准备一个特定ssDNA Brevetoxin-2使用SELEX适体gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

现有的检测化验brevetoxin (BTX)依赖于昂贵的设备与专业的运营商或抗体有限的稳定,需要复杂的过程,一个高成本,大量的时间。另一种检测探针的发展是另一个有前景的研究方向。本文报道寡核苷酸适配子的使用绑定在一个分析BTX-2化验使用由指数富集配体的系统进化(SELEX)。选择12个回合后,25日序列的二级结构预测。与其他寡核苷酸适配子相比,Bap5有相对较高的亲和力最低的离解常数为4.83gydF4y2BaμgydF4y2BaM,集成电路gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba73.81 ng毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。一个好的线性回归公式gydF4y2Ba系数的相关性gydF4y2Ba使用biotin-avidin ELISA = 0.9798了。此外,没有交叉反应的检测海洋毒素,除了BTX-2。因此,Bap5潜在检测BTX-2贝类在未来代替识别调查。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

赤潮已经盛开更频繁地由于海洋污染的增加,其次是相当数量的有害藻类的萌芽gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)从海洋生物毒素和代谢产品的生产,包括diarrhetic贝类毒素(DSP)麻痹性贝类毒素(PSP),神经性贝毒(NSP),和遗忘的贝类毒素(ASP) (gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。Brevetoxins,著名的典型NSP毒素,最初是位于细胞gydF4y2BaKarenia短gydF4y2Ba,但环境中的毒素日益广泛使用后,细胞溶解或死亡(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。毒素通过食物链转移和积累在贝类、鱼、和其他物种。的持久性有毒物质在海水、沉积物和海草附生植物导致慢性或持续的暴露,会伤害海洋哺乳动物和其他水生无脊椎动物的健康,甚至造成大量鱼类死亡(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。NSP毒素激活电压特异性钠离子通道,导致人类和动物的健康问题。当人类或动物消化污染滤食动物或吞下的海水在开花gydF4y2BaKarenia短gydF4y2Ba,他们将体验规划的特征症状,如感觉异常(刺痛),逆转变化多端的温度感觉,肌痛(肌肉疼痛)、眩晕、共济失调(协调的损失),腹痛、恶心、腹泻、头痛、心动过缓(心率缓慢),瞳孔放大,呼吸窘迫gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

NSP毒素基于各自的结构,包括至少有13个不同的组件和更复杂的结构,包括brevetoxin (BTX-A)和brevetoxin B (BTX-B) [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。BTX-B的主要组成部分,gydF4y2BaPtychodiscusgydF4y2Babrevetoxin-2 (BTX-2),是最常见的神经性贝毒,吸引了更多的关注,因为在佛罗里达赤潮事件,导致广泛的鱼类死亡(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。BTX-2是一种脂溶性聚醚化合物(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。老鼠的最小致死量是0.25毫克公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba},LDgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba(致命剂量50%)是200毫克公斤gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。因此,许多研究人员继续探索敏感和方便的方法检测有毒物质。目前,现有的检测方法包括固相萃取(SPE)定性分析(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba),高效液相色谱法(HPLC) [gydF4y2Ba13gydF4y2Ba),液相色谱-光谱法(质)gydF4y2Ba14gydF4y2Ba],未及[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba),electrochemiluminescence-based免疫测定(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba),薄层色谱法(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba),和免疫学方法,如酶联免疫吸附试验(ELISA),利用量化BTX-2抗体水平(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。这些化验的缺点是昂贵的设备,需要专业人员,抗体与有限的稳定的高成本和所需的特殊储存条件免疫测定。因此,另一个探测器的发展迅速的检测方法,成本效益,敏感地监测BTX贝类和海水是一个紧迫的需要。gydF4y2Ba

寡核苷酸适配子最近,寡核苷酸单链DNA (ssDNA)或RNA等(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba),吸引了越来越多的关注作为传感元素在生物传感器用于检测多种类型的分子,如蛋白质、金属、多肽和小分子(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。寡核苷酸适配子都有抗体的优点以及更高的特异性和亲和力的独特优势为目标,可以合成,化学改性,容易储存,变性,用gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。寡核苷酸适配子通常是通过体外获得过程被称为指数富集配体的系统进化(SELEX),于1990年首次报道(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。从那时起,很多文章所描述的使用SELEX选择寡核苷酸适配子针对许多类型的物质,特别是寡核苷酸适配子目标和近年来检测毒素,如蛤蚌毒素(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba),冈田酸(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba],赭曲霉毒素A [gydF4y2Ba27gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba),最近的报告2015年BTX-2 [gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba]。基于这些优点,寡核苷酸适配子正在成为小说在生物传感器应用程序捕获代理和识别受体。在这项研究中,我们报告的发展,DNA寡核苷酸适配子能够绑定BTX-2离解常数为4.83gydF4y2BaμgydF4y2Ba米,一个集成电路gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba73.81 ng mL的价值gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}BTX只和选择性。结果提出了研究报告一本小说,替代分析探针的发展规划的毒素免疫测定。这些结果将有助于建立一个实验协议相对简单,便宜,和敏感的实验室检测方法BTX的贝类产品和海水。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。仪器和试剂gydF4y2Ba

BTX-2和贝类毒素(STX)标准(纯度≥98%)从ZEN-U购买生物技术有限公司(大湾、中国)。冈田酸(OA)和软骨藻酸(DA)标准从亚历克西斯购买®生化药剂。单克隆抗体对BTX-2准备在我们的实验室(gydF4y2Ba值是gydF4y2Ba米gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})和存储在−80°C (gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)从北京购买Dingguo生物技术发展中心(中国,北京)。目标BTX-2-BSA和BTX-2-OVA配合准备使用先前描述的方法(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。DNA交配,Taq DNA聚合酶,PMD-18T和DL2000标记从豆类购买生物技术有限公司有限公司(中国大连)。streptavidin-peroxidase复杂购买从北京生物合成生物技术有限公司有限公司(中国,北京)。无菌超纯水得到从Milli-Q净水系统(美国微孔)。所有的聚合酶链反应(PCR)进行9600年GeneAmp PCR系统(美国优秀的应用)。标准96 - ELISA板(U-bottom)购买从配角(美国纽约)。吸光度是使用一个时代Microvolume分光光度计系统记录(BioTek仪器,Inc .)、美国)。在这项研究中使用的其他试剂均为分析纯。gydF4y2Ba

2.2。ssDNA库和引物合成gydF4y2Ba

最初ssDNA库用于SELEX和相应的引物合成的上海Sangon生物工程技术服务有限公司(上海,中国)。序列包含在ssDNA图书馆85个核苷酸长度,中部地区的40随机核苷酸两侧是两个引物结合PCR、克隆网站,如下:5′-GAGGCAGCACTTCACACGATCTG-N40-CTGCGTAATGACTGTAGTGATG-3′。引物1 (5′-GAGGCAGCACTTCACACGATCTG-3′)和引物2 (5′-CATCACTACAGTCATTACGCAG-3′)被用于放大和克隆。biotin-modified引物(5′-biotin-GAGGCAGCACTTCACACGAT-3′)也用于合成绑定化验。所有的寡核苷酸溶解在TE缓冲(30毫米Tris-Cl, 1毫米EDTA, pH值8.0)和存储−20°C到进一步使用。gydF4y2Ba

2.3。准备目标配合gydF4y2Ba

目标BTX-2-BSA和BTX-2-OVA配合准备使用先前描述的方法(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。基本过程描述如下。琥珀酸酐可溶性的10倍摩尔过剩2.5毫升无水吡啶加入2毫克的水晶BTX-2。在65°C 6 h孵化后,溶剂蒸发受到一连串的氮和残渣是反应的10倍摩尔过剩tributylamine和异丁基chlorocarbonate 1/10稀释在干燥peroxide-free二恶英在室温下为30分钟。然后,载体蛋白BSA和卵子(半抗原和载体的摩尔比率:50:1)被添加在室温下培养30分钟;这些载体蛋白用于SELEX的目标(BTX-2-BSA)和检测抗原(BTX-2-OVA),分别。复杂的恢复了丙酮沉淀,resuspended 0.5毫升蒸馏水,filter-sterilized (0.22gydF4y2BaμgydF4y2Ba米),分发到无菌管,冷冻一夜之间,并存储在−20°C到使用。gydF4y2Ba

2.4。选择适体gydF4y2Ba

典型的SELEX序列的过程是一个迭代的过程,具体选择绑定到目标高度多样化的合成核酸库在几轮。SELEX所示方案的原则gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。在选择过程中,BTX-2-BSA预镀microwell板被用来屏幕的特定寡核苷酸适配子毒素BTX-2绑定到目标。随机ssDNA池与目标,孵化,然后,分离序列被放大产生丰富二级ssDNA池下一轮筛选。经过多轮的筛查、ssDNA序列具有高亲和力为目标。gydF4y2Ba

每次选择后,一般ssDNA图书馆使用以下两种类型的PCR:放大生产dsDNA对称PCR方法和不对称PCR方法ssDNA做准备。随机ssDNA图书馆和放大ssDNA池获得在每一轮的选择溶解在TE缓冲然后稀释SHCMK绑定缓冲(20毫米玫瑰,120毫米氯化钠,氯化钾5毫米,1毫米氯化钙、氯化镁和1毫米)。在第一轮,12gydF4y2BaμgydF4y2BaL (ssDNA(100海里)添加到800gydF4y2BaμgydF4y2BaL SHCMK绑定缓冲,其次是变性在96°C和冷却离心10分钟10分钟以防止错误折叠的冰ssDNA之前绑定到毒素。预处理ssDNA库(100gydF4y2BaμgydF4y2BaL /)添加到8井的微量滴定板,1gydF4y2BaμgydF4y2Ba克毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}BTX-2-BSA固定化(100gydF4y2BaμgydF4y2BaL /)。混合物是孵化5 h在37°C在黑暗中。然后,液体倾析,microwell板与SHCMK洗了三次洗涤缓冲(包含0.05% Tween-20 SHCMK绑定缓冲,220gydF4y2BaμgydF4y2BaL /) 1分钟柔和震动分离从绑定序列的序列。自由ssDNA丢弃,所需的ssDNA仍然绑定到固定化毒素轭合物。洗脱缓冲(20毫米Tris-HCl、硫氰酸胍4毫米和1毫米DL-dithiothreitol, pH值8.3)添加到井(100gydF4y2BaμgydF4y2BaL /在80°C)和孵化20分钟洗提ssDNA。苯酚、氯仿和异戊醇(25:24:1)被用来净化ssDNA。ssDNA是通过添加无水酒精沉淀,预冷−20°C,然后离心法,享年12000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba获得针对BTX-2-BSA ssDNA 5分钟。最后,沉淀ssDNA是溶解在20gydF4y2BaμgydF4y2BaL (TE缓冲和存储−20°C到下一轮。二级ssDNA图书馆准备使用不对称PCR方法。百分之八urea-polyacrylamide凝胶电泳和银染色法用于识别ssDNA;银染色后采用电泳由于其高灵敏度与溴化乙锭(EB)或考马斯亮蓝染色。gydF4y2Ba

2.5。ssDNA的放大和净化gydF4y2Ba

筛选了和集中ssDNA使用对称算法和非对称PCR分子被放大。对称PCR反应的目的是获得双链DNA作为不对称PCR模板。对称PCR反应系统包含20gydF4y2BaμgydF4y2Ba上游引物,20gydF4y2BaμgydF4y2Ba下游引物,10毫米核苷酸混合物,5gydF4y2BaμgydF4y2BaL 10 x PCR缓冲(100毫米Tris-HCl pH值8.3,500毫米氯化钾,MgCl和15毫米gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba),2.5 ng ssDNA模板,使用BioTek仪器检测到的浓度在接下来的屏幕上,1.25 U(聚合酶,无菌蒸馏水总量的50gydF4y2BaμgydF4y2Bal不对称PCR反应是一样的对称PCR反应,除了上游和下游引物的比率增加100倍。PCR循环条件由最初的变性在96°C 2分钟;25 96°C的周期30年代,64°C 30年代,30年代和72°C;在72°C和最后一个扩展5分钟。ssDNA是放大的不对称PCR使用相同的条件,但59的退火温度为20°C周期。5′-biotin-labeled产品不对称PCR用于每一轮的关联分析。dsDNA经轮与最好的亲和力是用于克隆纯化后的指令Poly-Gel DNA提取工具包(ω)gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.6。克隆和测序分析gydF4y2Ba

纯化和高度集中的寡核苷酸最好一轮选择克隆成pMD18-T向量和转化为能力gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaDH5gydF4y2BaαgydF4y2Ba细胞。积极的殖民地被PCR验证。完成测序的样品是由上海Sangon生物技术。克隆和测序后,自由能最低的形状和二级结构预测和序列分析中使用自由能最小化算法DNAMAN和Mfold项目。gydF4y2Ba

2.7。识别的特异性和亲和力gydF4y2Ba

间接ELISA进行每一轮后选择测试适配子的过程选择和评估选择的寡核苷酸适配子的亲和力。为此,100年gydF4y2BaμgydF4y2BaL的0.5gydF4y2BaμgydF4y2Ba克毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}BTX-2-OVA(1、0.5和0.25gydF4y2BaμgydF4y2Ba克毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}BTX-2-OVA涂层来确定gydF4y2Ba值)与涂料稀释缓冲(0.05碳酸钠,pH值9.6)表面的固定化microwells和孵化一夜之间在4°C。盘子被SHCMK清洁解决方案(220年的三倍gydF4y2BaμgydF4y2BaL /)孵化100紧随其后gydF4y2BaμgydF4y2BaL 5%的蒸发脱脂牛奶在37°C 2 h。增加浓度(0-20海里)的5′-biotin-labeled适配子(100gydF4y2BaμgydF4y2BaL /)被添加到洗板和孵化37°C 1 h。后另一个洗涤步骤与SHCMK清洁解决方案,100年gydF4y2BaμgydF4y2BaL(稀释辣根peroxidase-conjugated链霉亲和素(1:1000)在PBS含有0.1% BSA是添加到每个和孵化1 h在37°C。在100年四个温柔的洗gydF4y2BaμgydF4y2BaL整除的gydF4y2BaogydF4y2Ba苯二胺/小时gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba解决方案0.05 citrate-phosphate缓冲区(pH值5.0)被添加到每个。反应是停止的50gydF4y2BaμgydF4y2Ba2毫米的L HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba解决每一个都很好,在室温下10分钟孵化。光密度测量在492 nm (ODgydF4y2Ba_{492年gydF4y2Ba}在一个时代Microvolume分光光度计系统。的gydF4y2Ba值的计算方程gydF4y2Ba。在这个方程,gydF4y2Ba是盘子的集中度涂上两种不同浓度的BTX-2-OVA一组(美联社′)和(美联社)浓度(摩尔LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})的适体对应的最大吸光度值的50%板涂有BTX-2-OVA的两个不同的浓度。平均值是亲和常数。可用的海洋生物毒素BTX STX, OA, DA测试使用相同的亲和力大测量方法评估适体的特异性。gydF4y2Ba

2.8。竞争性抑制活性gydF4y2Ba

间接竞争ELISA进行确定所选的适配子的抑制活性Bap5。BTX-2-OVA共轭稀释了0.05碳酸氢盐缓冲(pH值9.6),添加到微量滴定板在浓度为0.5gydF4y2BaμgydF4y2Ba克毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}一夜之间,在4°C的环境。盘子被SHCMK清洁解决方案(220年的三倍gydF4y2BaμgydF4y2BaL /)孵化100紧随其后gydF4y2BaμgydF4y2BaL 5%的蒸发脱脂牛奶在37°C 2 h。3洗后,等于卷(50gydF4y2BaμgydF4y2BaL /) BTX-2标准的解决方案(200、100、50,25岁,6.25,3.125,和0 ng毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})在10毫米PBS稀释(pH值7.4)混合5 nM biotin-labeled ssDNA稀释在SHCMK绑定缓冲在每个在37°C和孵化1 h。后续步骤中描述的相同的方式进行的识别特异性和亲和力。获得的校准曲线,抑制百分比gydF4y2Ba在gydF4y2Ba设在和日志BTX-2浓度gydF4y2Ba设在。gydF4y2Ba是ODgydF4y2Ba_{492年gydF4y2Ba}价值发现的毒素标准不存在样本(控制),和gydF4y2Ba是ODgydF4y2Ba_{492年gydF4y2Ba}值观察到当有不同浓度的标准样品检测。gydF4y2Ba

3所示。结果与讨论gydF4y2Ba

3.1。选择适体gydF4y2Ba

寡核苷酸适配子与BTX-2获得使用SELEX方法体外。的特异性和数量ssDNA和dsDNA显著影响PCR反应体系和thermocycler条件。PCR条件获得高容量和特定ssDNA进行优化。温度梯度PCR被选为优化方法,以避免非特异性扩增。使用这种方法,64°C和25的生产周期的最佳设置dsDNA有足够的高纯度的内容(数据没有显示)。生成高纯度ssDNA获得寡核苷酸适配子是一个关键因素与高亲和力和选择性。在这项研究中,不对称PCR用于生成ssDNA 1: 10比底漆和反向引物。然后,2%的琼脂糖凝胶电泳被用来识别放大dsDNA(图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba),而8% urea-polyacrylamide凝胶电泳被用来分析ssDNA(图gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba)。如数据所示gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba,目标乐队表示正确的dsDNA和ssDNA产品,没有二聚体和非特异性DNA。高度特定ssDNA为后续屏幕提供一个优秀的二级库。gydF4y2Ba

counterselection过程执行后每4轮的选择使用固定化BTX-2-OVA作为替代共轭提高适配子的选择性和特异性。消极的选择步骤可以删除序列,结合BSA和盘子或分子可能是非。选择12个回合后,间接生物素ELISA是用来识别绑定选择寡核苷酸适配子的能力。如图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,吸光度值记录在492 nm逐渐在第一轮从0.108增加到0.537,4,1.256 0.907在9轮,轮12。因此,适体之间的结合能力和BTX-2增加。因此,特定的适配子库逐渐丰富。相比之下,在第五和第九轮获得的吸光度值略有下降。因此,非特异性寡核苷酸适配子目标BSA,盘子,和其他材料在负选择已经被删除。然而,在第21轮吸光度增加,达到最大值,然后稳定下来。因此,绑定到高原,亲和力达到饱和度和丰富高亲和力寡核苷酸适配子占大多数的ssDNA图书馆。选择后,我们放大的dsDNA第12轮使用上述对称PCR过程和纯化的DNA使用AxyPrep DNA凝胶萃取设备。纯化和高度集中寡核苷酸被克隆到pMD18-T向量和转化为能力gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaDH5gydF4y2BaαgydF4y2Ba细胞,其插入经PCR和测序前后续实验。gydF4y2Ba

3.2。二级结构预测gydF4y2Ba

克隆和测序后,25日序列的二级结构进一步使用DNAMAN和Mfold项目预测和分析。大多数的基因序列的长度是一样的在预期的图书馆。两个重复序列是富含鸟嘌呤,其他序列达到超过70%的身份。基于这个结果,ssDNA图书馆丰富12轮SELEX之后。一般来说,寡核苷酸折叠成各种二级结构,如茎环结构,基因,发夹,口袋里,甚至G-quadruplexes,作为绑定图案或该地区负责生物活性。最可能的最低能量二级结构的选择与Mfold寡核苷酸适配子进行了分析程序来预测结构或绑定到目标的适体毒素(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。在这项研究中,大部分获得寡核苷酸适配子的二级结构是典型的茎环结构(a)和hairpin-loop (b)结构;图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba寡核苷酸适配子的显示了一些。二级结构的分析清楚地表明,使用随机循环结构形成的寡核苷酸适配子区域,和G-rich序列可能G-quartet结构形式。我们预测结构的寡核苷酸适配子可能发挥特别重要角色绑定到目标和预测目标绑定网站。gydF4y2Ba

字母(a)和(b)茎环结构和hairpin-loop表示,这是可能的地区的适体结合BTX-2毒素。gydF4y2Ba

3.3。亲和力和特异性gydF4y2Ba

间接生物素ELISA进行使用BTX-2-OVA浓度从0.25 1gydF4y2BaμgydF4y2Ba克毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}随着涂层物质的离解常数和特异性评估候选人寡核苷酸适配子BTX-2的绑定。此外,适配子浓度被稀释梯度从0.625 nM 20海里。的gydF4y2Ba值的计算方程gydF4y2Ba。的曲线Bap5适配子图所示gydF4y2Ba4(一)gydF4y2Ba。的gydF4y2Ba值之间的绑定Bap5适体和BTX-2为4.83gydF4y2BaμgydF4y2Ba为软面包卷8 M,而值,软面包卷23日Bap 36, Bap 38 9.80gydF4y2BaμgydF4y2Ba7.25米,gydF4y2BaμgydF4y2Ba10.47米,gydF4y2BaμgydF4y2Ba10.55米,gydF4y2BaμgydF4y2BaM,分别。在五个选择寡核苷酸适配子,Bap5最低gydF4y2Ba价值和BTX-2高亲和力,类似于以前的报告(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。的gydF4y2Ba值Bap 8, Bap 23日Bap 36, Bap 38相对较高,因此认为绑定能力薄弱,从进一步的实验被丢弃。大是评估使用可用的海洋毒素哒,STX, OA在相同条件下进一步研究BTX-2 Bap 5适体的特异性。如图gydF4y2Ba4 (b)gydF4y2Ba软面包卷5有压倒性的积极回应BTX-2较弱对其他毒素的反应。因为其他BTXs并不可用,这些毒素必须化验的大未来的研究。gydF4y2Ba

3.4。竞争性抑制活性gydF4y2Ba

间接竞争ELISA基于Bap5适配子进行化验适配子的抑制活性。一个好的线性回归公式,gydF4y2Ba系数的相关性gydF4y2Ba= 0.9798(图获得了gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。标准曲线线性范围的3.125 ng -200毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}与集成电路gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba(半最大抑制浓度BTX-2)值73.81 ng毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}和3.125 ng mL的检出限gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba},这是大于NSP酶联免疫试剂盒的灵敏度(Abraxis,美国,产品没有。PN520026)和价值在我们之前的研究报告(ICgydF4y2Ba_50gydF4y2Ba5.3 ng毫升gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})使用单克隆抗体gydF4y2Ba32gydF4y2Ba),但低于当前欧盟和食品法典委员会监管限制(800gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/公斤贝类肉)。值得注意的是,使用的寡核苷酸适配子代替抗体有许多特殊的优点,因为寡核苷酸适配子可以合成,化学改性,容易储存,变性,用。因此,我们预计,这项研究将应用的适配子筛选作为另一个识别探针在aptamer-based检测试验评估的BTX水平受污染的海鲜。gydF4y2Ba

4所示。结论gydF4y2Ba

在这项研究中,寡核苷酸适配子目标BTX-2成功获得通过12轮SELEX选择。与其他寡核苷酸适配子相比,Bap5显示相对较高的亲和力低离解常数为4.83gydF4y2BaμgydF4y2BaM和最好的集成电路gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba73.81 ng mL的价值gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}。的Bap5适配子没有显示大与其他海洋毒素检测。基于Bap5的高敏感性和特异性,它可能被用来作为另一种分析探针的发展BTX-2的检测分析。未来的研究应该致力于开发一个试验的基础上,获得适体的检测BTX-2海洋食物样本,以保护消费者的安全,促进水产养殖的发展。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

所有作者没有利益冲突声明。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

Rui-Yun田、林曹国伟和施予于同样贡献了这项工作。石英Lu和红菱任相应的作者。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

这项工作是由中国国家自然科学基金支持下批准号31071539,合作项目从云南生物技术有限公司,有限公司在授予2015220101000658,和中央大学基本科研业务费用专项资金(451160306025)。gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba

1. 柯克帕特里克j . a . Bean l·e·弗莱明b . et al .,”佛罗里达赤潮毒素(brevetoxins)和纵向哮喘病患者的呼吸作用,”gydF4y2Ba有害藻类gydF4y2Ba,10卷,不。6,744 - 748年,2011页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
2. m·弗拉加n . Vilarino m . c . Louzao et al .,“Multidetection的麻痹,腹泻的,失忆的贝类毒素的抑制免疫测定用microsphere-flow血细胞计数系统,”gydF4y2Ba分析化学gydF4y2Ba,卷85,不。16,7794 - 7802年,2013页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
3. s·e·麦克纳米c·t·艾略特·Delahaut和k·坎贝尔,“多元生物毒素表面等离子体共振法海洋生物毒素的藻类和海水样本,”gydF4y2Ba环境科学与污染研究gydF4y2Ba,20卷,不。10日,6794 - 6807年,2013页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
4. m . j .缠绕植物,M.-Y。王b . Dechraoui z h . et al .,“亲脂的提取和分析brevetoxins红潮腰鞭毛虫gydF4y2BaKarenia短gydF4y2Ba”,gydF4y2Ba分析生物化学gydF4y2Ba,卷369,不。1,第135 - 128页,2007。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
5. m·范·德文特k·阿特伍德,g . a . Vargo等。”gydF4y2BaKarenia短gydF4y2Ba赤潮和brevetoxin-contaminated鱼:清除水鸟是佛罗里达的一个高危因素?”gydF4y2Ba神物铺子滨gydF4y2Ba,55卷,不。1,31-37,2012页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
6. j . h .兰茨贝格”,对水生生物有害藻华的影响,“gydF4y2Ba渔业科学评论gydF4y2Ba,10卷,不。2、113 - 390年,2002页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
7. j . h .兰茨贝格l . j . Flewelling, j . Naar”Karenia短赤潮,brevetoxins食物网,和对自然资源的影响:十年进步,”gydF4y2Ba有害藻类gydF4y2Ba,8卷,不。4、598 - 607年,2009页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
8. g·l·希区柯克j . w . Fourqurean j·l·德雷克r·n·米德和c a .嗨”Brevetoxin坚持沉积物和海草东佛罗里达沿海水域的附生植物,”gydF4y2Ba有害藻类gydF4y2Ba13卷,第94 - 89页,2012年。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
9. 通用汽车Hallegraeff、d·m·安德森和公元Cembella,gydF4y2Ba手动对有害海洋微藻gydF4y2Ba,联合国教科文组织,巴黎,法国,25-49,2003页。gydF4y2Ba
10. d·g·巴登,a . j . Bourdelais h . Jacocks s Michelliza和j . Naar”自然和导数brevetoxins:历史背景、多样性、和影响,“gydF4y2Ba环境健康展望gydF4y2Ba,卷113,不。5,621 - 625年,2005页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
11. j . d . Tang唐,苏b, g·陈,“黄金nanoparticles-decorated amine-terminated保利(amidoamine)聚合物为敏感的电化学免疫分析法brevetoxins食物样本,”gydF4y2Ba生物传感器和生物电子学gydF4y2Ba,26卷,不。5,2090 - 2096年,2011页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
12. M.-Y。d . Bottein j . m . Fuquay Munday r . et al .,“生物测定方法检测N-palmitoylbrevetoxin-B2 (BTX-B4)”gydF4y2BaToxicongydF4y2Ba,55卷,不。2 - 3、497 - 506年,2010页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
13. s·m·普拉·e·l·e·杰斯特k . r . El说et al .,“监控的brevetoxins Karenia短bloom-exposed东部牡蛎(Crassostrea virginica),“gydF4y2BaToxicongydF4y2Ba,52卷,不。1,32-38,2008页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
14. z h . Wang和j·s·Ramsdell brevetoxin-B和人血清白蛋白的相互作用分析液相色谱/质谱分析,“gydF4y2Ba化学毒物学研究gydF4y2Ba,24卷,不。1,54 - 64年,2011页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
15. m·a·波里诉r·里维拉d·d·尼尔et al .,”一个electrochemiluminescence-based竞争位移的2型brevetoxins免疫测定牡蛎提取物、”gydF4y2Ba采用AOAC公认的国际期刊gydF4y2Ba,卷90,不。1,第178 - 173页,2007。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
16. m·a·波里、k . s .控制和d·g·巴登”等为PbTx-2-type brevetoxins:抗原决定基两个anti-PbTx血清的特异性,”gydF4y2Ba采用AOAC公认的国际期刊gydF4y2Ba,卷78,不。2、538 - 542年,1995页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
17. s·m·普拉和r·w·迪基”进展的监测和毒性评估brevetoxins软体动物的贝类,”gydF4y2BaToxicongydF4y2Ba卷,56号2、137 - 149年,2010页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
18. s . Marton b . Berzal-Herranz e . Garmendia f . j . Cueto和a . Berzal-Herranz”Anti-HCV RNA寡核苷酸适配子目标基因组cis-acting复制元素,”gydF4y2Ba药品gydF4y2Ba,5卷,不。1,49-60,2012页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
19. y野中郁次郎,k Sode k .池袋,“抗DNA适体筛选和改进,”gydF4y2Ba分子gydF4y2Ba,15卷,不。1,第225 - 215页,2010。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
20. K.-M。歌,s . Lee, c .禁止“寡核苷酸适配子及其生物应用,”gydF4y2Ba传感器gydF4y2Ba,12卷,不。1,第631 - 612页,2012。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
21. d . t . Tran k·f·詹森j . Pollet et al .,“选择和描述DNA寡核苷酸适配子对蛋清溶菌酶,”gydF4y2Ba分子gydF4y2Ba,15卷,不。3、1127 - 1140年,2010页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
22. c . Tuerk和l .黄金”系统的演化由指数富集配体:RNA噬菌体T4 DNA聚合酶配体,“gydF4y2Ba科学gydF4y2Ba,卷249,不。4968年,第510 - 505页,1990年。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
23. 郑x、b .胡s x高et al .,”一个saxitoxin-binding适配子与高亲和力和抑制活动优化通过理性的定点诱变和截断,“gydF4y2BaToxicongydF4y2Ba卷。101年,41-47,2015页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
24. s . m .方便,b . j .牦牛j . a . DeGrasse et al .,“第一次报告的使用saxitoxin-protein共轭开发一个DNA适体小分子毒素,”gydF4y2BaToxicongydF4y2Ba,卷61,不。1,30-37,2013页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
25. c .林Z.-S。刘,D.-X。王et al .,“一代的内部图像功能的寡核苷酸适配子冈田酸通过magnetic-bead SELEX,”gydF4y2Ba海洋药物gydF4y2Ba,13卷,不。12日,第7445 - 7433页,2015年。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
26. s . Eissa Ng, m . Siaj a·c·塔瓦雷斯和m . Zourob”选择和识别DNA寡核苷酸适配子对冈田酸若应用程序中,“gydF4y2Ba分析化学gydF4y2Ba,卷85,不。24日,第11801 - 11794页,2013年。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
27. m . McKeague r .礁泻湖,k·希尔,诉Bardoczy, t . Meszaros和m . c .现在“小说DNA适体的选择和描述label-free荧光若赭曲霉毒素a的”gydF4y2Ba毒素gydF4y2Ba》第六卷,没有。8,2435 - 2452年,2014页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
28. l . Barthelmebs j . Jonca a是b . Prieto-Simon, J.-L。马蒂,“酶联适体化验(ELAAs),基于竞争格式快速和敏感检测赭曲霉毒素a的酒,“gydF4y2Ba食品控制gydF4y2Ba,22卷,不。5,737 - 743年,2011页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
29. j . A . Cruz-Aguado和g·彭纳赭曲霉毒素A测定DNA适体,”gydF4y2Ba农业与食品化学杂志》上gydF4y2Ba卷,56号22日,第10461 - 10456页,2008年。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
30. A . De Girolamo m . McKeague j·d·米勒,m . c .现在和A·维斯孔蒂“赭曲霉毒素A测定小麦通过DNA aptamer-based固相萃取柱净化后,“gydF4y2Ba食品化学gydF4y2Ba,卷127,不。3、1378 - 1384年,2011页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
31. s . Eissa m . Siaj和m . Zourob”brevetoxin-2 Aptamer-based竞争力的电化学生物传感器,”gydF4y2Ba生物传感器和生物电子学gydF4y2Ba卷,69年,第154 - 148页,2015年。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
32. y周,Y.-S。李,F.-G。潘et al .,“发展一个新的基于单克隆抗体的直接竞争酶联免疫吸附试验检测brevetoxins食物样本,”gydF4y2Ba食品化学gydF4y2Ba,卷118,不。2、467 - 471年,2010页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
33. s .龚H.-L。任,R.-Y。田et al .,“小说分析探针结合SELEX N-glycolylneuraminic酸的一个潜在的致癌因素,”gydF4y2Ba生物传感器和生物电子学gydF4y2Ba49卷,第554 - 547页,2013年。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba

版权gydF4y2Ba

版权©2016 Rui-Yun田等。这是一个开放的分布式下文章gydF4y2Ba知识共享归属许可gydF4y2Ba,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。gydF4y2Ba