酚酸、黄酮类化合物的定量分析五角对林。通过同步超声波协助提取响应面方法

文摘

所以一个有效的超声辅助提取方法酚酸、黄酮类化合物的分离五角对林。是由结合均匀设计(UD)加上响应面方法(RSM)和正交设计实验(OD)。一个敏感和选择性高效液相chromatography-electrospray电离串联三重四极质谱(HPLC-ESI-MS / MS)方法应用于量化16活性成分(绿原酸、cryptochlorogenic酸、新绿酸,isochlorogenic酸,isochlorogenic酸B, C isochlorogenic酸,咖啡酸,hyperin,异槲皮苷、槲皮素、campherol,p香豆酸、异鼠李亭、芸香苷、黄芪甙和芹黄素)。优化提取方法对提取溶剂浓度、提取时间,比液体到固体结果的高灵敏度和可行的方法,同时测定多个组件的内容的质量控制和评价五角对林。从不同的起源。也被认为是有用的和有价值的质量控制的进一步研究五角对林。

1。介绍

中药(中药)在制药行业占据了无可比拟的地位由于其广泛的活动,预防和治疗疾病。因为他们的临床应用和药物发现的贡献,中药在世界上已经吸引了广泛的关注(1]。只有一个或非常有限的成分被规定为标志的质量控制草根据权威的中国药典2015。然而,数百名选民可以从一个草中提取,这可能产生各种药理作用多样的生物活性(2]。的亲密与药理作用,中药的质量越来越严格和多个组件在中药应该识别和量化地。

作为一种常用的中药,cuscutae精液、干果五角对林。,is widely distributed in China. This annual parasitic herb is parasitic on the legume, compositae, chenopodiaceae, and other herbs commonly, such as艾lavandulaefolia直流,胡枝子属对堂,和野豌豆属、。它一直被应用在各种临床应用,包括女性不孕,防止堕胎,男性生殖系统疾病,乳糜尿,黄褐斑faciei。(3现代药理研究表明,广泛五角对林。可以减少心肌细胞的凋亡4),展览antifibrotic效应(5),抑制炎症反应(6),提高性能力,防止流产,加强肝脏和肾脏条件(3]。植物化学的化合物的五角对林。集类黄酮、酚酸、挥发油、对苯二酚、木脂素类、脂肪酸、树脂苷、类固醇、多糖、生物碱。因化学成分的比例最高五角对林。,flavonoids and phenolic acids are two kinds of major bioactive compounds isolated from this TCM. A few results of studies suggested that some五角对林。提取物能发挥不同的药理作用,例如,类黄酮、酚酸、酚类化合物作为自由基拾荒者可以负责抗氧化活动(3,7]。

一些质量控制的分析方法五角对林。应用,如HPLC-UV [8- - - - - -10),高效毛细管电泳(HPCE) [11薄层色谱(TLC) [],12]。然而,这些实践方法敏感性很低或者只是申请评估有限种类的类黄酮和多糖等有效成分。由于中药多组分和多目标的特点,很难全面揭示中药的质量仅仅是通过确定几个化合物。因此,有必要建立一个更精确的确定多个化合物的分析方法评估中药的质量。

更有用的信息和最佳实验条件可以通过好的设计和合适的实验模型。最近,均匀设计(UD),证明是一种很有前途的实验设计方法和比正交设计更有效(OD)依靠数值实验,据说用化学计量学领域的科学、制药学、工程和制造(13- - - - - -18]。响应面方法(RSM)可以用来改进和优化复杂的实验过程的收集统计和数学技术(19]。各种参数和他们的相互作用可以有效地评估这些数据分析技术减少了实验组数(20.,21]。均匀设计强调空间填充在实验领域的一致性和最大可能的水平为每一个因素在所有实验设计(22]。UD可以简单地作为标准来获得更好的正交设计。

在这项研究中开发的方法同时确定十六岁的黄酮和酚酸的含量五角对林。使用液相色谱串联mass-mass谱在不同的起源(HPLC-MS / MS)在多反应监测(MRM)收购模式的全面质量控制五角对林。据我们所知,这是第一个方法确定检测和量化十六个活性成分(图S1在补充材料)五角对林。通过提取最佳条件组合UD加上RSM和OD实验。此外,该方法将有可能为评价奠定物质基础和控制中药的质量。

2。实验

2.1。化学药品和试剂

四个参考化合物包括绿原酸、咖啡酸、槲皮素、儿茶素从国家控制研究所购买药品和生物制品。新绿酸,cryptochlorogenic酸,isochlorogenic酸,isochlorogenic酸B, C isochlorogenic酸,p香豆酸、没食子酸、hyperin、异槲皮苷campherol,芸香苷、异鼠李亭,黄芪甙,芹黄素是购买了从成都必须生物。科学。和成都Desite生物技术有限公司(中国成都)。去离子水用于样品准备和缓冲解决方案由Milli-Q净化学术超纯水系统(美国微孔,米尔福德,MA)。乙腈和甲醇从默克公司(德国)购买。甲酸是购自Anaqua化学品供应(ACS)。所有其他化学试剂均为分析纯。

2.2。草本植物

不同批次的五角对林。从各省在中国购买。的真实性五角对林。马物种被林教授(天津中医药大学),和凭证标本都需要在天津中医药大学。的五角对林。使用一个粉碎机粉碎成粉末(Zhongcheng制药机械)和干40°C。然后,粉末通过了50多个网格,准备以下测试。

2.3。制备的标准解决方案和样品

所有标准的解决方案在股票分别溶解在甲醇浓度1 mg·毫升⁻¹。一系列的混合与甲醇在不同稀释浓度的标准解决方案。没食子酸和儿茶素的股票的解决方案也与甲醇溶解并稀释,最后25的浓度µg·毫升⁻¹和1µg·毫升⁻¹,分别。所有的解决方案都是储存在4°C到分析。

粉末样品(0.1 g)添加10μL 25µg·毫升⁻¹儿茶素和1µg·毫升⁻¹45%乙醇-水介质中对没食子酸作为内部标准暂停(10毫升)和提取超声波浴120分钟。然后,样品在14000×g离心10分钟。浮在表面的转移,通过0.22过滤μm膜前注入。1μ注射L的解决方案进行分析。提取方法的原理图如图1。

2.4。质量控制样品的制备

质量控制(QC)样品绿原酸、咖啡酸、槲皮素、新绿酸,cryptochlorogenic酸,isochlorogenic酸,isochlorogenic酸B, C isochlorogenic酸,p香豆酸、hyperin、异槲皮苷、campherol芸香苷、异鼠李亭,黄芪甙,和芹黄素是准备在低,中,和高浓度水平适当溶解在甲醇混合标准解决方案,分别。

2.5。高效液相色谱条件和女士的条件

定性分析的样品进行1200年使用安捷伦高效液相色谱系统(美国安捷伦科技)耦合到一个API 3200三重四极仪(美国安捷伦公司(CA)与电喷雾电离(ESI)源(康科德,安大略省,加拿大)。一个安捷伦Eclipse + C18柱(1.8μ米,4.6毫米×150毫米)配备一名保安安捷伦C18柱(5μ米,2.1毫米×12.5毫米)。发达的流动相法由乙腈水(溶剂)和0.05%甲酸水(溶剂B)。方法采用分段线性梯度如下:15% -19%溶剂在0 - 3分钟,19% - -20%的溶剂在3 - 9分钟,溶剂在9 - 12分钟,20% - -30% 30% -48%溶剂在12 - 12.5分钟,48% -52%溶剂在12.5 -14分钟,溶剂在14 - 17分钟,52% - -54% 54% -60%溶剂在17 - 18.5分钟,然后-81%,溶剂60%至18.5 -20分钟。列被设定为35°C。此外,注入体积和低3μL·分钟和3毫升⁻¹,分别。

质谱仪的操作在负离子模式下与窗帘气体(坏蛋)45 psi,碰撞气体(CAD) 5 psi,离子喷雾−4500 V电压(是),毛细管温度为700°C,离子源气体1 (GS1) 40 psi,和离子源气体2 (GS2) 60 psi。女士使用的仪器是串联模式,通过实验多反应监测(MRM)。串联质谱实验,使第一季度前体离子的选择性分离,随后碰撞细胞分裂,最后选中产品的监测离子在第三季度完成16个分析物的分析和内部标准如表所示1。18个化合物的其他参数包括declustering潜在(DP)、入口潜在(EP),碰撞能量(CE),碰撞细胞退出的可能性(级),居住时间(DT),保留时间(RT)也在表中列出1。

3所示。结果与讨论

3.1。优化的提取过程

3.1.1。采用均匀设计优化提取结合响应面方法

至于有效提取活性物质包括酚酸和类黄酮五角对林。,some parameters which influenced the extraction efficiency were optimized. In this study, ethanol was chosen as the extraction solvent. In order to obtain the optimal extraction condition, the relationship among concentration of extraction solvent (X₁),提取时间(X₂)和液体到固体的比率(X₃)是由均匀设计研究(U12(12×6×6))(表S1在补充材料)。二次多项式逐步回归方法和数据分析了均匀设计3.00版软件。一个模型给出了如下预测响应变量: 在哪里Y是预测因变量;b₀是一个常数,修复反应实验的中心点;b₁,b₂,b₃的回归系数的线性效应方面;b₁b₂,b₁b₃,b₂b₃相互影响条件;和b₁²,b₂²,b₃²分别二次效应方面,(23]。首先,提取黄酮类化合物的选择(Y₁)进行统计分析和预测模型类黄酮(Y₁)如下:

根据方差分析,该模型很好的确定系数(R= 0.95)不显著(F值8.845, )这暗示三个因素(X₁,X₂,X₃)没有影响类黄酮的提取效率。酚酸的提取率明显影响萃取溶剂的浓度( )。增加温度从20到120°C(45%乙醇)、酚酸含量增加了0.106 g·g⁻¹。此外,提高乙醇的浓度从40%提高到45%,酚酸含量增加了0.136 g·g⁻¹。进一步增加乙醇的浓度,酚酸含量减少(图2(一个))。酚酸的提取条件(Y₂)进行统计分析和预测模型建立了酚酸(Y₂)所示如下:

三个修正后的回归方程并消除不重要的项目(F值<F关键值, ),预测模型建立了酚酸(Y₂)修改如下:

的基础上消除结果( ),X₂,( )被淘汰,表明提取时间的影响X₂)和液体到固体的比率(X₃)是不重要的酚酸的提取。最后但不是最少,提取参数的影响总类黄酮和酚酸是由RSM和建立了一个预测模型。总内容的提取效率是影响萃取溶剂的浓度( )。总内容的黄酮和酚酸的含量从0.180克·克不等⁻¹0.420 g·g⁻¹,当温度增加20°C到120°C(45%乙醇)。此外,有上升趋势的总内容黄酮和酚酸的含量从40%乙醇45%乙醇。否则,趋势改变时乙醇的浓度不断下降(图2 (b))。预测模型建立了总类黄酮和酚酸(Y₃)所示如下:

一式四份修改后的回归方程并消除不重要的项目(F值<F关键值, ),预测模型建立了总类黄酮和酚酸(Y₃)修改如下:

项目包括( ),X₂,X₃被淘汰(F值<F关键值, ),显示,提取时间(X₂)和液体到固体的比率(X₃)没有提取过程的重要因素。

合成RSM分析和预测模型,10毫升45%包裹和超声波提取120分钟在室温下被选为最佳提取方法。

3.1.2。通过正交设计优化提取

应用均匀设计后,有效地提取条件的范围缩小,一些复杂的测试应该调查连续通过正交设计为了获得更有效的结果。OD实验被用来进一步优化提取条件是一种有效的设计方法与小实验范围和更少的研究因素和水平。在这OD过程,实验分两个训练集和预测集只集中在某一地区来自UD加上RSM的结果。

首先,OD旨在确认类黄酮的提取效率的各种因素的影响,包括乙醇浓度(35%(一个₁(一),40%₂(一),45%₃)),提取时间(B: 80分钟(B₁),100分钟(B₂),120分钟(B₃)),样品溶剂比(C: 100 g·毫升⁻¹(C₁),120 g·毫升⁻¹(C₂),125 g·毫升⁻¹(C₃),和D空白项。当乙醇浓度,提取时间,样品溶剂比设置为45%,120分钟,125 g·毫升⁻¹最好的萃取效率分别可以获得分析类黄酮(表S2在补充材料)。根据方差分析测试的结果,F值的提取时间超过F关键值,这意味着这个因素在这个提取过程的意义。然而,没有意义,因为他们的其他因素F值在F至关重要的价值。考虑到上述结果和经济,45%,120分钟,100 g·毫升⁻¹被选为乙醇浓度、提取时间和样本中提取黄酮类化合物的溶剂比,分别。然后,进行以下OD调查的影响因素提取酚酸完全。结果显示,酚酸的最佳提取效率可能被收购而乙醇浓度、提取时间、溶剂和样品比设置为45%,120分钟,120 g·毫升⁻¹分别为(表S3在补充材料)。但是,这个OD的方差分析测试表明,样品溶剂的比例在这部分没有意义。因此,最好的酚酸的提取因素被选为45%的乙醇,萃取时间120分钟,120 g·毫升⁻¹样品的溶剂。最后但不是最少,进一步OD应用来验证总酚酸和类黄酮的最佳条件。结果显示,与45%乙醇提取效率最好,萃取时间120分钟,100 g·毫升⁻¹溶剂(表的示例S4在补充材料)。下面的方差分析测试也表明,乙醇浓度和提取时间是重要因素,而样品溶剂的比例是不显著的F价值是在F至关重要的价值。通过综合考虑生产成本和酚酸和类黄酮的提取效率,100 g·毫升⁻¹样品的溶剂,45%的包裹,和超声波提取120分钟在室温下被选为最佳提取方法。这结果显示最好的明显的条件可以得到OD实验特别和最优条件进行OD通过UD是一样的。

3.2。色谱条件的优化

3.2.1之上。高效液相色谱条件的优化

获得良好的分离和稳定的保留值,峰值HPLC-ESI-MS / MS方法进行优化的因素详细分析的活性化合物五角对林。关于16组件分离的因素由酸的类型(甲酸、乙酸和甲酸铵),酸的浓度(0.01%,0.05%,0.1%),列温度(25°C, 35°C, 45°C),和流率(0.3毫升·分钟⁻¹0.4毫升·分钟⁻¹和0.5毫升·分钟⁻¹)。每个因素的影响被研究了正交试验设计L9 (3⁴)。考虑为中心的迁移时间和峰值响应好,hyperoside被选为参考找到最佳高效液相色谱条件,这是一个主要的活性成分五角对林。结果(表S5)表明,乙腈- 0.05%甲酸水溶液一步线性渐变,列温度35°C,和0.5毫升·分钟⁻¹流量应该最后为活性化合物的定性分析。

3.2.2。优化的条件

串联质谱的方法来获得一个定量测定16个活跃的标记和两个内部标准。为了提高检测的灵敏度和提高响应值,优化实验离子源参数包括坏蛋(30 psi, 35 psi, 40 psi, 45 psi),计算机辅助设计(3 psi、5 psi 7 psi 9 psi),是(−−−2500 V, 3000 V, 3500 V,−4000 V,−4500 V), GS1 (25 psi, 30 psi, 35 psi, 40 psi, 45 psi), GS2 (30 psi、40 psi, 50 psi, 60 psi),和TEM (300°C, 400°C, 500°C, 600°C, 700°C)。因此,最佳离子源参数实现当坏蛋45 psi, CAD 5ψ是−4500 V, GS1 40 psi, GS2是60 psi, TEM是700°C。

3.3。选择的内部标准

为了避免错误造成的样本一致性和歧视的影响,内部标准应该添加到分析样品溶液。考虑分析化合物的化学性质和保留时间的交互分析物和内标之间,两种化合物被选为内部标准,涵盖了没食子酸和儿茶素。没食子酸和儿茶素被用作内部标准八类黄酮和八个酚酸,分别,因为他们的化学性质类似于这两种分析物,他们不会影响色谱峰的目标。

3.4。方法验证

3.4.1。特异性

图3显示16个活性成分的色谱五角对林。MRM收购模式。HPLC-MS / MS分析这些标记的结果展示了良好的山峰,和没有干扰峰的迁移时间的样品进行分析分析物或内部标准。

3.4.2。线性、检测的局限性和可重复性

校准曲线由六个浓度水平。通过添加10标定图了μL 25µg·毫升⁻¹儿茶素和1µg·毫升⁻¹没食子酸作为内标。16绘制校准曲线和相关系数(r> 0.999)证实,曲线的线性浓度范围的每个组件。检测的极限(LOD)和量化的限制(定量限)被认为是化合物的浓度产生的信噪比(S / N)比3和10个,分别。每个组件的钟表和定量限的范围从0.001 ng·毫升⁻¹14 ng·毫升⁻¹和0.005 ng·毫升⁻¹34.9 ng·毫升⁻¹分别为(表S6)。重复性的评价是准备相同的样本相同的优化提取方法(n= 6)。16个目标的可重复性标准偏差不超过2.9%。

3.4.3。精密度和准确度

精密度和准确度都得到评估质量控制样品包含16个活性成分在低,中,高浓度对校准图准备每一天(n= 6)。盘中和interday精度和准确度的结果见表S7。16个活跃组件的精度对盘中和interday 87.8% - -120.7%的范围内。盘中和interday的rsd为13.9%以下。这些结果表明,本方法准确、可靠,重现性好。

3.4.4。稳定

十六个活性成分的稳定性在环境温度是评估通过分析质量控制样品在低,中,高浓度48 h存储在4°C。稳定性研究的数据表S7表明,rsd为十六个活性成分的稳定性是低于15.4%,当他们决定在0 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 12 h, 24 h,分别和48 h。结果表明,所有的组件都在48 h的存储稳定性好浓度的研究和分析方法可以用来确定这些化合物。

3.4.5。复苏

恢复被确定为目的的评估提取方法的精密度和准确度。十六岁的提取复苏组件提取后进行评估五角对林。等量的标准解决方案,包括绿原酸,cryptochlorogenic酸,新绿酸,isochlorogenic酸,isochlorogenic酸B, C isochlorogenic酸,咖啡酸,hyperin,异槲皮苷、槲皮素、campherol,p香豆酸、异鼠李亭、芸香苷、黄芪甙和芹黄素(n= 6)。十六岁的平均恢复活性成分确定的范围-112.7%,rsd为89.9%低于11.4%(表S6)。结果表明,提取方法显示良好的精密度和准确度。

3.5。方法应用

所以证明超声辅助提取方法加上HPLC-MS / MS方法应用于量化十六31批次的活性成分五角对林。从不同的起源。定量分析的数据表明总酚酸和类黄酮含量五角对林。从不同的来源如表所示之间存在着显著的差异2和3。总酚酸含量五角对林。从重庆省相对高于别人,从云南是最低的。的总黄酮含量最高五角对林。这些从河南省确定的样本,从Zhangshu评估最低。

4所示。结论

在这项研究中,一个光提取条件进行高收益率的多个活动组成,结合均匀设计加上RSM和正交设计实验。HPLC-MS / MS过程提出了同时确定16个活性成分存在于不同批次的五角对林。有效的提取方法。开发方法已经成功地应用于分析酚酸和类黄酮的内容使用儿茶酸和没食子酸作为内部标准。结果表明,该方法提供了良好的选择性和灵敏度。同时,使用HPLC-MS /女士量化酚酸和类黄酮,可以成功申请的质量控制五角对林。在不同的起源。酚酸或黄酮类化合物的内容五角对林。来自中国的南部普遍高于那些来自中国的北部。因此,提出HPLC-MS / MS方法可以考虑未来的研究评价中药的质量控制。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

李劲和Kun-ze Du同样这项研究。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81374050)和特殊项目的人才发展优秀青年学者在天津。

补充材料

辅料包含修改文章的实验设计优化提取的分析物五角对林。分析方法和验证结果。表S1:均匀设计(U₁₂(12×6×6))优化提取酚酸和类黄酮五角对林。表S2:正交设计的结果(L₉(3⁴)优化的提取的黄酮类化合物五角对林。表S3:正交设计的结果(L₉(3⁴)优化酚酸的提取五角对林。表S4:正交设计的结果(L₉(3⁴)优化提取的黄酮和酚酸的含量五角对林。表S5:正交设计的结果(L₉(3⁴)基于hyperoside高效液相色谱条件的优化五角对林。表S6:校准曲线,线性范围,钟表16个化合物的定量限,复苏在样本(n= 6)。表S7:盘中,interday准确度和精密度和稳定性的16个化合物(n= 6)。图S1: 16个化合物的化学结构和两个内部标准。(补充材料)

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