黄芪阴阳活组骨肉瘤有效成分含量测定及其对骨肉瘤hTERT和Bcl-2蛋白的影响

摘要

筛选黄芪阴阳活组(Huangqi Yinyanghuo group, HYG)有效成分的最佳提取工艺及含量测定，研究HYG对骨肉瘤(osteosarcoma, HOS)细胞端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcripase, hTERT)和Bcl-2蛋白的影响，为HYG治疗骨肉瘤的临床应用提供理论依据。正交设计表L₉（4^3.以淫羊藿苷为考察指标，优化淫羊藿苷的提取工艺。0.125 0.25 0.5 12 4和8μmol/L HYG分别作用于对数生长期骨肉瘤HOS细胞，采用CCK-8法检测细胞活力，免疫组化SP法检测hTERT和Bcl-2蛋白表达。细胞凋亡率与HYG剂量呈正相关，hTERT和Bcl-2蛋白的表达随着作用时间的延长而显著降低。在HYG作用下，剂量与骨肉瘤细胞存活率呈负相关;骨肉瘤细胞存活率与hTERT、Bcl-2蛋白呈正相关;作用时间与hTERT、Bcl-2蛋白呈负相关;hTERT与Bcl-2蛋白呈同步关系。

1.介绍

黄芪和阴阳火都是养生中药。黄芪能补气，阴阳火能养阳;两者在中医临床常用来治疗气虚、阳虚等疾病。它们还能促进成骨细胞功能，增加骨骼钙化，促进骨髓细胞DNA合成;体外实验表明，阴阳火能促进成骨细胞增殖分化[1]。黄芪阴阳活组(HYG)是临床广泛应用的中药[2，3.]。

端粒酶在肿瘤细胞的发生发展中起着重要的作用。超过90%的肿瘤细胞具有端粒酶活性，而大多数体细胞缺乏或甚至没有端粒酶活性[4]。端粒酶合成端粒DNA重复序列的反向转录的RNA为模板,并将它们添加到端粒结束,为了弥补终端基地失去由于细胞分裂和确保染色体的稳定性和完整性,从而提供永生的肿瘤细胞的基础。hTERT是其限速成分，hTERT基因的表达对端粒酶的表达起决定性作用，Bcl-2基因(即b细胞淋巴瘤/白血病-2基因)是一种能够抑制凋亡的原癌基因。hTERT和Bcl-2蛋白都是很好的肿瘤治疗靶点。

本实验通过研究HYG对骨肉瘤细胞hTERT和Bcl-2蛋白的影响，为临床应用HYG治疗骨肉瘤提供理论依据。

2.仪器和药品

2．1．仪器

安捷伦1100系列HPLC系统;KQ-300超声波清洗机南京昆山超声波仪器有限公司

2．2．药物

黄芪、阴阳火药材(本复方中两药比例为1:1)购自广州克来门特药业公司，经广州科学院植物研究所鉴定为黄芪、阴阳火的干根黄芪(费)。var。mongholicus(。)萧氏家族的豆科和淫羊藿brevicornum的格言。小檗科的。淫羊藿苷对照品(批号130526-152369)购自广州市生物制品检测研究所;所用水为双蒸馏水，检测试剂均为HPLC级，其他试剂均为化学级。

人骨肉瘤细胞株(HOS和CCK8)购自南京鼎盛生物科技有限公司。胎牛血清(HyClone)购于北京赛奥瑞特生化制品有限公司。Bcl-2抗体、DAB显色试剂试剂盒、免疫组化染色试剂盒(SP试剂盒)均购自成都恒源生物工程有限公司。

3.方法

3．1.正交试验设计

对4个因素进行了3个水平的调查:加水量()、浸泡时间()，提取时间()，提取次数()的正交设计表L₉（3⁴)，以淫羊藿苷为指示剂。见表1．

4.淫羊藿苷含量的测定

4.1。色谱条件

色谱柱为Hypersil ODS2 (4.6 mm × 250 mm, 5μm)，流动相为甲醇-0.38%磷酸溶液(48:52)，流速为1.0 mL/min，检测波长为270 nm，柱温为40℃，进样量为10μL.淫羊藿苷保留时间为10.2 min。在这些条件下，样品可以相对分离得较好。

4．2．测试溶液的制备

准确称量淫羊藿苷标准品，加入70%甲醇溶液中，制得0.01 mg/mL淫羊藿苷标准溶液;过滤后,2.00毫升的滤液正是,放置在一个50毫升瓶,添加到40毫升70%甲醇溶液,ultrasonicated 10分钟,允许在室温下冷却,站,然后稀释到马克的70%甲醇溶液,摇晃均匀,过滤为0.45μM膜，收集后续滤液作为试验液。

4．3．标准曲线绘制

取参比溶液，配制成浓度为0.010、0.020、0.050、0.100、0.200、0.500的溶液μg / mL,分别;10μ取溶液的L，测量其峰面积;以峰值面积为纵坐标绘制标准曲线(Y)，横坐标为淫羊藿苷浓度(X)，计算回归方程为，．结果表明，淫羊藿苷的浓度在0.01~0.50范围内与峰面积呈良好的线性关系μg / mL;参见图1．

4．4.精度测试

10μ准确绘制参比溶液的L，平行进样5次，测定淫羊藿苷的峰面积值，计算出RSD值为1.52%，仪器精密度好。

4．5.稳定性试验

按照试液制备方法制备试液，分别静置0、2、4、8、12 h后进样，测定淫羊藿苷峰面积，RSD值为2.50%，表明该试液在12 h内具有良好的稳定性。

4.6。再现性测试

按照试验溶液制备方法制备试验溶液，一式五份，测量峰面积;测定结果的RSD为1.83%，重现性良好。

4.7。样品恢复测试

取已知浓度的样品约0.20 g，以五倍计重，放入有塞的Erlenmeyer烧瓶中，准确地加入2ml 0.198 mg/mL淫羊藿苷溶液，稀释乙醇中，按样品测定方法测定峰面积，测定含量。平均加样回收率为100.5%，RSD为1.72%。

4.8。正交试验

按正交设计表L提取药材₉（3⁴)，组合提取液，取适量提取液，按“标绘标准曲线”法测定提取液中淫羊藿苷的含量;结果与分析见表2和3.．

根据表中的结果可以判断2考察了各因素对淫羊藿苷提取的影响程度在降序排列;最佳提取工艺为，即以质量比1:1，在清气阴阳活药材中加入12倍体积的水，浸泡15 min，提取3次，每次1.0 h;然后将残渣丢弃，将煎液混合，得到提取物。从表中可以看出3.,因素对淫羊藿苷的提取有显著影响，而影响淫羊藿苷提取的因素,在调查范围内影响较小，无统计学意义。

4.9。验证测试

对上述筛选的最佳提取工艺进行了验证，验证结果如表所示4．根据表中的结果4，提取物中淫羊藿苷的平均含量为69.07μG，高于任何测试次数的含量，且没有较大的偏差。

4.10。细胞培养

细胞在37℃，5% CO的培养箱中传代₂、饱和湿度;传代培养基为10%胎牛血清和100/mL双抗体含高糖DMEM(含酚红)。

4.11。CCK-8检测细胞增殖

细胞按5 × 10播种于96孔板^3.细胞每口井。培养24 h后，每孔分别填充200μL，最终浓度为0.125,0.25,0.5,1,2,4,8μmol / L;同时，成立非药物治疗小组;孵育后在培养箱中继续孵育24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，每孔填满20μL的CCK-8溶液，在培养箱中再孵育4 h。用ELISA仪在490 nm波长下测定各孔的吸光度;显微镜下观察细胞形态并拍照。以时间为横轴，以吸光度为纵轴绘制细胞生长曲线。计算存活率(SF): SF(%) =(实验组OD值/对照组OD值)× 100%。实验平行重复三次;最后按SF均值±标准差绘制时间-生存曲线三个样品。2.7免疫组化检测hTERT、Bcl-2蛋白表达。

细胞按4 × 10播种于24孔板⁵每孔设2个实验组，每组3个平行样品;同时，建立了对照组。培养24 h后，每孔填入含最佳HYG浓度的培养基1 mL，分别培养3 d和5 d。采用链霉亲和素过氧化物酶(SP)法。细胞常规固定并染色，在10倍倒置显微镜下选择具有相应形态特征的细胞拍照。采用Image J和Image Pro Plus软件对免疫组化图像进行半定量分析。

4.12。统计分析

统计处理:采用SPSS软件进行统计处理。数据表示为，组间比较采用t -检验，相关分析采用配对卡方检验;被认为具有统计学意义。

5.结果

5．1.HYG作用后的细胞存活

细胞生存曲线描述了骨肉瘤细胞在不同剂量和时间下的生存状态;参见图1．从图中可以看出2，随着时间的推移，HOS骨肉瘤细胞的存活率明显降低，晚期细胞无明显增殖。相关分析显示，细胞存活率与药物剂量呈负相关()。光镜下HYG处理后的骨肉瘤与未处理的骨肉瘤细胞形态变化如图所示3.．

5.2。hTERT和Bcl-2蛋白检测

免疫组化图像采用Image Pro Plus软件进行分析;结果显示，每幅图像的灰度值逐渐增加，这表明每幅图像的蛋白质含量逐渐减少。数据显示实验组hTERT、Bcl-2蛋白表达明显低于对照组，表达强度与时间呈负相关(图)4和表5)。

采用Image J软件对免疫组化图像进行阳性细胞计数;阳性细胞数越高，表达hTERT和Bcl-2蛋白的细胞越多，也说明hTERT和Bcl-2蛋白表达的细胞分布广泛，反之亦然。经配对卡方检验，差异显著()(表6)。

5.3。hTERT与Bcl-2蛋白表达的关系

配对卡方检验发现hTERT和Bcl-2蛋白表达具有高度的一致性和显著的相关性()。

6.讨论

6.1。调查指标的选择

淫羊藿苷是阴阳火的主要活性成分之一;药理研究表明淫羊藿苷具有多种药理活性，如抗肿瘤、增强免疫、改善心血管功能和调节内分泌[5]。许多以阴阳火为主药的中药制剂[6，7]以淫羊藿苷为调查指标;因此，选择淫羊藿苷作为本研究提取工艺筛选的考察指标是可行的、合理的。

6.2。色谱条件的选择

参考文献，笔者也尝试选择不同的流动相，乙腈-水[8]、甲醇-醋酸[9]、甲醇-水-冰醋酸[10]等，导致淫羊藿苷峰位置分离效果较差，并受到其他小峰的干扰;在甲醇-0.38%磷酸溶液(48:52)中，淫羊藿苷峰与其他杂质峰分离良好，无干扰峰。

本实验通过对hTERT和Bcl-2蛋白之间诸多行为关系的了解，旨在了解HYG对骨肉瘤细胞中hTERT和Bcl-2蛋白的影响及其可能的相关性;同时，为HYG的临床应用提供了理论依据。

骨肉瘤(骨原性肉瘤)是最常见的恶性骨肿瘤。典型的骨肉瘤通常发生在10-20岁年龄组;然而，它可能发生在任何年龄组，包括婴儿期、儿童期和老年期。男性的发病率高于女性，男女比例约为2:1。骨肉瘤具有较强的局部浸润和肺转移能力。手术治疗大大改善了患者的预后，但致残率仍然很高。

端粒酶在90%的癌细胞中表达非常高，而在正常细胞中很少表达;它是公认的抗癌靶点[11]。hTERT是端粒酶的限速酶[12，它调节端粒酶的活性[13与端粒酶活性有平行关系[14，15]。目前，许多学者将目光转向了hTERT，希望在治疗癌症方面取得突破[16]。Bcl-2基因是人们关注的焦点;已经有很多报道Bcl-2蛋白可以保护细胞免于凋亡，增加hTERT的表达[17- - - - - -19]，但也有一些实验证明Bcl-2蛋白与hTERT不相关，甚至呈负相关[20.，21]。

本研究发现，光镜下未处理的骨肉瘤细胞以短梭形为主，排列紧密，核大，核分裂常见，细胞致密时呈多层生长。HYG处理后，细胞形态发生明显变化，细胞以多边形为主，呈单层排列，细胞大小趋于均匀，细胞核小，染色深;这些结果表明了形态分化和变化的发生。随着药物浓度的增加，骨肉瘤细胞凋亡明显增加;随着药物作用时间的延长，细胞凋亡也明显增加。在最佳浓度作用下，以时间为轴，对照组hTERT、Bcl-2蛋白表达无明显变化;实验组第3天和第5天，hTERT、Bcl-2蛋白表达逐渐减弱，且与药物作用时间呈负相关，与相关报道一致[22，23];两者与药物呈时间依赖性关系，在表达方面表现出高度的一致性。

研究结果表明，HYG和hTERT之间存在时间依赖性，但不能证实HYG能够直接影响端粒酶活性;Bcl-2蛋白与hTERT蛋白之间存在高度的一致性，但两者之间是否存在互补性有待进一步研究;由于在部分正常组织中发现端粒酶活性，HYG是否对其有毒副作用还需进一步研究;hTERT和Bcl-2基因蛋白表达的非完全定量测定也可能出现假阳性和假阴性结果;肿瘤细胞处于低pH状态[24]，但本实验肿瘤细胞处于pH为7.2-7.4的状态，不能充分反映体内恶性肿瘤组织的低pH状态。以上问题需要进一步论证。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

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