同时测定6个活性化合物在鑫Badiranjibuya颗粒,中药,RP-HPLC-UV方法

文摘

在这项研究中,一个敏感、精确和准确HPLC-UV方法的开发和验证,同时确定6个分析物(luteolin-7 -O- - - - - -β-D-glucuronide apigenin-7 -O- - - - - -β-D-glucuronide diosmetin-7 -O- - - - - -β-D-glucuronide acacetin-7 -O- - - - - -β-D-glucuronide tilianin,鑫Badiranjibuya颗粒rosmarinic酸),五个分析物(即。luteolin-7 -O- - - - - -β-D-glucuronide apigenin-7 -O- - - - - -β-D-glucuronide diosmetin-7 -O- - - - - -β-D-glucuronide acacetin-7 -O- - - - - -β-D-glucuronide和rosmarinic酸)确定第一次鑫Badiranjibuya颗粒,在鑫Badiranjibuya tilianin颗粒的内容在其他文献报道,和内容的tilianin工作高于文献报道。11批样品的质量从四个不同的制造商是评估使用该测定方法。6分析物的内容在很大程度上不同的样本中不同的制造商。因此,该测定方法可以提供一个科学依据鑫Badiranjibuya颗粒的质量评价和控制。

1。介绍

鑫Badiranjibuya颗粒isa著名中医正式列入维吾尔医学分册卫生部药品标准的中华人民共和国。在中医临床应用,它已被证明有效的治疗心血管疾病、疲劳失眠、心烦意乱,哮喘,和神经衰弱1]。现代药理学研究表明,颗粒对人体血液中血小板聚集起到显著的抑制作用;拥有心灵的补药,抗病毒、抗利尿和平喘药活动;抑制过氧化物的生成;和提高学习和记忆能力2]。

鑫Badiranjibuya颗粒的水提取物Dracocephalum moldavica L。先前的研究表明,水提取的d . moldavica可以用来治疗心血管疾病、促进血管放松,发挥抗氧化活动(3- - - - - -5]。

d . moldavica拥有关键心脏活动;用作镇静剂和治疗缓解紧张的条件和保护心肌细胞缺氧/复氧损伤[6]。此外,水提取物d . moldavica拥有一个anti-ischemic效果在动物实验中,对抗isoproterenol-induced增加心肌耗氧量,并改善缺氧耐受性(4,7,8]。植物化学的研究d . moldavica透露,它包含许多类型的组件,如类黄酮、常用药用,类固醇,糖类,环烯醚萜苷、多糖(9,10]。最近,我们研究小组广泛的化学研究d . moldavica。黄酮类化合物,包括luteolin-7 -O- - - - - -β-D-glucuronide (LTG), apigenin-7 -O- - - - - -β-D-glucuronide (gg) diosmetin-7 -O- - - - - -β-D-glucuronide (DSG) acacetin-7 -O- - - - - -β-D-glucuronide (ACG), tilianin (TLN)和糖类,比如rosmarinic酸(RA),被确定为主要组成部分d . moldavica(11- - - - - -13]。它们的化学结构如图1。先前的研究表明,总类黄酮提取d . moldavica对心肌I / R损伤具有明显的保护作用(14- - - - - -16]。RA具有许多有趣的生物活性,如抗炎、抗氧化、抗菌、免疫调节、系膜细胞proliferation-inhibitory效应(17- - - - - -20.]。

草药药物含有大量的化合物在复杂的矩阵中,没有一个单一的活性组分负责整体功效。虽然一心Badiranjibuya颗粒的应用近年来一直稳步增长,我们没有发现任何科学报告评估这些颗粒的质量。因此,定量方法评估的质量一致性鑫Badiranjibuya颗粒应该发达。因此,一个新的rp - 6活性成分的同时定量分析方法(LTG, gg, DSG ACG、TLN和RA)是最直接和最重要的方法鑫Badiranjibuya颗粒的质量控制。

2。实验

2.1。试剂和材料

RA的对照品(纯度≥98%)从美国国立购买食品和药物控制(中国,北京)。参考物质LTG和gg(纯度≥98%)从上海购买森林生物技术有限公司(上海,中国)。

参考物质的DSG、ACG TLN分离和纯化在上海医药工业研究所和研究方法和数据发表在生物化学分类学和生态学杂志12]。DSG的纯度,ACG, TLN决心通过高效液相色谱法分析98%以上,纯度和MS和NMR数据如附件所示。

乙腈和甲酸(高效液相色谱级)从费舍尔科学购买产品(公平的草坪,新泽西,美国)。去离子水制备微孔水净化系统(美国微孔,米尔福德,MA),然后透过0.45μ米微孔膜。分析纯甲醇(天津化工、中国天津)是用于样品制备。

11批鑫Badiranjibuya颗粒样本从四个不同的制造商在中国购买。这些制造商是新疆维吾尔医药有限公司。(A),芜湖绿叶制药有限公司有限公司(B),山西东台市药业有限公司有限公司(C),和武汉健民药业集团股份有限公司(D)限制。1 - 3从制造商生产样品,样品4 - 7从制造商生产B, 8和9从制造商C生产样品,和样品10和11 D生产厂商。

2.2。仪器

液相色谱分析用日本岛津公司系统,由LC-20AT泵和社民党20紫外可见检测器连接到日本岛津公司自旋Chrome软件。

2.3。液相色谱条件

量化的LTG, gg, DSG ACG, TLN,风湿性关节炎,默克Purospher星C₁₈列(250毫米×4.6毫米,5μ米)被用来分离6个活性化合物。洗脱实现在35°C的多重线性梯度(水0.5%甲酸)和B(乙腈)在下列情况下:0 30分钟,权力平等主义的18% (v / v) B;30 - 60分钟,线性梯度18% - -30% (v / v) B;和60 - 70分钟,权力平等主义的30% (v / v)流量为1.0毫升/分钟。紫外光谱被记录在190年和370海里,和选择的波长330 nm录音。注射体积是10μl

2.4。示例解决方案准备

鑫Badiranjibuya颗粒样品的提取条件进行了优化:鑫Badiranjibuya颗粒样品被磨成粉末,然后通过60-mesh筛。粉样品(3.0克)重准确提取,然后通过一个超声波浴(40 kHz, 250 W)使用甲醇-水(70:30,v / v) 30分钟在室温下,和比样本/萃取剂是3/100 (g / mL)。

2.5。准备和校准曲线的标准解决方案

股票的解决方案的六个参考物质被溶解单独准备3.98毫克的LTG, 2.91毫克的gg, DSG 3.84毫克,5.85毫克的ACG TLN 9.88毫克和3.48毫克的RA在25毫升的甲醇-水(70:30,v / v)。一定数量的个人参考物质这六个参考物质准确称重,存储在相同的10毫升容量的玻璃瓶,加上甲醇-水(70:30,v / v)稀释与一系列浓度的混合参考解决方案。标准解决方案LTG(3.184, 7.96, 15.92, 23.88, 27.064,和31.84μg / mL), gg(1.165, 3.495, 5.825, 11.65, 23.3,和34.95μg / mL), DSG(2.784, 6.96, 13.92, 16.704, 22.272,和27.84μg / mL)、ACG(2.34, 7.02, 11.70, 23.40, 46.80,和70.20μg / mL), TLN(7.9, 11.85, 19.75, 27.65, 31.60,和39.50μg / mL)和RA(2.184, 6.552, 10.92, 15.228, 17.472,和21.84μg / mL)准备和分析。校准曲线是由策划每个分析物的峰面积与浓度。检测的局限性(LOD)和量化(定量限)为每个分析物测定系列稀释标准溶液直到信噪比(年代/N分别)比率是3和10。

2.6。方法验证

线性的方法验证的参数,LOD和定量限,精度、准确性、稳定性和重复性根据国际协调会议(我)21]。

与现有的色谱条件下,内部和interday化验确定发达的精度分析。盘中精度,样本中提取和分析六1 d内复制。interday精度,样本中提取,在连续六天重复检查。精度是表达的相对标准偏差(rsd)。

准确性与恢复测试评估。恢复被用来评估方法的精度由已知数量的激增六个分析物的解决方案和一定量(1.5 g, 60网)的样本在三个浓度水平(低,中,高)和三个平行分析每一层。这些混合物使用上述方法提取和分析。准确性是评价通过计算平均6个分析物的复苏。经济复苏测量根据以下公式: 结果是估计的相对标准偏差。

样品溶液的稳定性在室温下进行了测试。使用上述方法提取的样本,分析了样品溶液使用既定的方法(0,2,4,6,8,10,12 h。记录6个分析物的峰面积,峰值区域的rsd为在不同的时间计算。可重复性,独立从相同的批次样品溶液制备和分析六个平行分析。

3所示。结果和讨论

3.1。液相色谱条件的优化

成功分离出6个分析物,各种分析列进行了测试,不同的流动相组成变化来实现良好的形状和高峰峰值响应。首先,常用的反相柱,Shim-pack ODS C₁₈列,和默克Purospher星C₁₈列具有相同的列长度、直径和颗粒大小(250毫米×4.6毫米,5μ米)使用相同的流动相比较程序。列的温度是35°C。(水的流动相组成与0.5%甲酸)和B(乙腈),和不同的分离系统如表所示1。洗脱程序如下:0 30分钟、权力平等主义的13% (v / v) B;30-55 min,线性梯度13% - -22% (v / v) B;55 - 70分钟,线性梯度22% - -40% (v / v)流量为1.0毫升/分钟,和注射量是10μl .这些分析物被监控在330海里。化合物1、3和5不能完全分离Shim-pack ODS C₁₈列(图2(A))。结果表明,六种分析物的分离在默克Purospher明星LP C似乎更好₁₈列比Shim-pack ODS C₁₈列。然而,分离效率的化合物1和5的山峰上不是很理想默克Purospher明星LP C₁₈列(图2(B))。因此,默克Purospher明星LP C₁₈列被选中程序进一步优化流动相的比例。当洗脱程序如下:0 30分钟,权力平等主义的18% (v / v) B;30 - 60分钟,线性梯度18% - -30% (v / v) B;和60 - 70分钟,权力平等主义的30% (v / v),结果表明,六种分析物的分离性能进一步改善(图2(C))。典型的样品溶液色谱图中描述2。

3.2。萃取条件的优化

超声波浴中药材提取是一个样本提取系统,操作时间短的优点,提取效率高、溶剂消耗少,和良好的重复性。不同的超声波浴6分析物的提取条件进行了优化使用单变量方法的甲醇浓度(30%,50%,70%,和100%甲醇水溶液),比样品/萃取溶剂(3/50、3/100和3/150 g / mL),和提取时间(10年,20年,30和40分钟),和不同的超声波清洗器提取条件如表所示2。个人在不同条件下的实验进行了一式三份。6的内容分析物计算评估提取效率,结果如图所示3。对甲醇浓度、最高的六个内容分析物可以获得70%甲醇水溶液。提取时间,六个分析物的内容明显高于30和40分钟比在10到20分钟。比样品/萃取溶剂,没有发现显著差异为3/100和3/150 (g / mL)。为了确保更短的时间成本的分析,最终的条件进行了优化。粉颗粒(3.0克)重准确,并通过超声波浴样本提取(40 kHz, 250 W)用70%甲醇水溶液在室温下30分钟,和比样本/萃取剂是3/100 (g / mL)。

工作标准和样本分析解决方案最终获得通过0.45后过滤μm膜滤器,10μL是注入高效液相色谱分析。所有的解决方案在4°C存储在冰箱里。

3.3。方法验证

的色谱条件,建立校正曲线的结果,钟表和定量限表进行了总结3。在这六个标准化合物显示良好的线性浓度范围宽基于相关系数()。6分析物的钟表在0.1165到-0.3800之间μg / mL,定量限的六个分析物在0.3599到-1.1508之间μ克/毫升。只有在鑫Badiranjibuya TLN颗粒的内容在其他文献报道[22),它的LOD和定量限高于我们的建立方法。所以,这些值表明分析方法十分敏感。精密的结果如表所示4。内部的标准偏差,interday 6分析物的变化小于1.56%和1.75%,分别表明发达这些分析物的方法精确测定。重复性和稳定性的结果如表所示5。可重复性,独立从相同的批次样品溶液制备和分析六个平行测量(RSD < 1.80%)。示例解决方案被发现是稳定的。这些峰地区的rsd为< 1.87%。总结了6个分析物表的复苏6。六个分析物的整体复苏是98.43% -101.09%,RSD < 1.81%,这表明这个新成立的方法是高度精确测定的6个分析物。

这些数据表明,建立的方法精确、准确、敏感的同时定量测定六鑫Badiranjibuya颗粒分析物。

3.4。6分析物的量化鑫Badiranjibuya颗粒通过高效液相色谱法

新建立的定量方法应用于评估质量的11批样品从四个不同的制造商。典型的高效液相色谱色谱鑫Badiranjibuya颗粒样品如图3,总结了六种分析物的内容表7。如图3,6个分析物鑫Badiranjibuya颗粒的主要组件。所有六个分析物在11批样品的检测分析四种不同的制造商。表7还说明了显著差异的内容单一组件的六个化合物在商业样品从四个不同的制造商。6个化合物产生的内容在中国新疆维吾尔药业有限公司,有限公司,高于别人。因此,新建立的定量方法可以用相似的色谱条件下确定多个鑫Badiranjibuya颗粒的主要组成内容。

4所示。结论

中药的化学成分是复杂的。同时测定各种活性成分是必要的,以确保药品的质量,提高药品质量控制标准。

类黄酮和糖类的主要活性成分是中国传统维吾尔药鑫Badiranjibuya颗粒。在这项研究中,一个敏感、精确和准确HPLC-UV方法的开发和验证,同时确定六个分析物(5类黄酮和糖类)鑫Badiranjibuya颗粒。11批样品的质量从四个不同的制造商是评估使用该测定方法(图4)。6分析物的内容主要是不同的来自不同制造商的样本中,五个分析物(即。luteolin-7 -O- - - - - -β-D-glucuronide apigenin-7 -O- - - - - -β-D-glucuronide diosmetin-7 -O- - - - - -β-D-glucuronide acacetin-7 -O- - - - - -β-D-glucuronide和rosmarinic酸)确定第一次鑫Badiranjibuya颗粒,tilianin鑫Badiranjibuya颗粒是报道的内容在其他文学,和内容的tilianin工作高于文献报道[22]。因此,该测定方法可以提供一个科学依据鑫Badiranjibuya颗粒的质量评价和控制。

附录

参见图5。

核磁共振数据Tilianin, Diosmetin-7-O -β-D-glucuronide, Acacetin-7-O -β-D-glucuronide。Tilianin (TLN) [23)被孤立为无定形的淡黄色的粉末。它的分子式电喷雾质谱是由在哪里445年。

核磁共振(DMSO -,400 MHz):12.86 (1 H,年代噢,5),8.04 (2 H,d,J= 8.8赫兹,,),7.12 (2 H,d,J= 8.8赫兹,,),6.90 (1 H,年代H-3), 6.83 (1 H,年代H-8), 6.44 (1 H,年代6),5.05 (1 H,d,J= 7.6,),3.86 (3 H,年代哟,₃)。

(,150 MHz):164.0 (c - 2), 104.0(颈),182.1 (c - 4), 161.2 (c - 5), 99.8(其他),163.2(即),95.1 (8),157.1 (C-9), 105.3 (C-10), 122.9 (),128.6 (),114.8 (),162.6114.8 (),128.6 (),100.2 (),73.3 (),77.3 (),69.8 (),76.6 (),60.8 (),55.7(哟₃)。

Diosmetin-7 -O- - - - - -β-D-glucuronide (DSG) [24)被孤立为无定形的黄色粉末。它的分子式电喷雾质谱是由在哪里475年。

(,400 MHz):12.89 (1 H,年代噢,5),7.53 (1 H,d,J= 8.4赫兹,),7.46 (1 H,年代,),7.08 (1 H,d,J= 8.4赫兹,),6.79 (1 H,年代H-8), 6.77 (1 H,年代H-8), 6.43 (1 H,年代6),5.12 (1 H,d,J= 6.8,),5.14 (1 H,年代,),3.86 (3 H,年代哟,₃)。

(,150 MHz):164.3 (c - 2), 104.0(颈),182.1 (c - 4), 161.4 (c - 5), 99.9(其他),163.2(即),95.0 (8),157.2 (C-9), 105.7 (C-10), 123.1 (),113.4 (),147.2 (),151.6 (),112.5 (),119.0 (),99.9 (),73.2 (),74.7 (),72.0 (),76.5 (),172.6 (),56.0(哟₃)。

Acacetin-7 -O- - - - - -β-D-glucuronide (ACG) [25)被孤立为无定形的淡黄色的粉末。它的分子式电喷雾质谱是由在哪里459年。

(,400 MHz):12.86 (1 H,年代噢,5),8.03 (2 H,d,J= 8.0赫兹,,),7.12 (2 H,d,J= 8.0赫兹,,),6.89 (1 H,年代H-3), 6.84 (1 H,年代H-8), 6.45 (1 H,年代6),5.12 (1 H,brs,),3.87 (3 H,年代哟,₃)。

(,150 MHz):164.0 (c - 2), 103.9(颈),182.1 (c - 4), 161.3 (c - 5), 99.8(其他),163.2(即),95.0 (8),157.1 (C-9), 105.6 (C-10), 122.8 (),128.5 (114.7 (),162.6 (),114.7 (),128.5 (),99.8 (),73.1 (),76.4 (),72.0 (),74.6 (),171.1 (),55.6(哟₃)。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

这项研究是支持由国家重大科技项目“重大药物发现”主题(基础没有。:2012 zx09102201 - 009)。

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