发展中小说Indolocarbazole组蛋白去乙酰酶抑制剂抑制剂对白血病细胞株

文摘

小说indolocarbazole(命名为ZW2-1)拥有HDAC抑制合成和评估活动对人白血病细胞株NB4 HL-60。ZW2-1执行anti-population增长效应浓度的方式(2μ米)通过诱导细胞凋亡和自噬在细胞。HL-60和NB4细胞的化合物还导致分化如图所示增加CD11b, CD14、CD38在中等浓度(4μ在相对较高的浓度(M)。8μ1 M), ZW2-1显著降低细胞内的组蛋白脱乙酰酶水平也被观察到。所有结果表明ZW2-1可能是小说antileukemia铅能同时诱导细胞凋亡,自噬和分化。

1。介绍

白血病是全球最常见的恶性肿瘤之一1]。早期阻断细胞分化和细胞不能分化成功能成熟细胞白血病的主要特征;这导致骨髓白血病细胞的积累并最终leukemization和器官浸润[2,3]。虽然一个基于诱导分化疗法如使用all-transretinoic酸(ATRA)有利的结果(4),它被限制导致进步的阻力和许多副作用5- - - - - -7]。因此,小说antileukemia代理的发展吸引了大量的兴趣(8]。一个潜在的类白血病的治疗药物是组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂9]。

组蛋白去乙酰酶抑制剂(HDAC)是一个家庭的酶中起着至关重要的作用因此,染色质重塑影响转录过程(10]。异常的HDAC活性被发现在多种人类癌症包括白血病(11,12]。作为其抑制癌症临床验证目标,已经被证明是成功的策略发展的新型抗癌药物。HDAC抑制剂(HDACi)调解癌症细胞死亡通过几个途径,能够诱导细胞凋亡、分化、细胞周期阻滞,抑制DNA修复,upregulation或重新激活沉默肿瘤抑制,downregulation生长因子,自噬和控制血管生成的13- - - - - -15]。值得注意的是,HDAC抑制剂在白血病的临床前和临床研究也表明强有力的抗癌作用[16,17]。

吲哚生物碱组成的一组天然产品已经领先抗癌化合物引起了极大关注18,19]。作为一个独特的吲哚类生物碱,indolocarbazoles报道有趣的生物活性的一个数组(20.]。这些化合物的生物形象最重要的是他们潜在的抗肿瘤作用和行动的活动可能是由于不同的机制,包括DNA夹层,抑制DNA拓扑异构酶,抑制蛋白激酶(21]。是尽最大努力生成与改善indolocarbazole衍生品属性治疗癌症的(22]。indolocarbazoles各种生物活性研究,但很少像HDAC抑制剂。

摘要小说antileukemia代理,4 - (5 7-dihydroindolocarbazol-6-yl)苯酚(命名为ZW2-1,图1(一)),拥有潜在的HDAC抑制活动报道。ZW2-1准备通过化学合成方法中描述的支持信息在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/675053。合成的产品是由高效液相色谱纯化纯度为98.9%和分析利用NMR和MS,和数据也提供支持信息。

2。材料和方法

2.1。细胞系,细胞培养

HL-60(人类成髓细胞的白血病细胞线),NB4(人类急性早幼粒细胞白血病细胞株)和HACA T(人类角化细胞细胞)请提供明教授赵(制药科学学院、首都医科大学、北京,中国)。HL-60和NB4 rpmi - 1640年培养基培养与10%胎牛血清和1% (v / v) penicillin-streptomycin (10000 U /毫升)5%的股份有限公司₂在37°C, HACA T细胞在DMEM培养:F12(1: 1)中有10%胎牛血清和1% (v / v) penicillin-streptomycin (10000 U /毫升)5%的股份有限公司₂在37°C。的细胞毒性化合物ZW2-1是由细胞增殖试验由Promega (CellTiter 96水一个解细胞增殖试验)。

2.2。细胞生存能力分析

细胞被镀在96孔板(一式三份井4×10³细胞/)培养过夜之后,将不同浓度的ZW2-1(0、2、4、8、10和12μ米),并与相同浓度的DMSO作为媒介控制。细胞增殖是监控在48小时使用MTS试验根据指令,和吸光度是读490海里使用SpectraMax M5标(分子设备仪器有限公司、美国)。

2.3。测定细胞凋亡

细胞被播种到6-well板块5×10⁵细胞/。隔夜孵化后,他们接受8μM昏暗的48 h和介质相同浓度的DMSO作为控制。孵化后,细胞被收获,然后双沾膜联蛋白V-FITC /π使用细胞凋亡分析工具包(凯基生物生物技术,中文),并进行流式细胞术分析细胞凋亡的检测。10000细胞/样本分析BD FACSCalibur血细胞计数(BD生物科学)量化凋亡细胞(膜联蛋白V-FITC阳性细胞)。

2.4。线粒体跨膜电位的分析

线粒体破坏细胞凋亡的特点之一是,它的特征是线粒体膜电位的变化。在我们的研究中,线粒体跨膜电化学梯度测量使用JC-1(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。细胞渗透亲脂性的染料,JC-1有能力自由穿过线粒体膜,形成J-aggregates发出荧光红;因此,未经处理的细胞与正常的线粒体膜电位时沾JC-1表现出明显的红色荧光(PE)。凋亡刺激后,合成降低线粒体膜电位阻止JC-1进入线粒体和细胞溶质,仍然是单体发出绿色荧光(FITC)。因此,J-aggregates /单体的比例作为细胞线粒体跨膜电位的有效指标,允许凋亡细胞从nonapoptotic同行很容易被认出来。短暂,HL-60 NB4细胞孵化ZW2-1 48小时,和细胞(1×10⁶/毫升)然后用JC-1孵化(10毫米)30分钟和PBS洗。红色和绿色荧光排放分析流式细胞仪(美国FACSCalibur BD)使用的激发波长488 nm和观察绿色荧光的波长530 nm和585 nm红色荧光。

2.5。评估的表面标记CD38、CD14和CD11b

分化细胞表面标记物的表达是量化使用流式细胞仪。细胞治疗ZW2-1 (4μ米),并与相同浓度的DMSO作为媒介控制。细胞被洗两次冷PBS叠氮化钠为0.09%和1% (v / w)牛血清白蛋白(BSA)和孵化与抗体结合冰与异硫氰酸荧光素(FITC共轭CD11b, FITC共轭CD14、PE共轭CD38;都来自Biolegend, Inc .,圣地亚哥,美国)的比例1:20、30分钟。总共有10000个细胞分析流式细胞仪(美国BD FACSCalibur)和CD11b-positive的频率,CD14-positive, CD38-positive细胞是由使用Flowjo 7.6.1软件。

2.6。TEM观察

检测自噬是否诱导治疗的ZW2-1 HL-60细胞,透射电子显微镜(TEM)应用。与ZW2-1 HL-60细胞培养48 h后(8μ米),细胞与PBS洗然后在1500转离心10分钟。上层清液被移除。细胞颗粒固定在0.1 PBS溶液含有2.5%戊二醛2 h。他们然后用0.1洗PBS,嵌入在2%琼脂糖凝胶,后缀在4%锇酸溶液1 h,用蒸馏水洗净,沾0.5%醋酸双氧铀1 h,在一系列分级脱水乙醇(30%,60%,70%,90%,100%),和嵌入在环氧树脂。树脂聚合在60°C 48 h。超薄部分得到超微切片机是沾水铀酰乙酸酯5%,水2%柠檬酸铅,风干,成像在透射电子显微镜(TEM) (JEOL JEM2100,日本)。

2.7。免疫印迹分析

HL-60细胞被播种到6-well板块5×10⁵细胞/。隔夜孵化后,他们使用8μM ZW2-1 48 h。细胞然后收获,用冰冷的PBS,细胞溶解与冰冷的里帕裂解缓冲(凯基生物生物技术,中文)与1更易与L PMSF。蛋白质浓度的计算是通过BCA化验用品(热费希尔科学、中文)。20μg细胞总蛋白受到12% sds - page和转移到PVDF膜(微孔,亚特兰大,乔治亚州,美国)。膜被封锁的5%的脱脂奶粉在室温1小时,然后用初级抗体进行免疫印迹在4°C一夜之间,其次是HRP-conjugated二级抗体室温1小时。每一步后,膜与PBS-T洗五次为5分钟。最后,这些墨迹开发使用增强化学发光(ECL)系统(皮尔斯化学,34080)。

2.8。HDAC活性测定

组蛋白去乙酰酶抑制剂是一类酶去除赖氨酸残基的乙酰基形成的凝聚和转录沉默染色质。蛋白质中扮演一个重要的角色在细胞增殖和分化的控制。评估ZW2-1是否能够抑制HDAC1 HL-60 NB4细胞,一个比色夹心酶联免疫试剂盒(美国Proteintech)是用于检测和量化内生HDAC1蛋白质的水平。细胞被播种到6-well板块5×10⁵细胞/。隔夜孵化后,他们接受8μM ZW2-1 24、48和72 h。细胞被收获,用冰冷的PBS,细胞溶解与冰冷的里帕与1更易与L PMSF裂解缓冲。蛋白质浓度的计算是通过BCA化验用品(热费希尔科学,北京),和50μ镀g细胞总蛋白的每个样本一式三份。HDAC1活动测量相应的检测设备根据制造商的指示。

3所示。结果

3.1。ZW2-1抑制HL-60细胞增殖

复合ZW2-1抑制白血病细胞增殖是由MTS试验在HL-60 NB4, Haca T细胞。禁忌是如图1 (b),随着浓度曲线表明,ZW2-1块HL-60细胞浓度的方式和NB4细胞增殖。HL-60细胞的异常处理4、8和12μM ZW2-1 48小时分别为86.6%,60.9%,和31.4%,分别是82.6%,54.8%,14.5%,NB4细胞,分别,但分别为95%,98.3%,和84.1%的Haca T细胞,分别。结果表明,相比HL-60 NB4细胞ZW2-1显示无意义的细胞毒性影响Haca T细胞。

3.2。ZW2-1 HL-60细胞发生凋亡

阐明可能机制(s) HL-60抑制癌细胞增殖的细胞,我们已经测试了HL-60 ZW2-1诱导细胞凋亡的影响,流仪结果NB4细胞的膜联蛋白V / FITC和propidium碘(π)吸收。如图2治疗8μM ZW2-1 HL-60 48小时导致凋亡细胞死亡的细胞(49.2%)和NB4细胞(78.3%)。结果表明,细胞毒性ZW2-1 (8μ米,48小时)HL-60 NB4,至少部分,导致细胞凋亡。

3.3。ZW2-1诱发Mitochondria-Mediated HL-60细胞凋亡

线粒体膜电位的损失(MMP)是一种内在的细胞凋亡的标志,因为它是与proapoptotic蛋白质的释放到胞质。评估线粒体膜电位,HL-60 NB4细胞孵化ZW2-1 48小时,然后细胞孵化JC-1和分析这两个红色和绿色荧光排放量流式细胞术。治疗后8μM ZW2-1 48小时,细胞有线粒体膜功能障碍的比例从2.0%上升到55.0%在HL-60 NB4细胞中细胞和从10.7%到62.1%,这表明ZW2-1治疗导致的损失在AML细胞线粒体膜电位(图3)。

3.4。ZW2-1诱发HL-60细胞自噬

为了观察自噬的激活ZW2-1 (8μM, 48小时)治疗HL-60细胞,透射电镜超微结构进行了分析。自噬的超微结构特征如图4。典型的自噬空泡(图4(e)),三个显然更大的自噬空泡,包含部分降解胞质材料(图4(c)),控制细胞(图4(一))进行了比较。ZW2-1诱导自噬进一步验证了评估LC3-I / LC3-II转换。免疫印迹分析表明,LC3-II / LC3-I比率明显升高,表明自噬活动增强了ZW2-1(图4(f))和ZW2-1诱发自噬和凋亡。

3.5。ZW2-1促进HL-60细胞分化

确定由ZW2-1 HL-60和NB4细胞的分化诱导,荧光激活cell-sorting(流式细胞仪)进行了监控三个表面蛋白(CD11b, CD14、CD38),分化HL-60和NB4细胞的特征。

自CD38是渐进分化的最早标志之一,我们调查了CD38表达式后0,6和12人力资源与ZW2-1孵化。流式细胞仪分析显示,ZW2-1治疗显著增加CD38表达式在HL-60(从5.13%到12.5%和44.1%)和NB4细胞(从7.39%到23.2%和34.4%)(图5)。

与ZW2-1 48和72小时孵化后,在HL-60 CD11b和CD14表达增加(从4.6%到8.4%和22%的CD11b,分别地;从1.57%到44.9%和78.7%的CD14、职责);在NB4细胞的情况下,只有CD11b表达显著增加(从4.9%到19.6%和28.6%,分别地),和CD14表达水平没有显著不同的控制细胞相比,表明ZW2-1并不影响CD14表达NB4细胞(图5)。

3.6。ZW2-1政府减少HDAC1 HL-60细胞

确定HDAC1 ZW2-1抑制活动,我们测试了HL-60 HDAC1水平和NB4细胞治疗前后ZW2-1 ELISA(图6)。HL-60 NB4细胞治疗和8μM ZW2-1和HDAC1酶活动测量24后,48和72小时。结果显示,细胞内的浓度HDAC降低了36.9% (),70% ()和90.8% (HL-60细胞)和20.6% (< 0.05)、47.3% ()和68.6% (8)NB4细胞接触后μM ZW2-1 24、48和72小时,分别。

4所示。讨论

组蛋白脱乙酰酶抑制剂(s) (HDACi)表观遗传药物和促进细胞分化的能力,衰老和细胞凋亡。近年来,越来越多的研究人员开始开发的新型小分子具有组蛋白脱乙酰酶抑制活动有力antileukemia代理(23,24]。

在目前的研究中,我们调查了小说的细胞毒性效应indolocarbazole ZW2-1 HL-60 NB4白血病细胞和发现它在细胞自噬和凋亡诱导效应的水平,以阐明ZW2-1-caused细胞死亡的可能机制。

测试细胞暴露于ZW2-1可行性之后,我们应用两种类型的细胞,HL-60和NB4(人类白血病细胞株)和HACA T(人类不朽的角化细胞细胞株)。根据我们的结果,ZW2-1可以有效地阻止HL-60和NB4细胞增殖但显示无意义的细胞毒性影响Haca T细胞在同一浓度。

ZW2-1杀死进程的分析我们发现apoptosis-related机制与各种实验方法。细胞凋亡评估基于膜联蛋白V /πdouble-staining化验显示凋亡细胞的比例显著增加ZW2-1治疗组相比,空白的控制。我们也评估了损失引起的线粒体膜电位ZW2-1使用JC-1染色试验。绿色荧光指数(JC-1单体),被认为是一个非常特定的标记对细胞凋亡显著增加ZW2-1治疗组与控制。

ZW2-1诱导自噬测试使用TEM观察和免疫印迹分析LC3-I / LC3-II转换。典型的自噬小体被认为在ZW2-1治疗组与正常样本相比,和LC3-II / LC3-I比率与ZW2-1孵化后显著升高。结果表明ZW2-1的自噬诱导活性。

对于细胞分化,我们测量细胞表面标记CD11b CD14、CD38的流式细胞仪分析。CD38 -和CD11b-positive细胞的百分比显著增加HL-60和诱导NB4细胞的4μM ZW2-1;然而,在HL-60细胞CD14表达只是诱导。

之前的研究表明,异常表达HDAC1共同出现在包括白血病和肿瘤与增强扩散和自噬缺陷(25]。从显示的数据,似乎ZW2-1 HDAC1抑制活性的关联与诱导细胞凋亡,自噬,细胞分化,细胞生长被捕。因此,ZW2-1可能是一个很有前途的候选人为antileukemia的代理。因此,我们的研究结果可能会提供一个新的科学见解分化诱导,可能表明白血病治疗新策略模型。

利益冲突

作者宣称没有利益存在竞争。

承认

本研究由中国博士后科学基金会(不支持。2014 m552640)。

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