血管内停留时间测定氰化物解药二甲基三硫化物的老鼠用液液萃取耦合与高效液相色谱法

文摘

这些研究是第一个报道的血管内停留时间决定氰化物解药二甲基三硫化物(儿童)在大鼠模型中通过使用高效液相色谱法结合紫外吸收光谱(HPLC-UV)。新开发的样品制备包括液液萃取环己酮。校准曲线显示线性响应之间的浓度与儿童0.010和0.30毫克/毫升= 0.9994。儿童通过这种提取方法的检测极限为0.010毫克/毫升,和定量的极限为0.034毫克/毫升。因此这个校准曲线提供了一个工具来确定与儿童之间的0.04和0.30毫克/毫升。老鼠给20毫克/公斤与儿童剂量静脉内聚山梨酯80(15%),和血液采集标本15日,60岁,90,120,240分钟后与儿童注射。数据点被绘制为儿童红细胞表面浓度和时间,和血管内停留时间决定图形。结果表明半衰期36分钟在老鼠模型中,这表明循环时间是足够长的时间来提供一个合理的时间间隔为氰化物对抗。

1。介绍

氰化物(CN)的毒性是由末端氧化酶的抑制线粒体呼吸途径。这种代谢抑制将导致细胞进入厌氧代谢,导致乳酸酸中毒(1]。第一个CN中毒的症状之一是深和快速通风造成的刺激颈动脉窦。这是紧随其后的是细胞呼吸的抑制,导致静脉血液中氧含量高(2]。从身体中删除CN的基本机制是其转换到更少的有毒化合物的硫氰酸(SCN)在存在硫供体(3]。这个基本的代谢反应作为基础为发展中硫供体类型CN解毒剂。目前,这两个CN解毒剂在美国Nithiodote™和®羟钴胺素。硫代硫酸盐硫Nithiodote捐赠者的组成部分。亚硝酸钠是其他组件和行为既是高铁血红蛋白前和一氧化氮前。早期的研究集中在亚硝酸钠的高铁血红蛋白形成效果作为清道夫类型解药(4]。最近的研究集中在线粒体内的一氧化氮供体作用作为主要的解毒的机理,亚硝酸钠(5]。羟钴胺素羟钴胺素的活性成分,它可以清除CN形成稳定的维生素b12复杂(6]。

新一代的治疗(7)(如二甲基三硫化物(儿童)8],cobinamide [9],sulfanegen [10)开发利用相同的路径的干预是目前治疗但更有效地这样做。此外,这些对手正在开发的配方为肌内注射(IM),使应急人员更快地放弃治疗。这将是特别有益在偏远地区和涉及多个事件的受害者。

与儿童、有前途的下一代硫供体类型氰化物解药,是最简单的有机三硫化物CN转换成有毒的视交叉上核(越少8,11,12]。它自然发生在大蒜,洋葱,和其他植物的属葱属植物(13]。儿童是自然的一部分,人类的饮食。儿童是由益生菌酸奶和奶酪(14岁),是一个不受欢迎的调味品组成部分过于啤酒(15]。与儿童已被确认为挤压土豆小吃的味道决定因素(16]。儿童从种植白菜吸引飞蛾的幼虫吃卷心菜(17];发酵百慕大草诱发库蚊蚊产卵(18];腐烂的脊椎动物肉吸引腐尸甲虫(19];人类尿液为定位提供了一个潜在的信号受害者被困在倒塌的建筑20.]。

这里我们报告一个样品制备方法的发展,使儿童血液中浓度由使用高效液相色谱法结合紫外吸收光谱(HPLC-UV)。其次,我们报告的血管内停留时间测定儿童(制定以15%聚山梨酯80 (Poly80))在大鼠模型中。

2。实验

2.1。化学品和样品

所有化学品使用纯度最高的商用,被用来作为收到。氯化钠,高效液相色谱级水、环己酮、和肝素钠从j.t购买美国贝克(PA)、高效液相色谱级乙腈是购自EMD化工有限公司(美国新泽西州),和Poly80从阿尔法购买蛇丘(马、美国)。儿童购买从SAFC(圣路易斯,密苏里州)和葡萄糖从西格玛奥德里奇(美国WI)。螺旋盖子瓶(1.5毫升和5毫升),27 G×13毫米和25 G×25毫米针,250年,100年,50µL汉密尔顿Luer-lock注射器和1.7毫升微型离心机管从VWR购买国际(美国佐治亚州Suwanee)和Polyspring插入(100µL)从国家科学(美国Rockwood TN)。50毫克/毫升锁解决方案是由溶解的肝素钠1.25克25毫升的5% w / v葡萄糖水溶液。0.9 w / v水盐溶液是由溶解22.5克氯化钠在25毫升蒸馏水。80毫克/毫升肝素溶液是由溶解的肝素钠2.00克25毫升蒸馏水。儿童发展股票的解决方案(Poly80-DMTS)在50毫克/毫升的浓度是由溶解与儿童15% Poly80水溶液被Kovacs et al。21)和Petrikovics科瓦奇(12]。

2.2。仪器

使用的主要仪器实验瓦里安ProStar高效液相色谱法与紫外检测器(210)(340)。离心机(星系20 r, VWR国际Suwanee,乔治亚州,美国),超声发生器(Symphony™, VWR国际),固定速度微型涡(美国佐治亚州VWR国际、Suwanee), Heidolph多Reax机械振动器(Heidolph仪器,埃尔克格罗夫村,IL),微量吸液管(热科学、沃尔瑟姆,MA),手术解剖工具(卡生物有限公司供应,伯灵顿,NC),和一个老鼠夹(肯特科技公司,托灵顿校区,CT)也用于这些实验。Precellys赖氨酸包有陶瓷珠子平均直径1.4毫米被结合Precellys 24组织均质器(位于马里兰州Rockville贝尔坦公司技术)。

2.3。动物

雄性老鼠(250 - 300 g,查尔斯河育种实验室、罗利数控)与颈静脉导管植入被安置在室温下光控制的房间里(22±2°C, 12小时光/暗周期)。配备有水和Teklad啮齿动物饮食的老鼠(W) 8604 (Teklad HSD, WI)随意。老鼠依照护理指南和使用实验动物和美国认证协会的评估和认证(AAALAC)国际实验动物保健。这些实验机构批准的动物保健和使用委员会(IACUC)山姆休斯顿州立大学(IACUC许可:15-09-14-1015-3-01)。

2.4。研究中使用高效液相色谱条件

非极性硅基高效液相色谱柱与Phenomenex Luna保税辛烷组成的固定相使用单位(平均孔隙大小为100,平均粒径的5µ米,250×4.60毫米)和列维度。流动相是一个40:60 (V / V)的混合水和乙腈。流动相的流速是1毫升/分钟和列压力100 - 105酒吧。注入体积的样品是25µl .紫外检测器监测215纳米波长的吸光度。峰值区域由Chromeleon 7软件自动计算。

2.5。飙升鼠血液Poly80制定与儿童和分区研究

整除的儿童原液稀释适当数量的15% (m / m) Poly80收益率标准解决方案拥有儿童浓度的0.12,0.36,0.60,0.84,1.08,2.40和3.60毫克/毫升。一个100µL整除的第一个标准的解决方案是添加到1100年µL完整的大鼠血液在肝素化微型离心机管,并大力涡30分钟。这个过程被重复每个连续的标准获得七个血液样本飙升,分别与儿童在浓度为0.01,0.03,0.05,0.07,0.09,0.20和0.30毫克/毫升。这个范围被选中后管理与血药浓度最高预期剂量的静脉(停留时间测定)与儿童。每个样本,与儿童发展混合后,离心机(4°C, 13500 rpm) 10分钟。等离子体部分使用微量吸液管小心地删除。沉积物部分含有红细胞(红血球)是用在4°C 10分钟和漩涡,持续30秒。儿童发展的浓度测定血浆和红细胞表面由环己酮萃取后分区研究。校准曲线的上升与环己酮提取血液样本。相同的样品制备应用飙升血样和DMTS-treated老鼠的血液样本。

2.6。儿童发展政府老鼠

在血管内停留时间研究中,20毫克/公斤与儿童剂量应用静脉注射的计算体积Poly80-formulated儿童解决方案(Poly80 50毫克儿童/ 15%)。使用下列公式确定注入体积的测试解决方案在大鼠模型中,在那里是老鼠的重量以克为单位;硫供体(儿童)的单位剂量毫克的硫供体老鼠的每公斤(儿童);浓度的硫供体(儿童)在单位制定药物溶液毫克每毫升的儿童制定的解决方案:

2.7。从导管植入大鼠采血

注射器、针头和收集管消毒和冲洗体积小的肝素。老鼠被放置在老鼠夹。导管的插头是用镊子小心地删除。锁的解决方案是使用肝素化注射器抽出,直到血出现在导管。所需数量的血液被收集和转移到一个新的肝素化微型离心机管。在收集血液,同样体积的生理盐水注射到老鼠100紧随其后µL溶液注入体积的锁。血液储存在4°C到使用。

2.8。从大鼠的血液样本的提取和分析儿童发展

注射后儿童的解决方案(50毫克/毫升15% Poly80解决方案)的导管植入老鼠,约1300人µL的血液样本被使用肝素化注射器,转移到肝素化微型离心机管在不同的预先确定的时间间隔和保存在冰/冰箱直到使用。为分析,1200年µL的血液从每个样本被转移到一家肝素化微型离心机管和离心机(4°C, 13500 rpm) 10分钟。等离子体部分小心地删除使用微量吸液管和丢弃。细胞部分用了10分钟,400年µL与400年样本中提取的µL环己酮的新微型离心机管。促进儿童发展的分区,提取混合物涡30秒,动摇了对轨道机5分钟(2045 rpm, 3毫米轨道)。确保良好的分离有机和水层,提取混合物是离心机(4°C, 13500 rpm) 10分钟。大约40μL(上环己酮层转移到一个包含Polyspring插入螺钉帽高效液相色谱瓶。一个25μL整除来自这瓶是由高效液相色谱分析如前所述。

2.9。确定血管内停留时间

停留时间的决心,Poly80制定与儿童解决方案(50毫克/毫升15% Poly80)注入导管植入老鼠的剂量20毫克/毫升。血液样本(大约1200年µL)是0,15岁,60岁,90,120,240分钟后,儿童发展注入和分析如前所述。三只老鼠被用于这项研究。表1显示了注入量为每个采样时间和老鼠。血样来自老鼠在15 # 1,240分钟,从老鼠# 2 0到60分钟,并在90年和120年从老鼠# 3分钟,后注入。

3所示。结果与讨论

3.1。血液的分区与儿童

在现代药物研发,药物浓度化验有几乎完全使用等离子体作为矩阵而不是全血。这背后有各种理论方法包括测定灵敏度,基质干扰,蛋白结合,自由毒品运动。另一方面,总是有一些争论分区的疏水性的分子,可以吸收,和集中在红细胞表面(22- - - - - -24]。因此,确定的矩阵方法,分区与儿童的血液进行了研究。图1清楚地揭示了红细胞表面的吸收能力与儿童大约6.3倍等离子体。因此,在本研究我们使用红细胞表面作为矩阵提高灵敏度。

3.2。分析血液样本

计划1总结了新开发的液液萃取的方法确定儿童静脉注射后大鼠血液样本Poly80制定与儿童的剂量20毫克/公斤。确定了高效液相色谱峰的色谱与儿童在环己酮注入高效液相色谱柱。使用前面介绍的高效液相色谱参数,与儿童显示保留时间为9.5分钟。

在方法开发环己酮有机溶剂的选择,从水溶液中提取与儿童(15% Poly80)显示良好的分区(分区系数= 3.7)有机和水之间的阶段。图2显示分区之间的儿童15% Poly80为水相,环己酮作为有机相。

相同的样品制备方法被用于校准曲线和老鼠的血液样本。尽管好分区与环己酮,在血液样本提取效率相对较低,但可再生的。该提取方法提供了一个有效的工具,用于确定在老鼠样品浓度与儿童静脉半衰期Poly80-DMTS管理评估。

3.3。大鼠血液中校准曲线分析与儿童

血液样本上升与儿童产生浓度为0.01,0.03,0.05,0.07,0.09,0.20,和0.30毫克/毫升提取如上所述和分析通过高效液相色谱法与紫外检测。这种数据的校准曲线准备图所示3。最低的点图中省略了因为它是低于定量限制。

信号标准偏差从校准行是2330年发现。在此基础上的检测极限与儿童通过这种方法估计为0.010毫克/毫升,儿童发展和定量的极限是0.034毫克/毫升。因此,校准曲线提供了一种机制来确定与儿童之间的0.04和0.30毫克/毫升。校准曲线的方程获得了从血液中提取的环己酮(= 0.9994)。

3.4。确定血管内停留时间

的停留时间测定Poly80制定与儿童(50毫克/毫升15% Poly80)剂量的静脉注入大鼠20毫克/毫升,以固定时间间隔和血液采集标本和分析如前所述。三只老鼠被用于这项研究。表1显示了注入量为每个采样时间和老鼠。血样来自老鼠在15 # 1,240分钟后注入,从老鼠# 2 0到60分钟后注入,并在90年和120年从老鼠# 3分钟后注入。血液样本提取与环己酮和分析HPLC-UV如上所述。

基于这些初步结果,血液中与儿童的半衰期估计36分钟(图4)。这个循环时间允许为一个合理的时间间隔提供保护CN。

4所示。结论

一个新的HPLC-UV吸光度方法确定浓度与儿童的血液了。该方法是基于儿童由环己酮提取。可靠的大鼠血液定量的范围是0.04 - -0.30毫克/毫升。这包括预期的儿童血液中浓度范围的最大容许剂量决定儿童静脉注射(20毫克/公斤)。这种分析方法用于测定血液中的浓度与儿童静脉注射后Poly80-DMTS 20毫克/公斤和剂量的估算半衰期图形。与儿童血管内停留时间的结果研究表明循环半衰期36分钟在老鼠模型中,这表明儿童发展的循环时间是足够长的时间来为CN对抗提供了一个合理的时间间隔。

相互竞争的利益

没有利益冲突。

确认

本研究支持的抵消项目,国家卫生研究院办公室主任和国家过敏和传染病研究所国际代理协议。y1 - od - 1561 - 01 / A120-B。P2011-01, USAMRICD美国陆军研究办公室的赞助下科学的服务项目合同编号。w911nf - 11 - d - 0001和罗伯特·韦尔奇基金会(x - 001)山姆休斯顿州立大学亨茨维尔TX。作者感谢马拉Shifflet女士的技术支持,马里奥简先生,女士萨利·德·耶稣,贾尼斯女士的话,黎明Fisher女士夫妇Chamari Wijesooriya。

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