损伤的老鼠,”植物学期刊,22卷,不。2、283 - 289年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
美国f·g·c . Tenore m . Daglia et al .,“rosmarinic酸的细胞保护作用:从基础研究到临床应用,”当前神经与血管的研究》12卷,第105 - 98页,2014年。视图:谷歌学术搜索
b . j . h .公园,好公园燕et al .,“神经保护通过维护或提高的抗氧化剂和神经营养因子在缺血性沙鼠海马tanshinone对待我,”中国医学杂志卷,127年,第3405 - 3396页,2014年。视图:谷歌学术搜索
j·j·李,f . Wang周et al .,“影响tanshinone II p53的表达,pp53和细胞凋亡与阿尔茨海默病的老鼠,”中南大学学报40卷,第1216 - 1210页,2015年。视图:谷歌学术搜索
y . c . Liu,美国咋et al .,“治疗效果tanshinone二世对intracerebroventricular链脲霉素诱导的小鼠的记忆缺失,“大脑研究卷,1631年,第146 - 137页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
f·李·g·汉,k . Wu”Tanshinone II缓解广告表型在应用和PS1转基因老鼠,”生物医学研究的国际卷,2016篇文章ID 7631801、8页,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
p .江,c·李,z, b .娇,“Tanshinone II降低老年痴呆症的风险,抑制伊诺,MMP-2和NF -κBp65转录和翻译的颞叶鼠阿尔茨海默病模型,”分子医学报告,10卷,不。2、689 - 694年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
刘y阴、黄l . y . et al .,“tanshinone对一氧化氮合酶和乙酰胆碱酯酶的水平在阿尔茨海默病鼠的大脑模型中,“临床医学和调查没有,卷。31日。5,248 - 257年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
x l .太阳、朱问:z和他,”同时测定6个木酚素的天网布RRLC药丸,“中国制药事务,30卷,第1116 - 1112页,2016年。视图:谷歌学术搜索
y, l·施施n . et al .,”同时测定的四个组件由UPLC-Q-TOF-MS tianwangbuxin表,“中国人民解放军医药杂志卷,34 55-57,2018页。视图:谷歌学术搜索

分析方法在化学杂志》上