一个有用的策略来评价中药的质量一致性基于液相色谱和化学计量学

文摘

批量一致性评价中药(中药)是至关重要的促进中药的开发和质量控制。本工作的目的是开发一个有用的策略通过液相色谱和化学计量学评价中药制剂的批量一致性。Xin-Ke-Shu (xk)平板电脑被选为这个方法开发一个模型。四种类型的色谱指纹图谱方法比较通过使用基于余弦相似度分析的天使或相关系数。指纹的差异71批次的xk平板电脑被分层聚类分析说明。然后,Mahalanobis距离采用估算概率水平(上面提到的)的差异。此外,t以及应用于发现的色谱峰显著差异。xk平板电脑的最大波长指纹的最大范围和分散程度的相似性与其他三个的。有两个明显的集群的所有批次的样品。显然,我们得出结论:高相似度不完全显示小Mahalanobis距离,而较低的相似性表明更大的距离。最后,一个有用的策略,提出了评价xk批量一致性的平板电脑。

1。介绍

中药(中药),也被称为植物药物或植物学期刊,被用来促进健康和治疗疾病一年多了。不同于合成药物,中药材及其制剂发挥治疗效果的基于多组分参与的协同效应。因为低毒性和有效的治疗性能,中药已经出现在世界范围内的需求的快速增长在过去的几十年里,尤其是在亚洲,欧洲和北美。随着需求的增长,产品质量的要求也在提高。每批中药应该满足一定的产品规格包括生产时间和保质期。然而,中药的质量控制是更加困难比合成药物,因为即使是一个简单的制备包括只有少数草本植物可能由数以百计的大多是独特或种特异的化合物。完整描述所有的化合物在制备的确是一个挑战1),而选择一些化合物的确定疗效或质量不符合中药的原则(2]。近年来,重大一直努力开发新的中药质量控制的分析方法。在所有的质量控制方法,色谱指纹图谱是一种普遍接受的技术对中药的质量评价。

色谱指纹,作为一个独特的模式显示在多个样品中化学成分的信息,可以提供更多的信息和准确评估复杂的矩阵,如中医。为了促进有效的指纹的中药质量控制方法,中国食品药品监督管理局(CFDA)建议所有相似的中药色谱应该评估(3),基于相关系数的计算和/或矢量角的余弦值(即。,指纹数据之间的一致性系数)4]。现在相似性评价作为关闭措施被广泛用于评估在实践中色谱指纹。然而,基于相关系数的相似性或矢量角的余弦是指纹的总体评价;是模糊的和不敏感的变化内容组件(5]。之间的相似性,色谱指纹不能充分表明亲密在组件的内容6),尤其是对含量低的组件。最近,一些特征化合物的高效液相色谱指纹图谱结合定量测定和验证了中药制剂的质量控制(7]。一个类似的结论是在结合的方法。虽然指纹样本共享一个满意的相似性,样本之间的一些化合物的内容仍可能出现(即有很大不同。,类似指纹并不意味着类似的组件内容)(8]。这可能表明之间的细微差别,相似的指纹可能意味着大不同数量的组件。目前尚不清楚指纹相似度的差异是否显著。如何评估指纹相似度的差异值得调查。为了确保中药的质量,尽可能多的成分的定量测定是非常必要的。但现在是不现实的识别和量化的所有化学成分中药等复杂的系统。因此,一个理性的战略评估的一致性指纹是十分必要的。

Xin-Ke-Shu (xk)平板电脑是一种最常用的平板电脑在中药治疗冠心病和脑血管病。这是一个非常复杂的矩阵,由五个药材或其提取物,包括Salviae Miltiorrhizae根和根状茎,国内外葛根lobatae基数,Crataegi果实,三七基数等根茎Aucklandiae基数。由于化学成分的高复杂性,xk平板电脑的质量评价是相当困难的工作。到目前为止相当多的方法已经开发(9]。在最近的工作中,我们开发了一种高效液相chromatography-diode阵列探测器(HPLC-DAD)方法multiconstituent量化的xk平板电脑,发现组件内容不同批次的xk平板电脑有巨大差异6]。

与最优化方法的发展,大量的数据处理工具被引入并应用于指纹色谱过程(10- - - - - -13]。在我们目前的研究中,色谱指纹结合最优化方法开发批量一致性评价xk平板电脑。首先,四种类型的指纹特征是使用了不同的模式相似性分析和比较。根据比较的结果,代表指纹被选中作进一步调查。然后,分层聚类分析应用于观察阶级差别是否发生在不同批次样品。如果实现指纹相似度高,但明显的阶级差别存在于样本,然后Mahalanobis距离分析来估计的概率水平明显不同样品。之间的关系相似度分析和距离也被讨论。随后,批次由Mahalanobis明显不同的指纹的距离,以及用于发现显著差异的山峰地区。虽然这些山峰发现以及基于峰值区域,结果理论上基于浓度相同。在理论上也提供了相应的解释。山顶有显著差异被高效液相色谱/——确定。最后,一个有用的策略的基础上,结合高效液相色谱指纹图谱和最优化方法提出了合理评价批次的一致性xk平板电脑也可以用于评估其他中药的批量一致性。

2。方法

2.1。材料和试剂

HPLC-grade乙腈和甲醇(甲醇)购买从默克公司(Merck,达姆施塔特,德国)。超纯水与Milli-Q净化系统(美国贝德福德微孔)。甲酸(高效液相色谱级)从Tedia公司购买Inc . (Tedia方式,费尔菲尔德,美国)。试剂级甲醇是购自天津Kemiou化学有限公司(天津)。为了包括尽可能多的样本来源的可变性,七十一批次生产的xk平板电脑提供的三年是很长一段时间在中国山东Wohua制药有限公司。所有的xk平板样品被保存在凉爽的房间在4°C和30%相对湿度包;贮存稳定性的xk平板电脑,物理和化学性质,验证。在凉爽的房间里,化学概要文件和主要化合物的浓度(我们决定6在xk平板电脑的主要化合物,细节这里没有显示)3年的xk平板是一致的。

2.2。制备样品的解决方案

外外套xk平板电脑被移除。所有的样品被研磨均匀大小。粉粉的100毫克为每个样本准确称重和超声提取5毫升70%甲醇为20分钟在室温下锥形烧瓶。这个示例解决方案(4毫升)被转移到10毫升离心管,离心10分钟的3000 rpm。上层清液进一步透过0.45μm膜过滤器在高效液相色谱注入。

2.3。仪表和色谱过程

一个安捷伦1200系列高效液相色谱系统(美国安捷伦公司,圣克拉拉,CA)与一个二极管阵列检测器(爸爸)被用来获得色谱和紫外光谱。所有的色谱分析进行Phenomenex C₁₈列(250毫米×4.6毫米身份证。5μ米)保护precolumn(12.5毫米×4.6毫米身份证。5μ米)相同的材料。流动相是由乙腈(A) (B)和0.1%甲酸水。溶剂梯度洗脱条件的8 - 12%在0-21 min (A), 12 - 17%在21-31 min (A), 17 - 38% (A)在31-55 min, 38 - 90%在55 - 65分钟(A),和90% (A)在65 - 75分钟,流速为1.0毫升·分钟⁻¹。preequilibration时期之间的10分钟是个体经营。紫外检测器被设定在278 nm处全谱扫描从190纳米到400纳米2 nm的一步。列温度维持在30°C,注入大量的示例解决方案都固定在10μl

安捷伦6310离子阱质谱仪(美国安捷伦公司,圣克拉拉,CA)是连接到高效液相色谱系统通过一个ESI接口。超纯氦(他)被用作碰撞气体,和纯氮(N₂)采用喷洒气体。高效液相色谱的仪器和色谱条件为质ⁿ用于HPLC-DAD分析水平是一样的。有趣的成分的识别指纹的xk平板电脑,下列条件的分析使用女士:负离子模式;毛细管电压3.5 kV;干燥气体流速12 L·分钟⁻¹;干燥气体温度350°C;喷雾器35 psi;质量分析器是范围50到1250阿姆河。所有的数据都使用数据分析处理6300系列离子阱LC / MS(版本3.4)。

2.4。不同类型的指纹

为了调查是否以不同的模式有不同类型的指纹特征的显著差异xk平板电脑样品,四种类型的指纹应用,包括单一波长指纹,3 d指纹,指纹,最大吸收波长和多波长指纹。中描述的四种类型的指纹是额外的文件1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2015/589654。

2.5。数据分析

HPLC-DAD 71批次的数据样本来自安捷伦ChemStation软件。软件“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004年版)推荐的CFDA(中国食品和药物管理局)是用于调整不同批次的指纹并同时计算样本之间的相似度。MATLAB 2009 b(数学,Inc .)、纳蒂克,妈,美国)用于处理色谱数据矩阵,计算Mahalanobis距离和实施分层聚类分析(HCA)主成分分析(PCA)和统计测试(例如,以及和测试)。

2.6。相似性分析

对相似度计算,一个向量的余弦角(经常使用);另一种是相关系数()。这两个和计算相似度评价的色谱指纹在不同批次的样品。

2.7。层次结构成分分析(HCA)

HCA的目标是找到一个最优分组之间的样本。HCA的结果通常显示在系统树图解释[14]。病房的方法被用于HCA由于相对强大的性能与其他方法相比15]。

2.8。Mahalanobis距离分析

Mahalanobis距离是一个距离测量的统计数据和考虑了相关变量在数据集16),也可以写成 在哪里,,是th样本均值向量(即。,the centroid of class), and the variance-covariance matrix of a class, respectively. According to Mahalanobis distance, the unknown samples can be classified as acceptable or unacceptable for the training set at a certain probability level [17,18]。在一定概率水平(关键值获得的)分布(17]。样本的距离Mahalanobis与临界值确定的样本相对于均值的差异训练集是很有意义的。95%置信水平在本研究选择。样品有一个概率水平的范围从1.0到0.05分为训练集的成员。样本有一个概率水平的范围从0.05到0是归类为一个异类。

3所示。结果

3.1。高效液相色谱指纹图谱方法的验证

因为单一波长指纹是经常使用在实践中,高效液相色谱指纹图谱方法的验证xk平板电脑的基础上执行这种类型的指纹。相同的示例解决方案运行六次获得精密高效液相色谱方法。常见的相对标准偏差(RSD)值峰值区域和共同峰的相对保留时间在0.6 - -3.5%和0.3 - -1.2%的范围,分别。重复性估计通过运行五个独立准备xk平板电脑样品,从相同的批,和相应的共同峰面积的相对标准偏差值和共同峰的相对保留时间低于1.8%和1.4%,分别。一个样品溶液在室温下放置3天用来进行稳定性试验。相应的共同峰面积的相对标准偏差值和共同峰的相对保留时间小于3.5%和2.3%,分别。验证的结果表明,开发的高效液相色谱指纹图谱方法是令人满意的,适用于样品的分析。

3.2。相似性分析不同类型的指纹

典型的指纹(单波长指纹)71批次的xk平板样品峰对齐后显示在图中1。

相似性分析来比较四种类型的指纹。每个样品的指纹图谱之间的相似性和标准指纹(即。,the mean fingerprint of 71 batches of samples) was shown in Additional File 2 (Supplementary Figures 1 and 2). There are no apparent differences found in similarity trend along with the sample distribution for different types of fingerprints. Although fingerprints are based on different characterization modes, the fingerprints of different batches of samples have a high similarity to the standard fingerprint (all above 0.94 based on或)。根据文献[19)值高于0.95意味着一个好的相似。除了最大波长指纹,其他三种类型的指纹被认为有很好的相似性为不同批次的样品。计算出的相似之处和为每个样本非常接近。的范围和分散的程度相似的基础上总结了四种类型的指纹在桌子上1。

根据表1,最大波长指纹范围和最大相似度的离散程度比其他三种类型的指纹。因为这种类型的指纹特征是数据的最大吸收波长,灵敏度相对较高。3 d指纹非常接近单一波长指纹在范围和分散程度的相似性。在四种类型的指纹,多波长指纹展品的最小范围和离散程度相似,由于很近multiactive成分分布在不同批次的样品。

到目前为止,单一波长指纹在实践中最常用。在这种类型的指纹,特定波长通常选择检测尽可能多的色谱峰。描述每个样本中都含有丰富的3 d指纹信息组件;然而,冗余信息也在场。此外,可怜的分辨率和不稳定的基线出现在某些波长,使后续的数据处理(如集成和峰对齐)费时,困难和复杂。多波长指纹特征可以有很好的反思组件但失去了一些有用的信息在其他成分。的最大波长指纹是一种令人满意的指纹,可以更好地反映样本之间的化学成分的差异。然而,它是不容易得到的最大吸光度指纹,因为有些复杂和耗时的数据处理方法或特殊ChemStations(如水域赋予ChemStation)应该是必要的。根据上述比较,单波长指纹似乎仍然最实用,受欢迎,而且操作方便指纹模式草药产品的质量评价。考虑到单一波长指纹指纹适用性和代表性,被选中作进一步调查。

3.3。层次聚类分析(HCA)

HCA被用来找到相对类似集群71批次的样品。图2显示了HCA的系统树图。

总的来说,系统树图显示两个明显的集群,这表明有明显的阶级差异在不同批次的xk平板样品。虽然高样本之间的相似性(补充图2)收购,阶级差异似乎是重要的。

3.4。Mahalanobis距离分析

为了确定是否批xk平板样本之间的差异具有统计学意义,而距离法。Mahalanobis距离的计算,参考类应该首先构造。质量好的样品应该引用类的候选人。在我们的研究中,样品有较大的峰值区域的指纹被选为参考类的成员由于大峰面积通常表明高组件的内容。

示例5第一次被选为参考示例开发引用类的,因为大多数峰地区样本5指纹更大比其他批次的样品。其他批次的样品和样品之间的欧式距离5然后计算评价样本亲密。参考类是由选择最近的10批样品加样5;因此,11个样本参与的引用类根据需求文档对指纹的发展。指纹样本的均值参考类也计算参考指纹。关于引用类的重心,Mahalanobis距离及其概率水平的参考类归纳在表格中的每个样本2。

研究结果表明,所有样品指纹引用类的无意义的差异比参考指纹。

之间的距离Mahalanobis指纹其他批次的样品和参考指纹也计算并显示在图3。在指纹识别的差异测试的意义(17]。

有19个批次的样品有显著差异对引用类的重心由Mahalanobis距离,表明他们的指纹可能相对于参考指纹峰地区的巨大差异。

探索之间的关系相似(这两个向量的余弦角和相关系数)和Mahalanobis距离、相似,Mahalanobis距离,每一批的概率和相应的指纹相对于参考指纹如图4。

一般来说,相似度越高,越小的距离。之间的关系相似,而距离似乎模糊(见图4)。然而,尽管一些样品的指纹(如样品9、15和20日和他们和都是0.99以上)参考指纹相似度高,相应的Mahalanobis距离仍然较大,导致显著差异()。Nonconsistent研究结果发现在评价亲密的相似性和距离。注意到更高的相似性不完全显示小Mahalanobis距离,而较低的相似性表明较大的差异而距离。

根据(1),Mahalanobis距离实际上是基于指纹峰地区之间的差异。为或,虽然色谱峰区域相似性计算,使用相似度表示测量的整体形状比较亲密的指纹档案。当两个高效液相色谱指纹图谱的形状非常接近,可以获得高相似性即使峰值区域指纹相比有很大的不同(例如,峰地区差异很大,不同的注入量在不同的指纹,但仍然很高的相似之处由于接近形状的指纹档案)。如果峰面积的差异非常大,可以显著影响的形状相比,指纹,指纹之间的相似性将相应地改变。

因此,Mahalanobis距离以峰面积的差异考虑在内,而相似性强调的整体形状指纹档案。在某些情况下,尽管一些批次的指纹显示引用的高度相似性,指纹,峰地区的分歧仍然重要的基于距离。因此,Mahalanobis距离可以反映样品的批次之间的矛盾相对比相似,和相应的概率水平也估计来评估是否指纹之间的矛盾是重要的。

3.5。识别和确定峰值明显不同

色谱峰的高效液相色谱指纹图谱用于描述组件在一个样本。峰面积与内容相关联的组件。如果峰面积大的差异在不同批次的样品,质量一致性将会强烈影响。因此,是非常必要找到显著不同的山峰批次的指纹。Mahalanobis距离是用来检测是否有显著差异之间的样品指纹和指纹的引用。然而,它是不容易找到指纹的明显不同的山峰在样品的距离。在我们的研究中,以及采用检测峰值显著差异。因为常见的山峰是不同批次的共同特征,不同地区常见的山峰质量一致性将有很大的影响。此外,对于每一个样品的指纹,常见的峰值区域也占总峰面积的81%以上。因此,只有共同的山峰被确定以及为显著不同批次由距离。应该更多的关注显著不同的常见的山峰xk片的质量控制。

参考类可以被视为训练集,执行以及在样本指纹峰,变量计算根据 在哪里指的是th色谱峰面积的指纹样本,和和平均峰面积和峰相应的标准差的指纹样本训练集(即。,分别引用类)。的计算了(17] 在哪里在训练集样本的数量(在目前的研究)。

的是相对于给学生的分布确定之间的区别和是重要的。尽管如此,以及与色谱峰面积计算,结果间接表示组件内容的差异不同批次的样品,因为,在线性范围,色谱峰面积所表达的 在哪里和指的是色谱峰的峰面积及其相应的浓度(或内容),分别。和表示响应因子和拦截的校准曲线,分别。然后,(2)结合(4)可以写成 在哪里和内容和标准偏差的平均值来表示th组件引用类的样品的浓度。所以,根据(5)的价值基于峰面积相同的峰值,基于组件的内容。

图5显示了的常见的高峰值19明显不同批次的样品由距离分析。

19个批次的样品中,最常见的峰被显著的地区差异以及小的峰值区域,这表明这些组件的数量可能会低于平均内容相应的组件的引用类的样本。

图6显示的频率比例共同山峰基于明显不同以及与19个批次的样品。结果清楚地揭示了常见的山峰13和19个百分比最高的频率发生在19批次的样品。

组件与常见的峰值对应的高频比例可能在数量上的巨大差异。这些常见的峰值会强烈影响批质量的一致性。高效液相色谱/,是用来确认其中7人(峰值13,15,16,19,20.,26日,和29日),高频比例显示在图6和标记在图1。在ESI -实验中,每个峰的分子量和能获得一些片段。在负离子ESI模式下,峰值检测根据deprotonated分子((mh)⁻和/或[mh + HCOOH]⁻)。除了高峰26被确认为lithospermic酸(根据保留时间、紫外光谱,和它的数据与文献[女士20.),其他六个有趣的山峰就像isoflavonoids初步确认。isoflavonoids诊断离子损失162 Da和分子量120 Da,有关O -和C-glycoside异黄酮(21,22),分别。山峰的可能结构13,15,16,19,20.,26日,和29日特征基于他们的保留时间、紫外光谱,女士和他们的数据与文献相比。使用峰值15作为一个例子,(mh)的分散⁻离子在445年产品离子325 [m - h - 120]⁻297 (m - h - 120有限公司)⁻,282 [m - h - 120 - co - ch₃]⁻,这表明,峰值15哟₃集团在糖苷配基骨架和中性损失120 Da C-glycosides的特征。与文献[23),峰值15被确认为3′-methoxypuerarin。更多的信息关于这些七峰及其结构如表所示3和图7,分别。

根据结果,女士lithospermic酸和六isoflavonoids特征标记可能有强烈的贡献批xk平板样品的不一致。isoflavonoids的主要活性成分国内外葛根lobatae基数,这表明国内外葛根lobatae基数可能大幅波动xk平板电脑的生产。因此,为了提高不同批次的一致性的xk平板电脑,更要注意质量国内外葛根lobatae基数,包括选择优质的原材料,制造技术的进步,加强过程控制水平。

找到一个理性的方式来评估不同批次的一致性的xk平板电脑样品,初步提出策略(见图8)。

4所示。结论

的有用的策略,提出了解决常规问题中存在的一致性评价的色谱指纹xk平板样品。虽然高相似性发生在一些批次的样品,样品之间的显著差异仍有可能发现的距离。色谱峰的峰地区的显著差异所决定的以及可以显示相应的成分有显著差异内容,导致影响质量的一致性。我们的研究表明,提出的策略的基础上,结合高效液相色谱指纹和最优化方法将提供一个有用的方法来评估质量的一致性xk平板电脑。这一战略将是一个实用的参考其他中药制剂。

利益冲突

本文的作者宣称他们没有利益冲突。

作者的贡献

王裴和雷聂相等贡献者co-first作者。

确认

作者承认金融支持山东省重大新药发展的产业化项目(没有。2012 cx20203)和山东省自然科学基金(没有。ZR2011HM080)。他们感谢亚伦Yerke先生从北卡农业技术州立大学为他出色的援助在论文的准备。

补充材料

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